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1、HPLC法高效液相色谱法 High performance liquid High performance liquid chromatography(HPLC)chromatography(HPLC)v了解HPLC色谱仪的构成v熟悉HPLC法分类及方法v掌握HPLC法的定义、特点v掌握HPLC法实验条件的选择v掌握HPLC法的定量分析方法教学大纲 用用高压输液泵高压输液泵将规定的将规定的流动相流动相泵入装泵入装有填充剂的有填充剂的色谱柱色谱柱进行分离测定的色谱方进行分离测定的色谱方法。注入法。注入进样阀进样阀的供试品，由流动相带入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入柱内
2、，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器检测器，由，由数据处理系统数据处理系统记录色谱信号。记录色谱信号。HPLC法的定义、特点 一、定义 二、特点1.1.适适用用范范围围广广（可分析80%有机化合物）2.2.分离性能好分离性能好3.3.分析速度快分析速度快4.4.灵敏度高灵敏度高5.5.色谱柱可反复使用色谱柱可反复使用6.6.流出组分容易收集流出组分容易收集2006 Baidu 免责声明 与百度对话 HPLC实验条件的选择1.HPLC前处理2.色谱柱的选择3.流动相的选择4.洗脱方式的选择5.检测器的选择HPLC前处理1.流动相的处理2.样品的处理流动相的处理1.溶剂的纯化2.流动相脱气3.过
3、滤4.色谱纯试剂5.重蒸水流动相的处理过滤：除去固体微粒亲水、亲脂、两用；亲水、亲脂、两用；0.45m流动相的处理流动相脱气n脱气：除去流动相中的空气n方法：超声波振荡脱气、惰性气体鼓泡吹扫脱气、抽真空、加热脱气、在线脱气系统样品的处理n除去杂质、纯化样品n浓缩样品或进行衍生化n过滤HPLC前处理n样品的处理 供试品溶液的制备提取纯化浓缩or衍生化HPLC样品处方剂型待测成分的理化性质干扰成分的理化性质色谱柱的选择 n根据被分离物质的化学结构、极性和溶解度用途：制备型、用途：制备型、分析型分析型2-4.6mm;10-25cm色谱柱的长度与分离效果n正相色谱柱：固定相极性大于流动相，一般指硅胶柱
4、，以正己烷系列为流动相。正相色谱法n主要用于分离分析能溶于有机溶剂的极性及中等极性分子型物质色谱柱的分类 n反相色谱柱：固定相极性小于流动相，其技术就是在硅胶基质上键合有机碳链。一般指C18、C8、苯基柱等，以甲醇、乙腈、水为流动相。反相色谱法n适用于非极性及中等极性化合物n目前用的最多的色谱柱是反相键合相色谱柱 最常用：（octadecylsilane)ODS柱/C18（十八烷基键合相）色谱柱的分类 键合相的优点使用过程不流失化学性能稳定，在PH2-8的溶液中不变质热稳定性好，一般在70以下稳定载样量比硅胶约大一个数量级适于作梯度洗脱n 避免压力和温度的急剧变化和任何机械震动避免压力和温度的
5、急剧变化和任何机械震动n样样品品要要进进行行预预处处理理；在在分分析析柱柱前前安安装装保保护护柱柱（如如分分析析柱柱是是键键合合硅硅胶胶，预预柱柱为为硅硅胶胶，可可使使流流动动相相在在进进入入分分析析柱之前预先被硅胶柱之前预先被硅胶“饱和饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解），避免分析柱中的硅胶基质被溶解）n流动相要适宜，不能对固定相产生破坏流动相要适宜，不能对固定相产生破坏n注意色谱柱的注意色谱柱的pHpH使用范围、耐压限度使用范围、耐压限度n注注意意色色谱谱柱柱的的方方向向性性，色色谱谱柱柱不不能能反反冲冲（除除非非指明）指明）色谱柱的使用和维护n每每次次色色谱谱分分析析完完成成后后，要要
