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1、高压蒸汽灭菌液体培养基第一章传统发酵技术的应用1.微生物的类群原核生物(细菌、蓝细菌等细菌、蓝细菌等)原生生物(如草履虫、衣藻等如草履虫、衣藻等)真菌(如酵母菌、霉菌等如酵母菌、霉菌等)酵母菌青霉菌大型真菌球菌蓝细菌草履虫衣藻病毒（无细胞结构）禽流感病毒SARS病毒难以用肉眼观察的微小生物的统称实验室培养微生物条件1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件培养基2）确保其它微生物无法混入无菌技术 微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到，若想得到纯净的微生物，就必须对其进行培养和分离。一.培养基的配制1.培养基概念：2.培养基作用：用以用以培养培养、分离分离、鉴定鉴定、保存微生物保存微生物或积累其代
2、谢物或积累其代谢物。人们按照微生物对人们按照微生物对营养物质营养物质的不同需求，配制出供其生长繁的不同需求，配制出供其生长繁殖的殖的营养基质营养基质。3.培养基类型：按按物理状态物理状态来分：可分为来分：可分为液体液体培养基、培养基、固体固体培养基等。培养基等。固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基无无 有有 凝固剂凝固剂琼脂琼脂是一种从红藻中提取的多糖。在98以上熔化，在44以下凝固，在常规培养条件下呈固态。划分培养基种类特点用途物理性质不加凝固剂不加凝固剂加凝固剂，如琼脂加凝固剂，如琼脂工业生产工业生产观察微生物的运动、分观察微生物的运动、分类鉴定。类鉴定。微生物分离、鉴定、微生物分离、
3、鉴定、活菌计数、保藏菌种活菌计数、保藏菌种液体培养基半固体培养基固体培养基4.培养基的营养构成:（1 1）基本成分）基本成分：碳源、氮源、水、无机盐1 1）碳源：）碳源：无机碳源：无机碳源：COCO2 2、COCO3 32 2-、HCOHCO3 3-有机碳源：有机碳源：葡萄糖、葡萄糖、牛肉膏等牛肉膏等自养微生物自养微生物异养微生物异养微生物2）氮源：氮源：无机氮源：无机氮源：NHNH4 4、NONO3 3-、NHNHNHNH3 3 3 3等等等等有机氮源：有机氮源：蛋白胨、尿素、蛋白胨、尿素、氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸等等阅读P10回答（2 2）还需满足微生物对还需满足微生物对 pH、特殊营养物
4、质特殊营养物质、氧气的需求微生物例子微生物例子培养基需要的特殊物质或条件培养基需要的特殊物质或条件 乳酸杆菌乳酸杆菌霉菌霉菌细菌细菌厌氧微生物厌氧微生物添加维生素添加维生素调至酸性调至酸性调至中性或弱碱性调至中性或弱碱性提供无氧的条件提供无氧的条件 培养基中的氮元素是培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。等物质所必需的。注意注意(1)(1)加入培养基中的凝固剂（如琼脂），一般不能被微生物利用，只起到凝固作用。菌落：单个菌落：单个或或少数同种少数同种菌体菌体在固体培养基在固体培养基上上大量繁殖，形成肉眼大量繁殖，形成肉眼可见的子细胞群体。可见的子细胞群体。
5、特征：特征：大小、形状、光泽度、颜色、透明度大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。等。菌落是菌落是鉴定菌种鉴定菌种的重要依据。的重要依据。沙门氏菌(2 2)微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落毛霉1.消毒使用较为温和的使用较为温和的物理、化学或生物物理、化学或生物等方法，杀死物体表面等方法，杀死物体表面或内部一或内部一部分微生物部分微生物。（1 1）概念：）概念：（2 2）消毒的方法：）消毒的方法：煮沸消毒法煮沸消毒法：100煮沸5-6min。巴氏消毒法巴氏消毒法：62-65下煮30min 或 80-90下煮30s-1min。化学药剂消毒法化学药剂消毒法：用70%酒精酒精擦拭双手；
6、氯气氯气消毒水源。紫外线消毒法：紫外线消毒法：获得纯净培养物的关键是什么？防止外来杂菌的入侵二.无菌技术2.灭菌 （1 1）概念：）概念：指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。（2 2）灭菌的方法：）灭菌的方法：芽孢芽孢 有些细菌在有些细菌在营养条件缺乏营养条件缺乏时，在菌体内形成的一时，在菌体内形成的一个圆形或椭圆形、含水量低、抗逆性强的休眠体，个圆形或椭圆形、含水量低、抗逆性强的休眠体，叫做芽孢。叫做芽孢。孢子孢子脱离亲本后能直接或间接发育成新个体的脱离亲本后能直接或间接发育成新个体的无无性生殖细胞性生殖细胞。能直接发育成新个体。能直接发育成新个体。注：使用后的培养基
7、必须灭菌后注：使用后的培养基必须灭菌后 才能丢弃，以免污染环境。才能丢弃，以免污染环境。湿热灭菌湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅（2 2）灭菌的方法：）灭菌的方法：高压蒸气灭菌（效果最好）：100kPa、121下维持15-30min.常用于培养基、无菌水等的灭菌。对象：对象：耐高温，需保持干燥的物品，耐高温，需保持干燥的物品，适用于适用于 玻璃器皿玻璃器皿 (如试管、培养皿、吸管、注射器如试管、培养皿、吸管、注射器)金属器具金属器具 (如针头、如针头、镊子、剪刀等镊子、剪刀等)的灭菌的灭菌干热灭菌干热灭菌：干热灭菌箱干热灭菌箱内内160-170 160-170
