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1、 ICS 11.220 CCS B 41 5304 玉溪市地方标准 DB 5304/T 0602023 主要动物疫病免疫抗体监测技术规范 2023-04-20 发布 2023-07-19 实施 玉溪市市场监督管理局 发 布 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由玉溪市动物疫病预防控制中心提出。本文件由玉溪市农业农村局归口。本文件的附录A、B、C、D、E为资料性附录。本文件起草单位：玉溪市动物疫病预防控制中心 本文件主要起草人：吕嵘、杨耀兰、罗晓燕、杨秋楠、宋诗雅、李晶、张晓舟、徐聪、荚洪涛、吴明伟、杨曦。主要动物疫病免疫
2、抗体监测技术规范 1 范围 本文件规定了动物疫病免疫抗体监测的主要监测病种、血清样品采集、采样单填写、血清分离与保存、样品的送检与接收、抗体监测方法及结果判定、监测结果记录与汇总、血清留样、无害化处理等。本文件适用于玉溪市主要动物疫病免疫抗体监测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 18090 猪繁殖与呼吸综合征诊断方法 GB/T 18935 口蹄疫诊断技术 GB/T 27982 小反刍兽疫诊断技术 GB/T 3590
3、6 猪瘟抗体间接ELISA检测方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 动物疫病 主要是指生物性病原引起的动物群发性疾病，包括动物传染病、寄生虫病。3.2 抗体 在病原刺激下产生的一类能与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白，抗体主要存在于体液中。3.3 免疫监测 普检或抽检动物群体的抗体水平，以监控群体的免疫状态，为实施计划免疫和增强免疫提供依据。3.4 血清 血浆去除纤维蛋白原后的(胶体性)液体。4 主要监测病种 在玉溪市范围内开展的主要动物疫病监测病种。国家强制免疫病种：高致病性禽流感、口蹄疫、小反刍兽疫。地方计划免疫病种：新城疫、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征。5 血清样品采集 采
4、血器材 5.1 防护服、防护口罩、无粉乳胶手套、注射器、针头、普通真空采血管、2ml离心管、碘酊、75%酒精棉球、冰袋、冷藏容器、采样登记表、记号笔、签字笔等。采血时间 5.2 猪免疫注射28天后（口蹄疫免疫35天后），其他动物免疫21天后方可采血。采血方法 5.3 对采血部位的皮肤先剃（拔）毛，碘酊消毒，75%的酒精脱碘。生猪采用站立式或仰卧式前腔静脉采血、牛羊站立式颈静脉或尾静脉采血、禽类翅静脉采血。6 采样单填写 采血时应按血清样品采样登记表（参见附录A）的内容详细填写采样单，采样单一式两份，一份由被采样单位保存，一份由采样单位保存。7 血清的分离与保存 血清分离 7.1 采集的血液样品
5、可室温放置析出血清，或经4000r/min、3-5分钟离心，吸出上层血清，放置于合适的离心管中。血清编号 7.2 血清编号为“行政区域拼音大写字母”加上“不同动物种类血清编号英文字母和阿拉伯数字组合”用防水记号笔清晰标记于离心管。猪以“A01、A02、A03An”模式编写；牛以“B01、B02、B03Bn”模式编写;羊以“C01、C02、C03Cn”模式编写；禽以“D01、D02、D03Dn”模式编写。例如：红塔区猪血清编号为：HT A01;通海县禽血清编号为：TH D01。血清的保存 7.3 血清立即检测放置4保存；如果保存时间较长，应放置在-20冰箱内保存。8 样品的送检与接收 运输血清样
6、品时将血清放在盛有冰块的冷藏箱中运送。样品送检前送检单位填写 实验室样品送样表（参见附录表B.1）；样品送达兽医实验室，实验室人员进行接收样品登记，填写实验室接样登记表（参见附录表B.2）。9 抗体监测方法及结果判定 高致病性禽流感 9.1 9.1.1 免疫抗体监测方法：血凝和血凝抑制试验（HA-HI）9.1.1.1 1%鸡红细胞制备 分别至少采集三只无特定病原体（SPF）健康公鸡或未免疫（禽流感和新城疫）健康公鸡全血35ml，置于盛有3040ml灭菌生理盐水离心管中，洗涤离心2次，每次均以2000r/min 离心 5min，洗涤后弃去上清，混合于一个离心管中，以2000r/min 离心 5m
