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1、发酵工程是指利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品。它涉及菌种的选育和培养、产物的分离和提纯等方面。选择性必修三 生物技术与工程目录CONTENT01新课导入02任务探究03课堂练习课堂小结04第第第第2 2 2 2节节节节 微生物的培养技术及应用微生物的培养技术及应用微生物的培养技术及应用微生物的培养技术及应用第二课时第二课时第二课时第二课时 微生物的选择培养和计数微生物的选择培养和计数微生物的选择培养和计数微生物的选择培养和计数问题思考问题思考自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合的菌群中不是优势种群
2、时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办呢?新课导入新课导入一、选择培养基一、选择培养基【任务一】1.阅读课本16页第2段，通过寻找耐高温的DNA聚合酶，明确可以筛选出来的原因，这为实验室筛选微生物提供什么提示？说出选择培养基的定义。任务探究任务探究1.1.1.1.科学科学科学科学实例：实例：实例：实例：寻找寻找耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。筛选原因：因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热的Taq细菌保留下来。PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚
3、合酶。耐高温的酶耐高温生物体高温环境（热泉、火山口）寻找寻找那么，如何从众多的微生物中筛选出单一菌种？一、选择培养基一、选择培养基1966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的Taq细菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。【任务一】1.阅读课本16页第2段，通过寻找耐高温的DNA聚合酶，明确可以筛选出来的原因，这为实验室筛选微生物提供什么提示？说出选择培养基的定义。人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。耐寒微生物耐热微生物石油分解菌2.2.2.2.实验室中微生物的筛选原理：实验室中微生物的筛选原理：实验室中微生物的筛选原
4、理：实验室中微生物的筛选原理：一、选择培养基一、选择培养基【任务一】1.阅读课本16页第2段，通过寻找耐高温的DNA聚合酶，明确可以筛选出来的原因，这为实验室筛选微生物提供什么提示？说出选择培养基的定义。允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。3.3.3.3.选择培养基：选择培养基：选择培养基：选择培养基：不加氮源自养微生物酵母菌和霉菌(青霉素能杀死细菌、放线菌)固氮微生物加入青霉素加高浓度食盐金黄色葡萄球菌石油是唯一碳源能消除石油污染的微生物不加碳源一、选择培养基一、选择培养基【任务一】1.阅读课本16页第2段，通过寻找耐高温的DNA聚合酶，明确可以筛选出来的原因
5、，这为实验室筛选微生物提供什么提示？说出选择培养基的定义。一、选择培养基一、选择培养基【任务一】2.阅读16页思考讨论“选择培养基配方的设计”，完成讨论题。尿素CO(NH2)2含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。讨论：讨论：讨论：讨论：1.你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、
6、缺乏氮源而不能生长发育繁殖。【任务一】2.阅读16页思考讨论“选择培养基配方的设计”，完成讨论题。一、选择培养基一、选择培养基这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。二、微生物的选择培养二、微生物的选择培养【任务二】1.阅读课本17页和18、19页的探究实践“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数，明确实验各步骤的具体操作，尝试计算单位土壤中的细菌数量。葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO47H2O0.2g琼脂15.0g蒸馏水1000ml原理：原理：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素
7、。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。配方：u制备选择培养基（尿素为唯一氮源）u制备牛肉膏蛋白胨培养基对照作用思考1：为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？提供无机盐；调节pH。1.1.1.1.选择培养基的制备选择培养基的制备选择培养基的制备选择培养基的制备二、微生物的选择培养二、微生物的选择培养【任务二】1.阅读课本17页和18、19页的探究实践“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数，明确实验各步骤的具体操作，尝试计算单位土壤中的细菌数量。细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3-8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的
8、信封中。取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。2.2.2.2.稀释土壤样品稀释土壤样品稀释土壤样品稀释土壤样品（1）土壤取样二、微生物的选择培养二、微生物的选择培养【任务二】1.阅读课本17页和18、19页的探究实践“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数，明确实验各步骤的具体操作，尝试计算单位土壤中的细菌数量。2.2.2.2.稀释土壤样品稀释土壤样品稀释土壤样品稀释土壤样品（2）样品的稀释测细菌数：一般用104、105、106稀释液。测放线菌：一般用103、104、105稀释液。测真菌数：一般用102、103、104稀释液。不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物
9、采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30300之间适于计数的平板。BAC思考2：在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30300的平板进行计数？选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养二、微生物的选择培养二、微生物的选择培养【任务二】1.阅读课本17页和18、19页的探究实践“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数，明确实验各步骤的具体操作，尝试计算单位土壤中的细菌数量。6支试管，分别加入9ml无菌水1ml1021ml1031ml1041ml1051ml1061ml107稀释10倍菌液101在火焰旁称取土壤10g，加入90ml无菌水中，摇匀，制成稀释10倍的土壤菌液。分别
