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1、动物细胞培养细胞工程细胞工程01动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件 动物细胞培养：从动物体中取出相关的组织或器官，将它分散成单个细单个细胞胞，然后在适宜的培养条件适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖生长和增殖的技术。动物细胞培养需要什么样的条件？回忆：机体给体内细胞提供了哪些适宜的条件使其能够维持正常的生命活动？原理？细胞增殖细胞增殖(有丝分裂有丝分裂)血浆淋巴组织液营养激素，生长因子等神经系统内分泌系统免疫系统抗 体特殊物质O2，CO2无毒无菌pH渗透压温度01动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件01动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件无菌、无毒的环境无菌：无菌操作防止培养过程中的微生物
2、污染无毒：定期更换培养液温度、pH和渗透压气体环境温度：36.50.5pH：7.2-7.4渗透压：O2：细胞代谢所必须CO2：维持培养液的pH值用用培培养养皿皿或或松松盖盖培培养养瓶瓶，在在95%空空气气和和5%CO2 的的混混合合气气体体的的CO2培培养养箱箱中中进行培养。进行培养。维持细胞正常形态维持细胞正常形态清除代谢产物，防止代谢产物积累对细胞造成危害。清除代谢产物，防止代谢产物积累对细胞造成危害。01动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件糖类、氨基酸、无机盐、维生素等营养条件 将细胞所需的上述营养物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。通常需加入血清等一些天然成分。
3、抗生素 酚红 基础营养 胎牛血清液体培养基01拓展拓展 血清中含有蛋蛋白白质质、氨氨基基酸酸、葡葡萄萄糖糖、激激素素等，其中,蛋白质主要为白蛋白和球蛋白;氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本原料，且且有有些些氨氨基基酸酸是是动动物物细细胞胞本本身身不不能能合合成成的的，必须由培养液提供;激激素素有胰岛素、生长激素等。血清还含有多种未知的促细胞生生长长因因子子、促促贴贴附附因因子子及及其其他他活活性性物物质质，它们能促进细胞的生长、增殖和贴附。灭菌？建构动物细胞培养的流程？02动物细胞培养的过程动物细胞培养的过程动物组织的选择：幼龄动物？老龄动物？幼龄个体的细胞分化程度低、分裂能力强，易培养新鲜
4、取材的新鲜取材的动物组织块动物组织块分散成分散成单个细胞单个细胞细胞细胞悬液悬液原代原代培养培养传代传代培养培养02动物细胞培养的过程动物细胞培养的过程机械方法胰蛋白酶处理胶原蛋白酶处理思考1.常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？说明细胞间的物质主要是蛋白质胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就失去活性，多数动物细胞培养的适宜pH为7.27.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以用胃蛋白酶不行。动物动物组织块组织块分散成分散成单个细胞单个细胞02动物细胞培养的过程动物细胞培养的过程机械方法胰蛋白酶处理胶原蛋白酶处理思考2.用胰蛋白酶、胶原蛋白
5、酶处理组织块，使组织分散成单个细胞的目的是什么？使细胞与培养液充分接触，一方面保证细胞所需氧气和营养的供应，另一方面，另一方面保证细胞内代谢产物的及时排出。使得在细胞水平操作的其他得以实现。动物动物组织块组织块分散成分散成单个细胞单个细胞思考3.实验过程中，胰蛋白酶处理时间过长，会出现什么结果？细胞膜的成分中含有蛋白质，而胰蛋白酶能够水解蛋白质，因此，胰蛋白酶会把细胞消化掉。因此，胰蛋白酶处理的时间不能太长。加培养液细胞细胞悬液悬液放入培养瓶在适宜条件02动物细胞培养的过程动物细胞培养的过程思考4.观察发现，细胞进入培养瓶后并不立即生长，细胞发生了什么行为？黏附黏附贴壁贴壁铺展铺展贴壁生长（大
6、多数）悬浮生长（如淋巴细胞）悬液中大多数分散的细胞很快就贴附在瓶壁上生长增殖，这种现象称为细胞贴壁细胞贴壁。细胞能够悬浮在培养液中生长增殖02动物细胞培养的过程动物细胞培养的过程细胞接触抑制当贴贴壁壁细细胞胞分裂生长到表面相互接触时，糖蛋白识别了这种信息，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为接触抑制。肿瘤细胞失去接触抑制肿瘤细胞失去接触抑制，在在培养液可以无限增殖下去。培养液可以无限增殖下去。思考5.动物细胞培养中贴壁细胞能否在培养瓶中不停增殖？悬浮细胞呢？02动物细胞培养的过程动物细胞培养的过程细胞悬液细胞悬液放入培养瓶在适宜条件在适宜条件分瓶培养原代培养原代培养传代培养传代培养思考6.为什么