6、及及时时对对色色谱谱柱柱进进行冲洗行冲洗n保保存存色色谱谱柱柱在在合合适适的的溶溶剂剂中中（应应将将柱柱内内充充满满乙乙腈腈或或甲甲醇醇，柱柱接接头头要要拧拧紧紧，防防止止溶溶剂剂挥挥发发干干燥燥。绝绝对对禁禁止止将将缓缓冲冲溶溶液液留留在在柱柱内内静静置置过过夜夜或或更更长长时时间。）间。）色谱柱的使用和维护流动相的选择n固定相一定时，流动相的种类、配比、pH值及添加剂等能显著影响分离效果，HPLC中流动相的选择至关重要。对流动相的基本要求不与固定相发生化学反应对样品有适宜的溶解度 要求容量因子k在25(最佳)或110(可用)k值太小，不利于分离；k值太大，可能使样品在流动相中沉淀必须与检测
7、器相适应 例如用紫外检测器时避免末端吸收粘度小容量因子容量因子(capacity factory):也称为分配容量（也称为分配容量（partition volume）、）、容量比（容量比（capacity ratio），是在达到分配平衡后，组分在固定相），是在达到分配平衡后，组分在固定相中的量与流动相中的量之比。也称为质量分配系数。中的量与流动相中的量之比。也称为质量分配系数。流动相的选择n反相键合相色谱n正相键合相色谱n反相离子对色谱键合相色谱法：化学键合相为固定相的色谱法，分离机制以分配作用为主，对不封尾的键合相还有一定的吸附作用。应用最广泛的色谱法 用化学反应将键用化学反应将键合相的载体
8、硅胶合相的载体硅胶的残存硅醇基去的残存硅醇基去掉的方法，称为掉的方法，称为封尾或遮盖封尾或遮盖（end-capping）,形成形成的键合相称为封的键合相称为封尾键合相尾键合相。反相键合相色谱流动相的选择 1.1.部分含水溶剂部分含水溶剂：水为基础溶剂，再加入可水为基础溶剂，再加入可与水互溶的有机极性调节剂（如甲醇、乙腈、与水互溶的有机极性调节剂（如甲醇、乙腈、四氢呋喃）四氢呋喃）适用于适用于分离中等极性、弱极性药物分离中等极性、弱极性药物 常用甲醇水、乙腈水系统常用甲醇水、乙腈水系统 有机极性调节剂的性质及其与水的比例对保留值和分有机极性调节剂的性质及其与水的比例对保留值和分离选择性有影响离选
9、择性有影响反相键合相色谱流动相的选择 2.2.缓冲溶液缓冲溶液常用的缓冲液：常用的缓冲液：三乙胺磷酸盐、磷酸盐、醋酸三乙胺磷酸盐、磷酸盐、醋酸盐溶液。盐溶液。适用于适用于可溶于水并具可解离特性的化合物，如可溶于水并具可解离特性的化合物，如蛋白质及弱酸、弱碱类化合物蛋白质及弱酸、弱碱类化合物。缓冲液及缓冲液及PH不同、及所占比例不同会影响组不同、及所占比例不同会影响组分的保留值分的保留值注意 由于C18链在水相环境中不易保持伸缩状态，故对于C18为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定反相键合相色谱流动相的选择
10、3.3.非水溶剂非水溶剂流动相为流动相为不含水系统不含水系统。用于分离用于分离疏水性物质疏水性物质。在乙腈及甲醇中加入二氯甲烷或四氢呋喃。这在乙腈及甲醇中加入二氯甲烷或四氢呋喃。这种色谱法称为种色谱法称为非水反相色谱法非水反相色谱法。正相键合相色谱流动相的选择 流动相采用流动相采用饱和烷烃（如正己烷）中饱和烷烃（如正己烷）中加入极性较大的溶剂为极性调节剂（如异加入极性较大的溶剂为极性调节剂（如异丙醚），丙醚），通过调节极性调节剂的浓度来改通过调节极性调节剂的浓度来改变溶剂强度。变溶剂强度。反相离子对色谱流动相的选择是是极性较强的水系统混合溶剂极性较强的水系统混合溶剂最常用的是甲醇水、乙腈水中加
