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1、ICS65.020B16DB37山东省地方标准DB37/T34792018苹果苗木传带病虫害检测与防控技术规范Technicalspecificationfordetectionandcontrolofnurseryappletree-transmittedpests2018-12-29发布2019-01-29实施山东省市场监督管理局发布DB37/T34792018前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省农业农村厅提出并监督实施。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：青岛农业大学。本标准主要起草人：李保华、王彩霞、董向丽、张振芳、练森、原永兵、刘成
2、连、周涛、曹洪建、任洪春。IDB37/T34792018苹果苗木传带病虫害检测与防控技术规范1范围本标准规范了苹果苗本传带病虫害检测与防控的术语和定义，育苗环境、土地和育苗材料的选用标准，及病毒检测、病虫害防控和苗传病虫害检测的技术。本标准适用于山东省苹果苗木繁育期间，随苗木传带病虫害的防控。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T2281苹果病毒检测技术规范3术语和定义规范性引用文件确立的以及下列术语和定义适用于本标准。3.1苗传病虫害(Seedlin
3、gTransmittedPests)随苹果苗木传播，定殖后难彻底铲除，且危害严重的各种病虫害，主要包括病毒、类病毒、腐烂病、轮纹病、苹果绵蚜、根癌病等。3.2病毒与类病毒（AppleVirusandViroid）造成树体生长发育不良和严重危害的病毒与类病毒，包括锈果类病毒(ASSVd)、坏死花叶病毒(ApNMV)、凹果类病毒(ADFVd)、褪绿叶斑病毒(ACLSV)、茎沟病毒(ASGV)和茎痘病毒(ASPV)六种。3.3非潜隐病毒（Non-LatentVirus）在常规栽培品种上，能造成明显症状和严重危害的病毒或类病毒，主要为锈果类病毒(ASSVd)、坏死花叶病毒(ApNMV)和凹果类病毒(A
4、DFVd)三种。3.4潜隐病毒（LatentVirus）在常规栽培品种上，不造成明显的症状，但能导致树体生长发育不良的病毒，主要为褪绿叶斑病毒(ACLSV)、茎沟病毒(ASGV)和茎痘病毒(ASPV)三种。1DB37/T347920183.5无病毒材料（Virus-FreeMaterial）没有携带可检测病毒或类病毒，或经过2年3年连续检测，现代检测技术没有检测到病毒或类病毒的繁殖材料或苗木。3.6非脱毒材料（NonVirus-FreeMaterial）指没有经过脱毒处理，不潜带有非潜隐病毒，但带有不超过一种潜隐病毒的繁殖材料或苗木。3.7外源病虫害（ExternalSourcePests）从
5、育苗圃或采穗圃外随气流、雨水、昆虫传入，或主动迁入，并在苗木上侵染定殖的各种病虫害。3.8本源病虫害（LocalSourcePests）育苗圃或采穗圃内原来就有，或随苗木、接穗、气流、雨水、昆虫传入、或主动迁入，且已在苗圃或采穗圃内定殖的病虫害。4苗圃地选择选择没有交叉感染病虫害或病虫害交叉感染率低的环境，没有病菌或病菌少的地块培育苹果苗木，保持育苗圃清洁卫生。4.1苗圃位置与地块宜在没有苹果种植的地区培育苹果苗木。在苹果种植区培育苹果苗木时，育苗圃应离苹果和梨园5km以上，且近5年没有栽植林木及苗木。4.2育苗圃宜选择开阔通风、灌溉与排水条件良好、土壤肥沃地块作育苗地。周围5km范围内不能有
6、桧柏等刺柏科植物。及时销毁废弃的苗木、接穗、病虫栽体、病残体等，始终保持育苗圃清洁卫生。5育苗材料扩繁之前检测或检查所有繁育材料，发现带有苗木传带病虫害的材料，及时清除。5.1种子从健康、无毒的母本树上采集。采种前对采种母本树进行病毒检测，发现带毒母株及时清除。5.2采穗圃原种和一级母本树应每年检测一次，非脱毒材料每2年3年检测一次，及时清除不符合标准的材料。2DB37/T347920185.3材料获取从果园或苗圃内选择性状优良、长势良好、健壮无病的植株进行病毒检测，从中筛选无毒材料或非脱毒材料；或筛选含容易脱除病毒的植株，进行脱毒处理，获得无毒材料或非脱毒材料。6病毒检测样品6.1采样时期4
7、月5月份，苹果萌芽至新梢生长期是采集病毒检测样品的最佳时期。6.2单株样品采集单株样品检测主要用于筛选无毒或非脱毒材料。生长期从旺盛生长的新梢顶端摘取2cm3cm的嫩芽或嫩梢，每株3个4个。休眠期剪取20cm30cm长的枝条，每株1个2个，或直接剥取0.5cm长的皮层5块6块。以株为单位将样品密封于塑料袋内，标记株号、品种、采集时间、地点、采集人等信息。6.3混合样品采集混合样品检测主要掌握苗木的带毒情况。以品种、行、畦、地块等为取样单元，随机取样，取样比例不小于1%，生长季节每株摘取1个2cm3cm长的嫩芽，休眠季节每株剪取1个20cm30cm的枝条，以取样单元为单位密封于塑料袋中，标记取样