7、要进行分瓶培养？悬浮悬浮生长生长贴壁贴壁生长生长细胞密度过大细胞密度过大有害代谢物积累有害代谢物积累营养物质缺乏营养物质缺乏接触抑制接触抑制分瓶分瓶培养培养(传代传代培养培养)解决原因原代原代培养培养问题细胞分细胞分裂受阻裂受阻02动物细胞培养的过程动物细胞培养的过程细胞悬液细胞悬液放入培养瓶在适宜条件在适宜条件分瓶培养原代培养原代培养传代培养传代培养思考7.进行分瓶培养时，如何处理？悬浮悬浮细胞细胞贴壁贴壁细胞细胞离心法收集离心法收集胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理制成细胞悬液制成细胞悬液分瓶培养分瓶培养02动物细胞培养的过程动物细胞培养的过程机械方法胰蛋白酶处理胶原蛋白酶处理动物动物组织块组织块分
8、散成分散成单个细胞单个细胞加培养液细胞细胞悬液悬液放入培养瓶在适宜条件在适宜条件分瓶培养原代培养原代培养传代培养传代培养原代培养将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经过处理后的初次培养初次培养称为原代培养。将分瓶后的细胞培养称为传代培养。传代培养分瓶传代10代细胞50代细胞无限增殖保持细胞正常二倍体核型少数少数：细胞核型细胞核型改变，改变，常出现异常出现异常染色体，失去接触抑制、形状常染色体，失去接触抑制、形状不规则，获得不死性（永生性不规则，获得不死性（永生性）（遗传物质没改变）（遗传物质没改变）思考8.能无限传代么？原代培养使用或保存的细胞通常为10代以内有限细胞系无限细胞系初代培养物开始第一
9、次传代培养后的细胞，即称为细胞系大部分：衰老死亡。大部分：衰老死亡。02动物细胞培养的过程动物细胞培养的过程有关动物细胞培养的问题有关动物细胞培养的问题讨论1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更容易培养？为什么？细胞增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物的细胞则相反。所以，一般来说，幼龄动物细胞比老龄动物细胞易于培养。分化程度越低的细胞，增殖能力越强，所以更容易培养。分化程度越低的细胞，增殖能力越强，所以更容易培养。讨论3.动物细胞培养与植物组织培养有什么相同之处与不同之处？从培养原理、所需营养条件、环境条
10、件以及培养过程等方面分析比较。讨论2.多次用到胰蛋白酶的目的是什么？第一次：使组织细胞分散开传代时：使细胞从瓶壁上脱落下来分散成单个细胞动物胚胎、幼龄动物动物胚胎、幼龄动物机械法或胰蛋白酶、胶机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理将组织分原蛋白酶处理将组织分散成单个细胞散成单个细胞用培养液将细胞制成细胞悬液用培养液将细胞制成细胞悬液一类细胞能够悬浮在一类细胞能够悬浮在培养液中生长增殖培养液中生长增殖大多数需要贴附于某些大多数需要贴附于某些基质表面才能生长增殖基质表面才能生长增殖直接用离直接用离心法收集心法收集重重新新用用胰胰蛋蛋白白酶酶等等处处理理，使使之之分分散散成成单单个个细细胞胞，然后再用离心
11、法收集然后再用离心法收集取动物组织取动物组织分散细胞分散细胞制细胞悬液制细胞悬液原代培养原代培养传代培养传代培养（分瓶培养）（分瓶培养）比较项目植物组织培养动物细胞培养原理培养基性质培养基特有成分培养过程培养结果培养目的植物细胞的全能性细胞增殖固体液体植物激素动物血清脱分化、再分化原代培养、传代培养植物体动物细胞群快速繁殖植物得到动物细胞及细胞产物相相同同点点：培培养养基基中中都都需需要要加加入入营营养养物物质质、培培养养过过程程中中都都需需要要防防止止杂杂菌菌污污染染、都都需需要要提提供适宜的温度、供适宜的温度、pH和渗透压的条件。和渗透压的条件。植物组织培养与动物细胞培养比较 1.1.动物
12、细胞培养的特点是动物细胞培养的特点是 ()()细胞贴壁细胞贴壁 有丝分裂有丝分裂 分散生长分散生长 接触抑制接触抑制 减数分裂减数分裂A.B.C.D.A.B.C.D.2 2一般来说，动物细胞体外培养需要满足以下条件一般来说，动物细胞体外培养需要满足以下条件 ()无毒的环境无毒的环境 无菌的环境无菌的环境 培养液中需加血浆培养液中需加血浆温度与动物体温相近温度与动物体温相近 需要需要O O2 2，不需要，不需要COCO2 2 加加COCO2 2维持培养液的维持培养液的pHpHA A B B C C D DDA3.3.下列有关动物细胞培养的叙述，正确的是下列有关动物细胞培养的叙述，正确的是 ()A
13、 A动物细胞培养的目的就是动物细胞培养的目的就是获得大量的分泌蛋白获得大量的分泌蛋白B B对动物组织块和分散的细胞进行培养，效果是基本相同的对动物组织块和分散的细胞进行培养，效果是基本相同的C C细胞遗传物质的改变发生于原代培养过程中细胞遗传物质的改变发生于原代培养过程中D D培养高度分化的动物体细胞一般不能发育成培养高度分化的动物体细胞一般不能发育成幼体幼体D1.概念：动物动物和人体内仍保留的和人体内仍保留的少数具有少数具有分裂和分化能力的细胞分裂和分化能力的细胞。在在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。2.分布：干细胞干细胞存在存在于于