11、入最常用的是甲醇水、乙腈水中加入0.003-0.01mol/L的离子对试剂的离子对试剂离子对试剂的离子对试剂的性质、浓度、流动相的性质、浓度、流动相的PH及流及流动相中有机溶剂的性质和比例动相中有机溶剂的性质和比例都会影响组分的都会影响组分的保留值和分离效果保留值和分离效果洗脱方式的选择等度洗脱等度洗脱梯度洗脱梯度洗脱1洗脱的类型v等度洗脱 在一个分析周期内流动相的组成保持恒定 适合于组分数目较少、性质差别不大的样品洗脱方式的选择葛根芩连汤中葛根素的含量流动相:甲醇：乙腈：水(12880)流速:1.0 mL/min 柱温:室温1、洗脱的类v 梯度洗脱 在一个分析周期中，程序控制流动相的组成改变
12、（如溶剂的极性、离子强度、pH值等），使每个组分都在适宜的条件下获得分离。适合于组分数目较多、组分间k值相差较大（10-100倍）的复杂混合物洗脱方式的选择v优点 缩缩短短分分析析时时间间，提提高高分分离离度度，改改善善峰峰形形。使使峰峰变变尖尖锐锐，使使微微量量组组分分容容易易被被检检出出，提提高高检检测测灵灵敏度敏度v缺点 常常会引起基线漂移，重现性较等度洗脱差常常会引起基线漂移，重现性较等度洗脱差2、梯度洗脱的特点梯度洗脱的特点标准品标准品样品样品HPLCHPLC梯度洗脱条件梯度洗脱条件 1.1.要要注注意意溶溶剂剂的的互互溶溶性性，不不相相混混容容的的溶溶剂剂不不能能用用作作梯梯度度洗
13、脱的流动相洗脱的流动相2.2.所用的溶剂纯度要求更高，以保证好的重现性所用的溶剂纯度要求更高，以保证好的重现性3.3.混合溶剂的粘度常随组成而变化混合溶剂的粘度常随组成而变化4.4.每每次次梯梯度度洗洗脱脱之之后后必必须须对对色色谱谱柱柱进进行行再再生生处处理理，使使其其恢恢复复到到初初始始状状态态。需需让让10-3010-30倍倍柱柱容容积积的的初初始始流流动动相相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡2、梯度洗脱的特点梯度洗脱需注意内容检测器的选择 分分 类类浓度型浓度型：响应与流动相中组分的浓度有关响应与流动相中组分的浓度有关 质量型质量
14、型：响应与单位时间内通过检测器的组分的量有关 按检测原理按检测原理通用型通用型：对溶剂和溶质组分均有反应 专属型专属型：只能检测某些组分的某一性质 按测量性质按测量性质1.紫外检测器（ultraviolet detector;UV)2.荧光检测器（fluorophtometric detector;FD)3.蒸发光散射检测器（evaporative light scattering detector;ELSD)4.电化学检测器（electrochemical detector；ECD)5.示差折光检测器（differential refractive index detector；DRID）6
15、.化学发光检测器（chemiluminescence detector;CLD)7.质谱检测器(mass spectrometry detector;MSD)检测器的选择1 1.优点优点n灵敏度高，最低检出量可达灵敏度高，最低检出量可达1010-7-71010-12-12 g g n不破坏样品，可用于制备不破坏样品，可用于制备 n对温度及流动相波动不敏感，可用于梯度洗脱对温度及流动相波动不敏感，可用于梯度洗脱紫外检测器（最普遍）2.2.缺点缺点n只只能能检检测测具具有有紫紫外外吸吸收收或或衍衍生生物物具具有有紫紫外外吸吸收收的的 物质物质n流动相的流动相的截止波长必须截止波长必须小于检测波长小
16、于检测波长将被测溶剂装入1cm光径的吸收池，以空气为参比，改变照射波长，溶剂的吸收度A1时的波长称为截至波长水水;甲醇；乙腈：甲醇；乙腈：210nm;210nm;紫外检测器（最普遍）3.3.种类种类可变波长紫外检测器（可变波长紫外检测器（UVDUVD）配制最多）配制最多光源 光源光源 单色器单色器流通池流通池 光电管光电管光光电电二二极极管管阵阵列列检检测测器器 （photodiode photodiode array array detector;PDADdetector;PDAD或或DADDAD）光源光源流通池流通池单色器单色器光光电电二二级级管管阵列阵列紫外检测器（最普遍）n 特点特点