8、 下加热下加热2-3h2-3h 灼烧灭菌灼烧灭菌：酒精灯火焰灼烧酒精灯火焰灼烧常用于涂布器、接种环、接种针、试管口等的灭菌。注意注意实验前：实验前：u对操作空间、操作人员对操作空间、操作人员消毒消毒u对所用器皿、接种用具和培养基对所用器皿、接种用具和培养基灭菌灭菌操作时：操作时：u在在超净工作台超净工作台上并在上并在酒精灯火焰附近酒精灯火焰附近无菌区操作无菌区操作u避免避免已灭菌处理材料已灭菌处理材料再次污染再次污染 无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？无菌技术还能有效避免无菌技术还能有效避免操作者操作者被微生物感染。被微生物感染。由由单一个体单一个体繁殖所获
9、得的繁殖所获得的微生物群体微生物群体称为称为纯培养物纯培养物，获得纯培，获得纯培养物的过程就是养物的过程就是纯培养纯培养。三.微生物的纯培养培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。具体过程：具体过程：配置配置培养基培养基灭菌灭菌接种接种分离分离培养培养1.制备培养基制备培养基配制培养基灭菌倒平板1.制备培养基1 1）配制培养基）配制培养基2 2）灭菌）灭菌将配制好的将配制好的培养基培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅中，在压力为中，在
10、压力为1 100kPa00kPa、温度为、温度为121121的条件下，灭菌的条件下，灭菌15-30min15-30min。将。将5-85-8套套培养皿培养皿包成一包，用几层牛皮纸包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入包紧，放入干热灭菌箱干热灭菌箱内，在内，在160-170160-170灭菌灭菌2h.2h.包器材包器材称取去皮马铃薯称取去皮马铃薯200g200g，切成小块，加水，切成小块，加水1000ml1000ml，加热煮沸至马铃薯软，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g20g葡萄糖、葡萄糖、15-20g15-20g琼脂琼脂，用蒸馏水定，用蒸馏水定容至容至
11、1000ml1000ml。（有时需。（有时需调调pHpH）倒平板的具体操作：倒平板的具体操作：倒平板的具体操作：倒平板的具体操作：3 3 3 3）倒平板）倒平板）倒平板）倒平板倒平板注意事项：温度：50左右操作：在酒精灯火焰附近冷凝后平板倒置1.将灭过菌的培养皿放将灭过菌的培养皿放在在火焰旁火焰旁的桌面上，右的桌面上，右手拿装有培养基的锥形手拿装有培养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。瓶，左手拨出棉塞。培养基约502.右手拿锥形瓶，使右手拿锥形瓶，使瓶口迅速瓶口迅速通过火焰通过火焰。3.用左手的拇指和食指将培养皿用左手的拇指和食指将培养皿打开打开一条稍大于瓶口的缝隙一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥，右手
12、将锥形瓶中的培养基形瓶中的培养基(约约1020mL)倒入培倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。通过灼烧灭菌，防止通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培瓶口的微生物污染培养基。养基。1.1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到5050左右时，才能用来倒平板。你用左右时，才能用来倒平板。你用什么办什么办法来估计法来估计培养基的温度？培养基的温度？可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。2.2.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间皿盖与皿底之间的部位，这的部位，这个平板还能用来
13、培养微生物吗？为什么？个平板还能用来培养微生物吗？为什么？防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。将所倒平板所倒平板放入37的恒温箱中培养12h24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。4.4.怎么确定所倒平板怎么确定所倒平板未被杂菌污染未被杂菌污染？3.3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。问题讨论2.接种和分离酵母菌 通过通过接种环接种环在固体培养基表面在固体培养基表面连续划线连