7、in。吸取底层红细胞用灭菌生理盐水配置1%体积的红细胞悬液。9.1.1.2 血凝试验（HA）a)在 96 孔 V 型微量反应板中，每孔加 25L 灭菌生理盐水。b)在微量反应板第 1 孔加 25L 标准阳性抗原，充分混匀。c)依次从第 1 孔吸取 25L 液体加入第 2 孔，混匀后吸取 25L 加入第 3 孔，如此对倍稀释至第 11 孔，从第 11 孔吸取 25L 弃去。d)第 12 孔加入 25L 灭菌生理盐水为对照孔。e)每孔再分别加 25L 灭菌生理盐水和 25L 1%鸡红细胞悬液。震荡混匀，室温（2025）静置 30min，对照孔红细胞呈纽扣状沉入板底，进行结果判定。f)结果判定：将反
8、应板倾斜 60，观察红细胞有无泪珠状流淌，完全无泪珠样流淌（100%凝集）的最高稀释倍数判为血凝效价。9.1.1.3 血凝抑制试验（HI）9.1.1.3.1 4 个血凝单位病毒抗原的配置 根据HA试验测定的效价配制4个血凝单位（即4HAU）的病毒抗原。例：以血凝试验血凝效价（凝集终点）为10log2或210（1：1024）为例，4HAU为1024/4=256（1：256），在255份生理盐水里加入1份抗原。9.1.1.3.2 抗原回测检查 血凝抑制试验前应对4HAU抗原进行回测，调整准确。选取96孔V型板5个孔，在25孔每孔加入25L灭菌生理盐水，将配制好的4HAU抗原25L加入第12孔，从第
9、2孔开始按1：1、1：2、1：4、1：8、1：16倍比稀释，即依次形成4HAU、2HAU、1HAU、1/2HAU、1/4HAU抗原浓度；再分别加入灭菌生理盐水25L和1%鸡红细胞悬液25L。震荡混匀，室温（2025）静置30min，观察结果。若配置的4HAU抗原液准确,则1：4稀释度将出现凝集终点；如高于4HAU,凝集终点将后移，在已配制好的4HAU抗原液中添加等量的灭菌生理盐水，二次回测；如低于4HAU,凝集终点将前移，在已配制好的4HAU病毒抗原液中添加等量的抗原，二次回测。9.1.1.3.3 血清抗体效价测定 a)在微量反应板的第 1 孔第 11 孔加入 25L 灭菌生理盐水，第 12
10、孔加入 50L 灭菌生理盐水作为空白对照。b)吸取 25L 血清加入第 1 孔内，充分混匀后，吸取 25L 加入到第 2 孔，依次对倍稀释至第10 孔，从第 10 孔吸取 25L 弃去。第 11 孔为抗原对照。c)1 孔11 孔均加入 25L 4HAU 抗原，在室温（2025）静置 30min。d)每孔加入 25L 1%鸡红细胞悬液，震荡混匀，室温（2025）静置 30min，待对照孔（12孔）红细胞呈纽扣状沉入孔底时判定结果。e)当抗原对照孔（第 11 孔）完全凝集，且阴性对照血清抗体效价不高于 2log2 或 22（1：4），阳性对照血清抗体效价与已知效价误差不超过 1 个滴度时，试验方可
11、成立。以完全抑制 4HAU病毒抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的 HI 抗体效价。9.1.2 结果判定 血清HI抗体效价3log2或23判为HI试验阴性；HI效价4log2或24判为HI试验阳性。口蹄疫 9.2 9.2.1 免疫抗体监测方法 酶联免疫吸附试验（ELISA）9.2.1.1 液相阻断 ELISA 液相阻断ELISA试验方法按照GB/T 18935执行；9.2.1.2 竞争 ELISA 采用商品试剂盒进行检测，按其说明书进行操作。9.2.2 结果判定 液相阻断 ELISA：按照 GB/T 18935 执行；商品化 ELISA 试剂盒按其说明书进行判定。小反刍兽疫 9.3 9.3.1
12、免疫抗体监测方法 竞争ELISA试验方法按照GB/T 27982执行；采用商品化ELISA试剂盒进行检测，按其说明书进行操作。9.3.2 结果判定 竞争 ELISA：按照 GB/T 27982 执行；商品化 ELISA 试剂盒按其说明书进行判定。新城疫 9.4 9.4.1 免疫抗体监测方法 血凝和血凝抑制试验（HA-HI），具体试验步骤同9.1.1。9.4.2 结果判定 血清HI抗体效价3log2或23判为HI试验阴性；HI效价4log2或24判为HI试验阳性。猪瘟 9.5 9.5.1 免疫抗体监测方法 9.5.1.1 间接 ELISA 间接ELISA检测方法按照GB/T 35906执行；9.