17、可可以以快快速速扫扫描描被被测测组组分分的的的的紫紫外外可可见见吸吸收收光光谱谱。可可以同时获得样品的以同时获得样品的色谱图色谱图及每个组分的及每个组分的吸收光谱吸收光谱。n特殊功能特殊功能 a a、色谱峰的准确定性、色谱峰的准确定性 b b、峰纯度检验、峰纯度检验 c c、多通道检测、多通道检测 d d、峰抑制、峰抑制 e e、宽谱带检测、宽谱带检测 f f、选择最佳波长、选择最佳波长光电二极管阵列检测器a a、色谱峰的准确定性、色谱峰的准确定性 先取得该峰的光谱图,再与标准样品的光谱图进行比较,若两个光谱完全重合,说明是同一种物质;若不重合,说明是不同种物质。光电二极管阵列检测器光电二极管
18、阵列检测器b b、峰纯度检验、峰纯度检验 在色谱分析中,通常利用吸收比确定峰的纯度。二极管阵列检测器既可使用吸收比的方法,又可使用比较光谱的方法。在峰的前沿、后沿和最大值处各取一点,扫出这三点的光谱图进行比较,若三个光谱图完全重合,说明是纯峰(只含一种物质),若不完全重合,说明峰中含有杂质。对于任何在紫外-可见光区有吸收的纯物质在两个选定波长下的吸收比为一常数，且与浓度无关d d、峰抑制、峰抑制 如果两种化合物没有完全分离,但它们的光谱图有很大差别,就可以通过选择合适的测量波长、参考波长和带宽,使一种化合物被完全抑制。光电二极管阵列检测器1.1.优点优点l灵敏度极高，比紫外检测器高一个数量级灵
19、敏度极高，比紫外检测器高一个数量级l良好的选择性良好的选择性l线性范围较宽线性范围较宽l受外界条件影响较小受外界条件影响较小l只只要要选选作作流流动动相相的的溶溶剂剂不不发发荧荧光光，荧荧光光检检测测器器就就能能用用于于梯梯度洗脱度洗脱l高灵敏度和高选择性，适于体内药物分析高灵敏度和高选择性，适于体内药物分析荧光检测器2.缺点n只适于检测能产生荧光或衍生物能产生荧光的物质。n应用不如紫外检测器广n流动相不能含有荧光物质或使荧光熄灭的物质应用：氨基酸、多环芳烃、甾体化合物、酶应用：氨基酸、多环芳烃、甾体化合物、酶荧光检测器柱后溶剂流柱后溶剂流（携带组分）（携带组分）雾化器雾化器蒸发器蒸发器高速载
20、气流高速载气流流动相蒸发流动相蒸发光散射室光散射室溶剂流雾化溶剂流雾化不不挥挥发发组组分分的的雾雾状颗粒使光散射状颗粒使光散射光源光源检检测测蒸发光散射检测器 色谱柱后流出液（流动相+组分）先引入已通气体（常用高纯氮或空气）的雾化器，流出物与通入的气体形成均匀的微小液滴，经过蒸发器（漂移管）加热，蒸发除去流动相，而样品组分在蒸发器内形成气溶胶，然后进入检测室。用强光或激光照射气溶胶而产生光散射（丁铎尔效应），用光电二级管检测散射光强度，从而获得组分的浓度信号。n散射光强度的对数与组分质量的对数成线性关系。蒸发光散射检测器1.优点n通用型检测器。对各种物质几乎都有响应灵敏度比示差折光检测器高n流
21、动相系统温度变化影响不敏感n可进行梯度洗脱n没有流动相的紫外吸收干扰蒸发光散射检测器2.缺点n分析范围受样品组分和流动相挥发性的限制n流动相中如含缓冲溶液，缓冲溶液必须受到限制：必须是挥发性，并且浓度应尽可能低，不能用含缓冲盐的流动相。通常选用的缓冲溶液有：甲酸、乙酸、三氟乙酸等n是一种破坏型检测器，不能配备制备型的高效液相仪进行样品的纯化制备n比紫外检测器灵敏度低蒸发光散射检测器3.在中药分析中的应用n中药的化学成分复杂，有一部分成分不存在紫外吸收或仅在紫外末端有吸收。紫外检测器难于检测。ELSD在某种程度弥补了这方面的不足n用于糖类、氨基酸、甾体等化合物黄芪：黄芪甲苷，黄芪：黄芪甲苷，20