8、单元、取样时间、地点、采集人等信息。6.4保存与运输用04的冷藏箱短期保存(2周内)；长期保存时，需先将样品用液氮速冻后，放于负80的低温冰箱内。嫩梢和嫩芽装入保温箱内，加冰块密封后运输；枝条可密封于塑袋中保湿运输。6.5检测顺序6.5.1筛选无毒材料时，依据估测带毒普遍率，由高到低检测，或先检测潜隐病毒，淘汰带毒材料后，再检测非潜隐病毒，逐步筛选出无毒材料。6.5.2筛选非脱毒材料时，首先检测非潜隐病毒，淘汰带毒材料后，再检测非潜隐病毒。6.6检测策略与方法检测单株样品时，可将多个样品混合检测，发现样品带毒时，再逐个检测，最终找出带病毒植株。检测混合样品时，可分成多个样品检测。RT-PCR检
9、测技术按附录A的方法进行，免疫学检测和生物学检测按NY/T2281的规定进行。7病虫害防控苹果苗木繁育期，重点防控腐烂病、轮纹病、苹果绵蚜和根部病害。7.1剪口处理采穗圃和苗圃内所有剪口，在形成当天都要涂布伤口愈合剂。无伤口愈合剂时，用无毒、无害、环保的油漆作为基质，混入有效成份为0.3%0.5%的多菌灵或甲基硫菌灵后涂布剪口。7.2嫁接后处理3DB37/T34792018冬春季室内嫁接的苗木，嫁接后立即喷淋有效成份含量为0.03%0.05%的吡唑醚菌酯或0.3%0.5%甲基硫菌灵药液。7.3根部处理苗木栽植前，用根部处理剂或1%的硫酸铜溶液等对细菌高效的杀菌剂浸泡根部5min10min后，立
10、即栽植。7.4本源病虫害采穗圃和多年生苗圃，于3月份萌芽前，清除苗圃内及周边落叶、残余苗木、废弃物、病虫载体等，喷35波美度的石硫合剂、1%2%多量式波尔多液或95%机油乳剂80倍100倍药液等。生长季节，经常检查采穗圃和苗圃，发现腐烂病、轮纹病、白绢病、花叶病、苹果绵蚜等病虫株，及时清除，并带离苗圃焚烧或深埋。整个生长季节，依病虫发生和降雨情况，及时喷药防控各种病虫害。7.5外源病虫害周边5km范围有果园的苗圃，重点防控绵蚜、轮纹病和腐烂病，兼治苹果黄蚜、金纹细蛾、各种螨类、褐斑病、白粉病、锈病、炭疽叶枯病等。7.5.1苹果绵蚜于5月、6月份和9月、10月份绵蚜迁飞期，用诱虫板监测迁飞成虫，
11、发现有绵蚜迁入时，及时喷撒杀虫剂。若绵蚜已在苗圃内定殖，用药剂灌根或树上喷药彻底铲除。7.5.2轮纹病和腐烂病雨水少的季节或年份，结合其他病害防治喷施杀菌剂；遇雨量大于10mm，持续时间长于24h的阴雨，雨后及时喷施内吸性杀菌剂。多雨季节或连续阴雨期，每7d10d喷施一次杀菌剂，内吸性杀菌剂和保护性杀菌剂交替使用。8出圃苗木检测与处理8.1苗木分检与处理起苗后剔除染有病虫和生长不良的苗木，用苗木处理剂处理苗木，或用有效成份为0.03%0.05%吡唑醚菌酯或0.3%0.5%甲基硫菌灵药液，混加0.05%0.1%吡虫啉或0.3%0.5%毒死蜱，喷淋整株苗木，直到根部有药液流下为止，并保湿24h48
12、h。8.2苗木质量检测随机选取20株50株苗木，每3株5株一组栽植于直径40cm50cm、深度40cm50cm的花盆中，浇足水后，移入温度为2030的光照环境中培养，后期不再浇水。苗木萌芽后检查苗木发芽率、带毒率和病虫害发生率，发现腐烂病斑、干腐病斑、苹果绵蚜等，应对苗木进行病虫害处理或销毁，对苗木带毒率高或发芽率低的苗木，应彻底销毁。4DB37/T34792018AA附录A（资料性附录）反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测A.1原理RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。利用反转录酶将病毒或类病毒RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板
13、，经过模板变性、引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA序列。这是一个指数增长的过程，上一轮的扩增产物又可作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般经过3040个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭等核酸染料染色的凝胶上观察到特异性条带。A.2试剂A.2.1Trizol试剂：由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，苯酚饱和液（38%）-380ml/L，硫氰酸胍盐（0.8M）-118.16g/L，硫氰酸铵（0.4M）-76.12g/L，醋酸钠（0.1M，pH5）-33.4ml/L，甘油50ml，加水补充至1L。A.2.2无RNA酶灭菌水：将试剂瓶等容器在180