14、、和和 等等多种组织和器官多种组织和器官中中早期胚胎早期胚胎骨髓骨髓脐带血脐带血3 3.分类分类：包括包括胚胎干细胞胚胎干细胞和和成体干细胞成体干细胞等。等。(1)(1)胚胎干细胞胚胎干细胞（简称（简称ESES细胞细胞）分布：分布：存在存在于于 中中早期胚胎早期胚胎特点：特点：具有具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能应用实例：应用实例：ESES细胞在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等细胞在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等干细胞培养及其应
15、用03干细胞培养及其应用干细胞培养及其应用骨髓骨髓中中的的 、神经系统神经系统中中的的 、睾丸睾丸中中的的 等等；(2)(2)成体成体干细胞干细胞分布：分布：存在存在于于 中中成体组织或器官内成体组织或器官内举例：举例：造血干细胞造血干细胞神经干细胞神经干细胞精原干细胞精原干细胞特点：特点：一般一般认为，成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞认为，成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。或组织，不具有发育成完整个体的能力。发现最早、研究最多的、应用最成熟的发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例实例：主要存在于主要存在于成体的成体的骨髓、外周血、
16、脐带血骨髓、外周血、脐带血中。中。造血干细胞造血干细胞03干细胞培养及其应用干细胞培养及其应用03干细胞培养及其应用干细胞培养及其应用治治疗疗神神经经组组织织损损伤伤和和神神经经系系统统退退行行性性疾疾病病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）（如帕金森病、阿尔茨海默病等）治治疗疗白白血血病病及及一一些些恶恶性性肿肿瘤瘤放放疗疗或或化化疗疗后后引引起的起的造血系统造血系统、免疫系统功能障碍免疫系统功能障碍等疾病等疾病有着有着自我更新能力及分化潜能自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。的发育、再生和修复等密切相关。1.1.应用应用原理：原理：2.
17、2.应用实例：应用实例：a.a.造血造血干细胞：干细胞：b.b.神经神经干细胞：干细胞：干细胞将在干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测再生医学、药物安全性与有效性检测等领域等领域发挥大作用。发挥大作用。4.4.面临的问题：面临的问题：存在存在肿瘤发生肿瘤发生的风险的风险涉及涉及伦理伦理问题；问题；3.3.应用展望：应用展望：5 5.诱导多能干细胞（诱导多能干细胞（iPSiPS细胞）细胞）通过通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞类似胚胎干细胞的一种细胞，的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称称为诱导多能干细胞，简称iPSiPS细胞。细胞。优点：优点：
18、干细胞培养及其应用诱导过程无须破坏胚胎；诱导过程无须破坏胚胎；iPSiPS细胞可来源于病人自身体细胞，移植后可避免免疫排斥反应。细胞可来源于病人自身体细胞，移植后可避免免疫排斥反应。03干细胞培养及其应用干细胞培养及其应用诱导诱导方法：方法：将将特定基因或特定蛋白导入特定基因或特定蛋白导入细胞细胞（成纤维细胞以及已分化的成纤维细胞以及已分化的T T细胞、细胞、B B细胞均可）细胞均可）；用小分子化合物诱导形成。用小分子化合物诱导形成。移植取成纤维细胞等iPS细胞转入相关因子细胞发生转化分化胰岛细胞神经元血细胞肠上皮细胞心肌细胞肝细胞病人iPSiPS细胞用于治疗人类疾病示意图细胞用于治疗人类疾病
19、示意图 可可治治疗疗镰镰状状细细胞胞贫贫血血症症，在在治治疗疗阿阿尔尔兹兹海海默默病病、心心血血管管疾疾病病等等领领域域的的研研究究也也取取得得了了新新进展。进展。5 5.诱导多能干细胞（诱导多能干细胞（iPSiPS细胞）细胞）应用：应用：干细胞培养及其应用03干细胞培养及其应用干细胞培养及其应用无菌、无毒无菌、无毒营养营养温度、温度、pH和渗透压和渗透压气体环境气体环境制备细胞悬液制备细胞悬液原代培养原代培养传代培养传代培养动动物物细细胞胞培培养养动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件动物细胞培养的过程动物细胞培养的过程干细胞的培养和应用干细胞的培养和应用干细胞的种类、特点及应用干细胞的种类、特点及应用iPS细胞的培养和应用细胞的培养和应用原理原理概念概念