22、0.8nm末端紫外吸收末端紫外吸收蒸发光散射检测器电导检测器：用于离子色谱电导检测器：用于离子色谱极谱检测器极谱检测器库仑检测器库仑检测器安培检测器安培检测器电化学检测器伏安检测器伏安检测器能氧化、还原的物质能氧化、还原的物质检测限达检测限达10-12 g/ml，痕量组分分析，痕量组分分析特点：通用型检测器对多数物质的灵敏度低（约10-5 g/ml），不能用于痕量分析适合于糖类的检测（检测限可达10-8g/ml）受环境温度、流动相组成等波动的影响大，不适合梯度洗脱示差折光检测器高选择性、高灵敏度的新型检测器高选择性、高灵敏度的新型检测器是分析微量脂质、核酸、生物胺的最佳选择是分析微量脂质、核酸
23、、生物胺的最佳选择化学发光检测器HPLC-MSHPLC-MS能提供的质谱信息能提供的质谱信息n准确的化合物分子量信息准确的化合物分子量信息n未知化合物碎片结构信息未知化合物碎片结构信息n一一套套完完整整的的图图谱谱和和多多种种扫扫描描方方式式充充分分提提供供定定性性、定量和峰纯度信息定量和峰纯度信息n可用于无共价键、无功能团的化合物可用于无共价键、无功能团的化合物质谱检测器几种检测器的主要性能v化学键合相色谱法 BPC（最广泛）v胶束色谱法 MCv手性色谱法 CCHPLC法分类及方法借助于化学反应的方法将固定液的官能团键合借助于化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体的表面而构成在载体的表面而
24、构成化学键合相化学键合相。化学键合相色谱法 n反相键合相色谱法n正相键合相色谱法n离子对色谱法n离子抑制色谱法反相键合相色谱法n适用于非极性与中等极性的化合物n非极性键合相：十八烷基键合相是最常用的固定相（ODS)05版药典一部n流动相：水+极性调节剂正相键合相色谱法n适用于溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质。如：酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等n常用的极性键合相：氰基（CN)、氨基（NH2)和二醇基(DIOL)n常用的流动相：烷烃（常用正己烷）+极性调节剂n极性调节剂：乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等 n氰基键合相：分离选择性与硅胶相似，对氰基键合相：分离选择性与硅胶相似，对双键异构体
25、或含双键异构体或含双键数不等的环状化合物双键数不等的环状化合物的分离有较好选择性的分离有较好选择性n氨氨基基键键合合相相：较较强强的的氢氢键键结结合合能能力力，对对含含有有甾甾体体、强强心心苷苷等等官官能能团团的的化化合合物物有有较较好好的的分分离离能能力力；与与糖糖类类分分子子的的羟羟基基产生选择性。产生选择性。氨氨基基柱柱用用作作分分析析糖糖类类的的专专用用色色谱谱柱柱，但但不不能能用用于于分分离离羰羰基化合物，如甾酮、还原糖等。因为存在基化合物，如甾酮、还原糖等。因为存在SchiffSchiff碱反应。碱反应。正相键合相色谱法n含义：直接将离子对试剂加入到流动相中，用以分离离子型或可离子
26、化化合物的方法称为离子对色谱法。n分类：反相离子对色谱法;正相离子对色谱法n反相离子对色谱法：以C18或C8键合相为固定相，含离子对试剂的有机溶媒水溶液为流动相n适用于有机酸、碱、盐的分离离子对色谱法1.离子对试剂的选择：选用的离子对试剂的电荷应与试样离子的电荷相反。分析碱类或带正电荷的物质：用带负电荷的烷基磺酸盐或烷基硫酸盐 如：己烷基磺酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠等 分析酸类或带负电荷的物质：用带正电荷的季胺盐 如：四甲胺、四丁胺、十六烷基三甲胺、三辛胺等 离子对试剂的浓度一般为：3-10mmol/L反相离子对色谱法2.流动相ph值的控制调节ph值可在较大范围内改变弱酸、弱碱样品的