14、烘烤6h，去离子水中按0.01%（体积/体积）加入DEPC（焦磷酸二乙酯），处理过夜后高压灭菌而得到。A.2.375%乙醇：用无RNA酶灭菌水和无水乙醇配置。A.2.4氯仿，异戊醇，异丙醇、无水乙醇，反转录酶，DNA聚合酶，DNA分子量标准，琼脂糖。A.3仪器设备2.5l1000l各种型号移液器，高速冷冻离心机，低温冰箱，液氮罐，各种型号无RNA酶0.2ml1.5ml离心管和10l1000l枪头，PCR扩增仪，紫外分光光度计，凝胶成像体系，电泳槽和电泳仪。A.4操作步骤A.4.1总RNA的提取A.4.1.1按照Trizol法提取总RNA，如果用商品化植物总RNA提取试剂盒提取总RNA，按试剂盒
15、说明书进行。A.4.1.250mg100mg苹果组织置于1.5ml离心管中，用液氮研磨成粉末，加入1mlTrizol试剂，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%；A.4.1.3研磨液室温放置5min，然后每1mlTrizol加入0.2ml氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15s，4下，12000r/min离心10min；A.4.1.4取上层水相于一新的离心管，加入等体积异丙醇，室温放置10min，12000r/min离心10min；A.4.1.5弃去上清液，加入1ml的70%乙醇，涡旋混匀，7500r/min离心5min；5病毒名称序列（53）目标片段/bp退火温度/苹果褪绿叶斑
16、病毒(ACLSV)F:GAGARTTTCAGTTTGCTMGAR:AGTCTACAGGCTATTTATTATAAGT79453苹果茎沟病毒(ASGV)F:GGAATTTCACACGACTCCTAACCCTCCR:CCCGCTGTTGGATTTGATACACCTC50059苹果茎痘病毒(ASPV)F:TGCCTCAAAGTACACCCCTCAGTR:CGCCAAGAAATGCACAGC31658苹果坏死花叶病毒(ApNMV)F:ATGGTGTGCAATCGCTGTCAR:CATCGACCATAAGGATATCA64050苹果锈果类病毒(ASSVd)F:CCGGTGAGAAAGGAGCTGCCAG
17、CAR:CCTTCGTCGACGACGACAGGTGAG33357苹果凹果类病毒(ADFVd)F:GAGGAAAACTCCGTGTGGTTCR:AAGTCCACTCCCTGCCAGACC27155DB37/T34792018A.4.1.6小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5min10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。A.4.1.7将RNA溶于DEPC处理过的无菌水中，可5560水浴10min，增加RNA的溶解度。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于负70的冰箱内。A.4.2核酸检测利用紫外分光光度计检测提取的总RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD2801
18、.8时，样品纯度符合要求，计算其浓度由下面公式计算。1OD26040g/mlRNA，RNA（g/ml）=测得OD值40。A.4.3cDNA合成以5g总RNA为模板，以六碱基随机引物为引物，参照M-MLV反转录酶产品说明书反转录成cDNA。一般为20l的反转录体系：10mol/l随机引物1.0l，10mmol/l的dNTPs1.0l，RNA酶抑制剂0.5l，200U/lM-MLV酶0.5l，DEPC处理无菌水补足至20l。于42反应1h，95灭活3min，-20保存备用。A.4.4PCR扩增检测所用引物见表A.1，PCR反应体系为25l：反转录产物cDNA1.0l，10Buffer2.5l，10
19、mmol/l的dNTPs0.5l，20mol/l正向引物和20mol/l反向引物各0.5l，5U/l的TaqDNA聚合酶0.25l，加灭菌双蒸水至25l。PCR反应条件为：95预变性3min；95变性30s，对应引物退火温度（表A.1）复性30s，72延伸30s，35个循环；最后72延伸5min。表A.1用于苹果病毒或类病毒RT-PCR检测的引物A.5结果判定检测时设置阴性对照（健康、不带毒样品）、阳性对照（带有病毒或类病毒的毒源材料），采用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，150V电压电泳约30min，用0.5g/ml溴化乙锭染色10min或将核酸染料直接加入琼脂糖凝胶中。在凝胶成像仪中观察条带，如出现与阳性对照核酸大小相同的特异性目的条带，说明样品带毒；如与阴性对照一样，未观察到目的条带，说明样品健康不带毒。6DB37/T34792018_7