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1、第1课时动物细胞培养第第2 2节节动物细胞工程第第2 2章章细胞工程细胞工程通过细胞培养构建的人造皮肤通过细胞培养构建的人造皮肤大面积烧伤的病人,需要移植健康皮肤从社会中来 在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。怎样获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养可供的移植皮肤？可以从病人身上可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增扩增；目前，科学家还在研究对；目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养皮肤干细胞进行
2、培养，以获，以获得适合临床上使用的人造皮肤，既得适合临床上使用的人造皮肤，既解决了来源不足解决了来源不足，又不会，又不会产生产生排斥反应排斥反应。烧伤病人图片动物细胞培养动物细胞核移植动物细胞融合生产单克隆抗体动物细胞工程动物细胞工程是最基础的技术植物细胞工程植物细胞工程植物组织培养植物体细胞杂交细细胞胞工工程程细胞增殖细胞增殖(有丝分裂有丝分裂)。动物细胞培养是指是指从动物体中从动物体中_相关的相关的_，将，将它它_，然后在，然后在_下，让这些细胞下，让这些细胞_和和_的技术。的技术。(2)目的：(1)原理：(3)地位：取出取出组织组织分散成单个细胞分散成单个细胞适宜的培养条件适宜的培养条件
3、生长生长增殖增殖获得细胞或细胞产物获得细胞或细胞产物(不能获得完整动物个体不能获得完整动物个体)。那么，动物细胞培养需要哪些必要的条件？培养的过程又是怎样的呢？是动物细胞工程的是动物细胞工程的基础。基础。动物细胞培养的条件一动物细胞培养的条件营养物质其他条件糖类 氨基酸无机盐 维生素无菌、无毒的环境适宜的温度、pH和渗透压适宜的气体环境这里的糖类不包括这里的糖类不包括淀粉、蔗糖淀粉、蔗糖等等1.营养：(1)(1)合成培养基合成培养基-已知成分已知成分已知成分已知成分将细胞所需的将细胞所需的_（糖类、氨基酸、无机盐、维生素等）糖类、氨基酸、无机盐、维生素等）按按_和和_严格配制而成的培养基，称为
4、严格配制而成的培养基，称为_。营养物质营养物质种类种类所需量所需量合成培养基合成培养基(2)(2)天然成分天然成分-未知成分未知成分未知成分未知成分由于由于人们对细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚，因此人们对细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚，因此在在使用合成培养基时，通常需加入使用合成培养基时，通常需加入_等一些天然成分。等一些天然成分。血清血清(3)(3)培养动物细胞一般使用培养动物细胞一般使用_，也，也称为称为_。液体培养基液体培养基培养液培养液血清中不仅含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等多种营养物质，还有激素及多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和
5、贴附。即天然培养基。动物细胞培养的条件一思考1:为什么培养液需要定期更换？_思考2:如何防止培养过程中的微生物污染？_一2.无菌、无毒的环境：(1)(1)对对培养液培养液和和所有培养用具所有培养用具进行进行_处理处理(2)(2)在在_下进行操作；下进行操作；(3)(3)还需要还需要_。灭菌灭菌无菌环境无菌环境定期更换培养液定期更换培养液以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害在细胞培养液中添加一定量的抗生素在细胞培养液中添加一定量的抗生素脉动真空灭菌器脉动真空灭菌器动物细胞培养的条件3.温度、pH和渗透压(1)(1)哺乳动物细胞培
6、养的温度多以哺乳动物细胞培养的温度多以_为宜；为宜；(2)(2)多数动物细胞生存的适宜多数动物细胞生存的适宜pHpH为为_。(3)(3)维持适宜渗透压的目的维持适宜渗透压的目的_。36.536.50.50.57.2-7.47.2-7.4维持细胞正常的形态和功能维持细胞正常的形态和功能一动物细胞培养的条件4.气体环境：(1)(1)动物细胞培养所需气体主要有动物细胞培养所需气体主要有_和和_。O O2 2：_COCO2 2：_(2)(2)容器：容器：通常采用通常采用_ _或或_ _ _。(3)(3)仪器：仪器：置于含有置于含有_和和_的混合气体的的混合气体的_。O O2 2COCO2 2O O2