27、保留值和分离选择性 因采用的是以硅胶为基体烷基键合相，流动相的ph应在2-8范围内调整3.有机溶剂的选择：甲醇水；乙腈水系统 反相离子对色谱法反相离子对色谱法特点n采用反相键合液相色谱柱，在一般的HPLC仪器上就可运行，它兼有反相色谱和离子交换色谱共同的优点，分析速度快，效率高，操作简便。n适用于有机酸、生物碱的分离，以及用离子交换色谱法无法分离的离子和非离子混合物的分离。n缺点：离子对试剂价格较贵。离子抑制色谱法n定义定义 通通过过向向流流动动相相中中加加入入少少量量弱弱酸酸（常常用用醋醋酸酸）、弱弱碱碱（常常用用氨氨水水）、或或缓缓冲冲盐盐（常常用用磷磷酸酸盐盐及及醋醋酸酸盐盐），调调节节
28、流流动动相相的的pHpH值值，抑抑制制组组分分的的离离解解，增增加加组组分分在在固固定定相相中中的的溶溶解解度度，并并改改善善峰峰形形，以以达达到到分分离离有有机机弱弱酸酸、弱弱碱碱的的目目的的。这这种技术叫种技术叫离子抑制色谱法。离子抑制色谱法。n离子抑制色谱法通常用于反相键合相色谱中，组分的保留值除与一般的反相键合色谱法有相同的影响因素外，还受流动相的pH值影响。n流动相的PH值要在2-8之间离子抑制色谱法特点离子抑制色谱法与离子对色谱法的区别1.1.离离子子抑抑制制色色谱谱法法是是向向流流动动相相中中加加入入抑抑制制剂剂以以抑抑制制组组分分自自身身解解离离。所所加加抑抑制制剂剂为为低低分
29、分子子有有机机或或无无机机弱弱酸酸、弱弱碱碱或或盐盐。抑制子（反离子）是样品本身所具有的离子。抑制子（反离子）是样品本身所具有的离子。2.2.离离子子对对色色谱谱法法则则是是向向流流动动相相中中加加入入离离子子对对试试剂剂。离离子子对对试试剂剂是是有有机机两两性性化化合合物物、表表面面活活性性剂剂。离离子子对对试试剂剂的的反反离离子与组分离子结合成中性离子对。子与组分离子结合成中性离子对。一、定量方法二、方法学建立HPLC的定量方法二、方法学建立（一）专属性（二）线性关系考察（三）精密度试验（四）准确度试验（五）稳定性试验（六）检测灵敏度及检测限的测定1.根据被分析样品的特性选择适用于样品分析
30、的一种高效液相色谱分析方法。2.选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格(柱内径及柱长)和选用固定相(粒径及孔径)。3.根据被分析样品特性选择合适的检测器。4.优化分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方法。5.建立分析方法并进行验证（方法学考察）6.样品分析。由获得的色谱图进行定性和定量分析。小结 建立建立HPLCHPLC分析方法的步骤分析方法的步骤1.1.样品的溶解度样品的溶解度n样品溶于非极性有机溶剂样品溶于非极性有机溶剂n样品溶于极性有机溶剂样品溶于极性有机溶剂n样品溶于水相样品溶于水相2.2.样品的分子量范围样品的分子量范围n体积排阻色谱体积排阻色谱n油溶性样品油溶性样品凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱n水溶性样品水溶性样品凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱 3.3.样品的分子结构和分析特性样品的分子结构和分析特性 同系物、结构异构体、对映异构体、生物大分子同系物、结构异构体、对映异构体、生物大分子一、了解样品性质一、了解样品性质小结小结n建立HPLC分析方法的步骤 思考题n中药制剂HPLC定量分析方法所包含的内容？