10、取1ml上清液，加入盛有9ml无菌水的试管中，制成不同稀释倍数的菌液。取6支试管，分别加入9ml无菌水。（2）样品的稀释3.3.3.3.取样涂布平板：取样涂布平板：取样涂布平板：取样涂布平板：滴取0.1ml菌液（不超过），滴加到培养基表面。将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中（尽量滴尽酒精后灼烧）。浸二、微生物的选择培养二、微生物的选择培养【任务二】1.阅读课本17页和18、19页的探究实践“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数，明确实验各步骤的具体操作，尝试计算单位土壤中的细菌数量。灼将涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽后，涂布器冷却后，再进行涂布。涂用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿
11、，使涂布均匀。待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，培养。3.3.3.3.取样涂布平板：取样涂布平板：取样涂布平板：取样涂布平板：各梯度分别涂布至少3个平板 2个不涂布作空白对照二、微生物的选择培养二、微生物的选择培养【任务二】1.阅读课本17页和18、19页的探究实践“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数，明确实验各步骤的具体操作，尝试计算单位土壤中的细菌数量。选择培养基完全培养基判断选择培养基是否具有筛选作用？一浸、二滴、三烧、四涂一浸、二滴、三烧、四涂设设置置两两个个空空白白对对照照：不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。以验证培养基中是否含有杂菌原则原则：确保菌落数在303030
12、0300之间接种：用稀释液涂布平板。3.3.3.3.取样涂布平板：取样涂布平板：取样涂布平板：取样涂布平板：二、微生物的选择培养二、微生物的选择培养【任务二】1.阅读课本17页和18、19页的探究实践“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数，明确实验各步骤的具体操作，尝试计算单位土壤中的细菌数量。不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30-37的温度下培养1-2d。每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。注意注意：设置对照组一同培养
13、对照对照组组：验证是否有杂菌：未接种的选择培养基、未接种的牛肉膏蛋白胨培养基 验证是否具有筛选作用：接种的牛肉膏蛋白胨培养基4.4.4.4.微生物的培养与观察微生物的培养与观察微生物的培养与观察微生物的培养与观察二、微生物的选择培养二、微生物的选择培养【任务二】1.阅读课本17页和18、19页的探究实践“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数，明确实验各步骤的具体操作，尝试计算单位土壤中的细菌数量。平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法关键操作注意事项菌体获取优点缺点二、微生物的选择培养二、微生物的选择培养【任务二】2.根据课本和所学知识，对比平板画线法和稀释涂布平板法，完成下表。平板划线
14、法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法关键操作接种环在固体平板培养基表面连续划线一系列的梯度稀释涂布平板法操作注意事项每次划线前后均需灼烧接种环稀释度要足够高，为确保试验成功可以增加稀释度的范围菌体获取在具有显著的菌落特征的区域菌落中挑取菌体从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体优点可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数缺点不能对微生物计数操作复杂，需要涂布多个平板二、微生物的选择培养二、微生物的选择培养【任务二】2.根据课本和所学知识，对比平板画线法和稀释涂布平板法，完成下表。三、微生物的数量测定三、微生物的数量测定【任务三】阅读课本18页第2-4
15、段，明确微生物的数量测定中的方法，并对每种方法进行分析。原理：原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。选择30-300个菌落的平板进行计数；每个稀释度至少取3个平板取其平均值；统计的结果一般用菌落数而不是活菌数；统计的菌落往往比活菌的实际数目低；恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。计数计数原则原则缺点：因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落。1.1.1.1.间接
16、计数法间接计数法间接计数法间接计数法 稀释涂布平板法稀释涂布平板法稀释涂布平板法稀释涂布平板法三、微生物的数量测定三、微生物的数量测定【任务三】阅读课本18页第2-4段，明确微生物的数量测定中的方法，并对每种方法进行分析。不能区分死菌与活菌；个体小的细菌在显微镜下难以观察；2.2.2.2.直接计数直接计数直接计数直接计数 计数板计数法计数板计数法计数板计数法计数板计数法原理：原理：利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。缺点：缺点：（“染色排除法”）三、微生物的数量测定三、微生物的数量测定【任务三】阅读课本18页第2-4段，明确微生物的数量测定中的方法，并对每
17、种方法进行分析。实例分析1：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？3.3.3.3.计算：计算：计算：计算：每克样品中的菌落数(CV)MC代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。（80+90+100）/30.1 105=9 107个三、微生物的数量测定三、微生物的数量测定【任务三】阅读课本18页第2-4段，明确微生物的数量测定中的方法，并对每种方法进行分析。课堂小结课堂小结微生物的数量测定选择培养基的作用微生物选择培养获取纯培养
18、物的方法-稀释涂布平板法微生物的选择培养和计数选择培养基微生物的选择培养科学实例筛选原则选择培养基的概念及举例稀释涂布平板法的操作过程间接计数法 稀释涂布平板法直接计数 计数板计数法土壤中分解尿素的细菌的分离与计数培养基的制备（1）土壤取样（2）样品的稀释（3）稀释涂布平板法接种（4）微生物的培养与观察实验设计课堂练习课堂练习1.(2023山东卷)金黄色葡萄球菌是一种病原菌，它可耐受质量分数为7.5%的NaCl溶液。金黄色葡萄球菌在添加适量血液的血平板上生长时，可破坏菌落周围的红细胞，使其褪色。为检测鲜牛奶中是否存在金黄色葡萄球菌，科研人员设计了如图所示的流程。下列说法错误的是（）A.振荡培养时应选用含质量分数为7.5%NaCl溶液的鉴别培养基B.振荡培养可使微生物与营养物质充分接触，提高培养液中的氧气含量C.若血平板中菌落周围出现透明圈，则初步说明鲜牛奶中存在金黄色葡萄球菌D.为使检测更严谨，应设置加灭菌的鲜牛奶但其他操作均与图示相同的对照组选择培养基A2.(2023河北卷)下列有关微生物培养或纯化的叙述，错误的是A.微生物在培养前要先对培养基进行灭菌处理再接种B.培养液中溶氧量的变化会影响酵母菌的繁殖和代谢途径C.分离自养型微生物的方法是用纤维素作为唯一碳源的培养基进行培养D.分离纯化微生物的常用方法是平板划线法和稀释涂布平板法添加无机碳源C