7、2是细胞代谢所必需的是细胞代谢所必需的COCO2 2的主要作用维持培养液的的主要作用维持培养液的pHpH培养皿培养皿松盖培养瓶松盖培养瓶95%95%空气空气5%CO5%CO2 2COCO2 2培养箱培养箱一动物细胞培养的条件动物细胞培养的过程二取动物组织制成细胞悬液转入培养液原代培养分瓶传代培养动物细胞培养的过程二取动物组织用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理分散成单个细胞加培养液细胞悬液在培养皿或培养瓶内原代培养悬浮生长贴壁生长(大多数）细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等出现接触抑制细胞分裂受阻解决方法传代培养分瓶培养制成细胞悬液，分瓶培养收集细胞悬浮培养的细胞：直接用离心法收集
8、贴壁细胞：用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，用离心法收集培养过程中出现了几个概念：要求：培养瓶（皿）内表面光滑、无毒、易于贴附(1)细胞贴壁:动物细胞培养的过程二大多数大多数体外培养的细胞需要体外培养的细胞需要_ _ _才能生长增殖，才能生长增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的这类细胞往往贴附在培养瓶的_上。上。贴附于某些基质表面瓶壁(2)接触抑制:当当_细胞生长细胞生长到到_时，细胞通常会时，细胞通常会_。贴壁表面相互接触停止分裂增殖通常通常将将_的细胞培养，即动物组织经的细胞培养，即动物组织经_后的后的_称为原代培养；称为原代培养；(3)原代培养：(4)传代培养：将将_的细胞培养称为传代培养。的细
9、胞培养称为传代培养。分瓶之前处理初次培养分瓶后10代以内的细胞10-50代的细胞形成形成一层一层细胞细胞可形成可形成多层多层细胞细胞肿瘤细胞失去接触抑制，癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少，条件适宜在培养液可以无限增殖下去。圆球形细胞刚开始铺展贴壁生长（100）培养的动物细胞贴壁生长并进行有丝分裂（100）细胞单层贴壁生长铺满瓶壁后出现接触抑制（100）贴壁生长与接触抑制1.取什么样的组织？原因？选动物胚胎或幼龄动物的器官或组织选动物胚胎或幼龄动物的器官或组织原因：原因：原因：原因：其细胞生命力旺盛，其细胞生命力旺盛，分化程度低，分化程度低，分裂能力强，容易培养。分裂能力强，容易培养。2.为什么
10、要分散成单个细胞？3.用胰蛋白酶分散细胞，说明什么问题？4.可以用胃蛋白酶处理吗？为什么？成块组织中细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长与增殖成块组织中细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长与增殖;便于细胞从培养液中获得营养，保证细胞内的有害代谢物及时排出。便于细胞从培养液中获得营养，保证细胞内的有害代谢物及时排出。动物动物细胞间的物质主要是蛋白质细胞间的物质主要是蛋白质不可以，因为胃蛋白酶的最适不可以，因为胃蛋白酶的最适pHpH为为1.51.5左右，左右，多数动物细胞生存的多数动物细胞生存的pHpH为为7.2-7.4,7.2-7.4,胃蛋白酶在此环境下会失活。胰蛋白酶在此环境下活性较高。胃蛋白酶在
11、此环境下会失活。胰蛋白酶在此环境下活性较高。思考讨论:不对不对；使用；使用胰蛋白酶时，要胰蛋白酶时，要控制好作用时间控制好作用时间，因为胰蛋白酶不仅能分解，因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，长时间作用细胞间的蛋白质，长时间作用还会分解细胞膜蛋白还会分解细胞膜蛋白等，对细胞造成损伤。等，对细胞造成损伤。5.酶解法较温和，一定不会对动物细胞造成损伤，对吗？思考讨论:纤维蛋白、胶原蛋白等原代培养传代培养细胞株细胞系6.正常细胞能否一直传代培养下去？遗传物质改变遗传物质有的改变分瓶培养细胞悬浮液10代细胞50代细胞无限传代思考讨论:不可以；细胞的传代培养一般传至10代后就不易传下去，这时细胞能保持
12、细胞正常的二倍体核型；传至10-50代左右时，增殖会逐渐缓慢，以至于完全停止，这时部分细胞的细胞核型可能会发生变化，这一阶段的细胞称为细胞株；继续传代培养时，少部分细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正在朝着等同于癌细胞的方向发展，这一阶段的细胞称为细胞系，细胞系的遗传物质一定改变了；遗传物质有的改变7.动物细胞培养与植物组织培养有什么相同和不同之处？思考讨论:动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液胰蛋白酶原代培养传代培养大量细胞单个细胞加培养液离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织根、芽植物体脱分化再分化接种至培养基动动物物细细胞胞培培养养植植物物组组织织培培养养