13、5.1.2 竞争 ELISA 采用商品化ELISA试剂盒进行检测，按其说明书进行操作。9.5.2 结果判定 间接 ELISA：按照 GB/T 35906 执行；商品化 ELISA 试剂盒按其说明书进行判定。猪繁殖呼吸综合征 9.6 9.6.1 免疫抗体监测方法 间接ELISA试验方法按照GB/T 18090执行；采用商品化ELISA试剂盒进行检测，按其说明书进行操作。9.6.2 结果判定 间接 ELISA：按照 GB/T 18090 执行；商品化 ELISA 试剂盒按其说明书进行判定。10 监测结果记录与汇总 监测结果记录 10.1 实验室完成血清抗体检测后，按要求填写试验结果记录表。血凝抑制
14、试验填写血凝抑制试验结果记录表（参见附录表C.1）；ELISA试验填写ELISA试验结果记录表（参见附录表C.2）。监测结果汇总 10.2 以监测县（市区）、乡镇（街道）、规模畜禽场、行政村为单位，分动物病种、动物种类等进行结果汇总，填写血清学监测结果统计表（参见附表C.3）。11 血清留样 血清检测完毕后，需要对血清样品进行保存不少于15天。样品留存填写血清留样记录表，(参见附录D)。12 无害化处理 实验完毕后，及时分类收集实验室废弃物。具有感染性实验室废弃物应进行高压蒸汽灭菌或放入消毒剂中浸泡24小时，移交专业医疗废弃物或无害化处理机构处置。无害化处理填写实验室废弃物处理记录表，（参见附
15、录E）。A A 附录A （资料性）实验室血清样品采样表 表A.1 血清样品采样登记表（散养户）样品编号 样品所在县（市区）、乡镇、村 畜主姓名 动物种类 年龄 免疫时间 疫苗类型 疫苗生产 厂家 畜主签字 备注 采样时间：采样人员：表A.2 血清样品采样登记表（规模场）养殖场（户）名称 场点地址（经纬度）联系人 电话 动物种类 存栏数 饲养批次 日龄 样品编号 疫苗类型 末次免疫时间 备注 被采样单位（畜主）：采样时间：采样人员：B B 附录B （资料性）实验室样品送检及接样登记 表B.1 实验室样品送检表 样品编号 样品所在地 样品来源 采样日期 动物种类 样品类型 健康状况 末次免疫时间
16、疫苗类型 疫苗厂家 疫苗批号 备注 县（市区）乡 镇 村 畜主姓名 规模场 散养户 市场 屠宰场 饲养量 采样数量 饲养量 采样数量 饲养量 采样数量 饲养量 采样数量 填表人：联系电话：送样人：送样日期：负责人：表B.2 实验室接样登记表 受理编号 检测流转编号 送检单位 送样人 样品类型 样品数量 送样时间 检测项目 送样人 联系电话 接样人 签字 备注 C C 附录C （资料性）实验室检测结果记录表 表C.1 血凝抑制试验结果记录表 检测流转编号 样品数量 检测项目 检测时间 试剂生产厂家 试剂生产批号 检测标准 4 HAU 检测 流水号 原始 编号 血凝抑制滴度 结果 备注 21 22
17、 23 24 25 26 27 28 29 210 抗原 对照 空白 对照 检测人员：复核人员：表C.2 ELISA 试验结果记录表 检测流转编号 样品数量 样品名称 检测时间 检测项目 检测方法 样品编号 检测结果 检测 流水号 原编号 结果 检测 流水号 原编号 结果 检测 流水号 原编号 结果 检测 流水号 原编号 结果 1 26 51 76 2 27 52 77 3 28 53 78 4 29 54 79 5 30 55 80 6 31 56 81 7 32 57 82 8 33 58 83 9 34 59 84 10 35 60 85 11 36 61 86 12 37 62 87
18、13 38 63 88 14 39 64 89 15 40 65 90 16 41 66 91 17 42 67 92 18 43 68 93 19 44 69 94 20 45 70 95 21 46 71 96 22 47 72 23 48 73 24 49 74 25 50 75 备注 检测人员：复核人员：表C.3 血清学监测结果统计表 畜（禽）类别：监测方法 单位：个、份 监测范围 监测结果 合计 县县（市区）乡（镇）村数 规模场数 散养户数 屠宰场数 市场数 规模场样品数 抗体合格数 合格率（%）散养户样品数 抗体合格数 合格率（%）屠宰场样品数 抗体合格数 合格率（%）市场样品数 抗体合格数 合格率（%）场户数 监测样品数 抗体合格数 合格率（%）合计 D D 附录D （资料性）血清留样记录表 受理编号 样品流转 编号 样品种类 数量 留存地点 留样时间 保存条件 留样负责人 备注 备注：样品留存不少于15天，根据实际需要留存。E E 附录E （资料性）实验室废弃物处理记录表 时间 处理物品 受理编号 数量（单位：份、重量）处理方法 处理人员 移交医疗废弃物处理时间 备注 处理物品：血清样品、组织样品、细菌培养物、废弃培养基、试验废弃物等 处理方法：高压灭菌、浸泡消毒、煮沸消毒、焚烧、其他