14、续划线的操作，将聚集的菌种逐步的操作，将聚集的菌种逐步稀释稀释分散分散到培养基表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。到培养基表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。(1)“(1)“平板划线平板划线”实验操作实验操作连续划线法连续划线法分区划线法分区划线法平板划线法平板划线法注意事项注意事项:接种环接种环只蘸一次菌液只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置但要在培养基不同位置连续划线多次连续划线多次划线划线首尾不能相接首尾不能相接每次划线前每次划线前接种环进行灭菌接种环进行灭菌划线后划线后,培养皿培养皿倒置培养倒置培养1.将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。2.在火焰旁冷却接种环，并拔出
15、装有酵母菌的棉塞。3.将试管口通过火焰。4.将已冷却的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液。5.将试管口通过火焰，并塞上棉塞。6.左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基！7.灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。1）一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；2）存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。12345该平板划线一共灼烧几次接种环该平板划线一共灼烧几次接种环杀死接
16、种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞渐减少，直至得到单个细胞灼烧时期灼烧时期目的目的取菌种前取菌种前每次划线前每次划线前接种结束后接种结束后杀死接种环上原有微生物杀死接种环上原有微生物在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。3.培养酵母菌 完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和
17、一个未接种的平板倒置倒置，放入28左右的恒温培养箱中培养24-28h。作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染防止培养基表面的水分挥发；又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染 如果如果未接种的培养基在恒温箱中保温未接种的培养基在恒温箱中保温1 12 d2 d后无菌落生长后无菌落生长，说明培，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。养基的制备是成功的，否则需要重新制备。如果培养基上生长的如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母基本一致，并符合酵母菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求
18、的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。练习。1.1.培养基的制作是否合格？培养基的制作是否合格？2.2.接种操作是否符合无菌要接种操作是否符合无菌要求？求？3.3.是否进行了及时细致的观察与记录？是否进行了及时细致的观察与记录？培养培养12 h12 h与与24 h24 h后的酵母菌菌落的大小会有明显不同。后的酵母菌菌落的大小会有明显不同。（培养时间越长，菌落越大、颜色越深培养时间越长，菌落越大、颜色越深）结果分析与评价稀释涂布平板法平板划线法练习与应用练习与应用一、概念检测
19、一、概念检测 1 1.微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。（1 1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。生长越有利。（）（2 2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。（）（3 3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。生物培养物。（）2 2.日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？是如何阻止或抑制微生物生长的？提示：日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低温储存提示：日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低温储存等。干制可以降低食品的水分含量；腌制可以通过食盐、糖等。干制可以降低食品的水分含量；腌制可以通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；低温则是等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；低温则是通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。练习与应用练习与应用一、概念检测一、概念检测ABCDEFGB、G、E、A、C、D、F请排序：