13、比较项目植物组织培养动物细胞培养原理培养基性质培养基特有成分培养结果培养目的相同点植物组织培养和动物细胞培养的比较获得细胞或细胞产物常用固体培养基植物体葡萄糖、动物血清常用液体培养基细胞增殖细胞的全能性许多细胞快速繁殖等蔗糖、植物激素1.培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；2.均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件动物胚胎、幼龄动物机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理将组织分散成单个细胞用培养液将细胞制成细胞悬液一类细胞能够悬浮在培养液中生长增殖大多数需要贴附于某些基质表面才能生长增殖直接用离心法收集重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集取动物组织制成细胞悬液转入
14、培养液原代培养分瓶传代培养干细胞干细胞存在于存在于_ _、_和和_ _ _等多种组织和器官中。等多种组织和器官中。干细胞培养及应用三干细胞：动物和人体内仍保留着少数具有分裂和分化能力的细胞，这些细胞叫作干细胞。早期胚胎骨髓脐带血1.1.分布分布:干细胞干细胞包括包括_和和_等。等。干细胞培养及应用三2.2.类型类型:胚胎干细胞成体干细胞干细胞培养及应用三成果：成果：(1)胚胎干细胞(简称ES细胞)分布：分布：存在存在于于_中。中。特点：特点：具有分化为成年动物体内的任何一种类型的具有分化为成年动物体内的任何一种类型的 ，并进一步形成机体的所有，并进一步形成机体的所有 甚至甚至 的潜能。的潜能。
15、早期胚胎早期胚胎细胞细胞组织和器官组织和器官个体个体全能干细胞局限：局限：目前科学家已经目前科学家已经分离分离了兔、牛、猴和人等的了兔、牛、猴和人等的ESES细胞，并细胞，并证明证明了了ESES细胞可以细胞可以在体外分化成心肌细胞、神经元和造血干细胞在体外分化成心肌细胞、神经元和造血干细胞等细胞。等细胞。胚胎干细胞必须从胚胎干细胞必须从 中获取，这涉及中获取，这涉及 问题，因而限制了问题，因而限制了它在医学上的应用。它在医学上的应用。伦理伦理胚胎胚胎干细胞培养及应用三特点：特点：成体干细胞具有成体干细胞具有 ，只能分化成，只能分化成 ，不具有发育成，不具有发育成 的能力。的能力。(2)成体干细
16、胞分布：分布：是是 内的干细胞。内的干细胞。常见类别：常见类别：包括包括 中的中的_、_中的中的_、_中的中的_等；等；成体组织或器官内成体组织或器官内骨髓、骨髓、造血干细胞造血干细胞神经系统神经系统神经干细胞神经干细胞睾丸睾丸精原干细胞精原干细胞组织特异性组织特异性特定的细胞或组织特定的细胞或组织完整个体完整个体发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例多能干细胞专能干细胞外周血和脐带血外周血和脐带血 有着有着_能力及能力及_潜能的干细胞，与潜能的干细胞，与_的的_等密切相关。等密切相关。自我更新分化组织、器官发育、再生和修复类型应用造血干细胞神经干细胞治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的
17、造血系统、免疫系统功能障碍等疾病治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）方面有重要的应用价值导致肿瘤发生的风险3.干细胞的应用面临的问题面临的问题存在存在_干细胞培养及应用三4.诱导多能干细胞干细胞培养及应用三(1)概念：通过体外诱导_，获得_的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称_。成纤维细胞类似胚胎干细胞iPS细胞移植取成纤维细胞等iPS细胞转入相关因子细胞发生转化分化胰岛细胞神经元血细胞肠上皮细胞心肌细胞肝细胞病人iPS细胞用于治疗人类疾病示意图体外诱导小鼠成纤维细胞诱导多能干细胞iPS多种体细胞定向诱导分化干细胞培养及应用三(2)应用：治疗小鼠的镰状细胞贫血；治
18、疗小鼠的镰状细胞贫血；现在用现在用iPSiPS细胞治疗阿而茨海默病、心血管疾病等领域的研究也细胞治疗阿而茨海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展。取得了新进展。(3)优点：诱导过程诱导过程_iPSiPS细胞可以细胞可以_，将它移植回病人体内，将它移植回病人体内后，理论上可以后，理论上可以_；无需破坏胚胎无需破坏胚胎来源于病人自身的体细胞来源于病人自身的体细胞避免免疫排斥反应避免免疫排斥反应因此，普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞_干细胞培养及应用三借助载体将特定基因导入细胞中诱导形成iPS细胞直接将特定蛋白导入受体细胞中诱导形成iPS细胞用小分子化合物来诱导形成iPS细胞诱导形成
19、iPS细胞成纤维细胞以及已分化的T细胞、B细胞(4)制备iPS细胞的其他方法(5)iPS细胞的来源:人的核移植胚胎干细胞经诱导分化，形成相应的组织、器官后，可用于组织器官的移植。干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。干细胞培养及应用三细胞类型胚胎干细胞(ES细胞)成体干细胞造血干细胞神经干细胞精原干细胞来源早期胚胎骨髓、外周血和脐带血神经系统睾丸作用分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，具有进一步形成机体、所有组织和器官甚至个体的潜能只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力特异性不具有组织特异性具有组织特异性应用有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、
20、器官的发育、再生和修复等密切相关，因而在医学上有着广泛的应用将正常的造血干细胞移植到病人体内，恢复病人的造血和免疫功能，已成为治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病的一种重要手段神经干细胞在治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病(如帕金森病、阿尔茨海默病等)方面有重要的应用价值无菌、无毒营养温度、pH和渗透压气体环境制备细胞悬液原代培养传代培养动物细胞培养动物细胞培养的条件动物细胞培养的过程干细胞的培养和应用干细胞的种类、特点及应用iPS细胞的培养和应用课堂小结小结1.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。(1)(1)培养培养环境中需要环境中需要O O2 2
21、，不需要，不需要COCO2 2 。（。（）(2)(2)细胞细胞要经过脱分化形成愈伤组织。要经过脱分化形成愈伤组织。（）(3)(3)培养液培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清（）(4)(4)培养瓶培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理中的细胞需定期用胰蛋白酶处理,分瓶后才能继续增殖分瓶后才能继续增殖（）2.干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是()A.干细胞是从胚胎中分离提取的细胞B.造血干细胞可以分化为各种血细胞C.不同类型的干细胞,它们的分化潜能是有差别的D.由iPS细胞产生的特定细胞,可以在新药的测试中发挥重要作用A一.
22、概念检测练习与应用现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。(1)(1)由于由于诱导诱导iPSiPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPSiPS细胞进行医疗只细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施?像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HLA(Human Le
23、ukocyte Antigen,HLA(Human Leukocyte Antigen,人类人类白细胞抗原白细胞抗原)多态性丰富的多态性丰富的iPSiPS细胞库，可以为需要的人找到细胞库，可以为需要的人找到HIAHIA匹配度较高的匹配度较高的iPSiPS细细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。应。二、拓展应用练习与应用(2)(2)如果如果诱导诱导iPSiPS细胞定向分化为细胞定向分化为生殖细胞生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能
24、带来哪些问题？又可能带来哪些问题？该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPSiPS细胞分别诱导形成精细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出子和卵子，两者受精可能培育出“单亲单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选择婴儿；有的人还可能有目的地选择iPSiPS细胞，细胞，从而从而“设计设计”婴儿。婴儿。二、拓展应用练习与应用感 谢 观 看