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1、 ICS 11.220 CCS B 41 5304 玉溪市地方标准 DB 5304/T 0602023 主要动物 疫病免疫 抗体监测 技术规范 2023-04-20 发布 2023-07-19 实施 玉溪市市 场监督 管 理局 发 布 DB 5304/T 060 2023 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标准 化工 作导则 第1 部分：标准化 文件 的结构 和起草 规则 的规 定起草。本文件 由玉 溪市 动物 疫病 预防控 制中 心提 出。本文件 由玉 溪市 农业 农村 局归口。本文件 的附录A、B、C、D、E为 资料 性附录。本文件 起草 单位：玉 溪市 动物疫 病预 防
2、控 制中 心 本文件 主要 起草 人：吕嵘、杨耀 兰、罗晓 燕、杨秋 楠、宋 诗雅、李 晶、张晓 舟、徐 聪、荚洪 涛、吴明伟、杨曦。DB 5304/T 060 2023 1 主 要动物 疫病免疫 抗体监 测技术规 范 1 范围 本 文件 规定 了动 物疫 病免 疫抗体 监测 的主 要监 测病 种、血清 样品 采集、采样 单 填写、血 清分 离与 保存、样 品的 送检 与接 收、抗体监 测方 法及 结果 判定、监测 结果 记录 与汇 总、血清留 样、无害 化处 理等。本 文件 适用 于玉 溪市 主要 动物疫 病免 疫抗 体监 测。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规
3、范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 18090 猪 繁殖 与呼 吸 综合征 诊断 方法 GB/T 18935 口 蹄疫 诊断 技 术 GB/T 27982 小 反刍 兽疫 诊 断技术 GB/T 35906 猪 瘟抗 体间 接ELISA 检测 方法 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 动物疫 病 主要是 指生 物性 病原 引起 的动物 群发 性疾 病，包括 动物传 染病、寄 生虫 病。
4、3.2 抗体 在病原 刺激 下产 生的 一类 能与抗 原发 生特 异性 结合 的免疫 球蛋 白，抗体 主要 存在于 体液 中。3.3 免疫监 测 普检或 抽检 动物 群体 的抗 体水平，以 监控 群体 的免 疫状态，为 实施 计划 免疫 和增强 免疫 提供 依据。3.4 血清 血浆去 除纤 维蛋 白原 后的(胶体性)液 体。4 主要监 测病 种 DB 5304/T 060 2023 2 在玉溪 市范 围内 开展 的主 要动物 疫病 监测 病种。国家强 制免 疫病 种：高致 病性禽 流感、口 蹄疫、小 反刍兽 疫。地方计 划免 疫病 种：新城 疫、猪 瘟、猪繁 殖与 呼吸 综合征。5 血清样 品
5、采 集 采血器 材 5.1 防护服、防 护口 罩、无粉 乳胶手 套、注射 器、针头、普通 真空 采血 管、2ml 离 心管、碘酊、75%酒精棉球、冰袋、冷 藏容 器、采样登 记表、记 号笔、签 字笔等。采血时 间 5.2 猪免疫 注射28天 后（口蹄 疫免疫35天 后），其 他动 物免疫21天 后方 可采 血。采血方 法 5.3 对采血 部位的 皮肤 先剃（拔）毛，碘酊 消毒，75%的 酒精脱 碘。生 猪采 用站立 式或仰 卧式前 腔静 脉采血、牛羊 站立 式颈 静脉 或尾静 脉采 血、禽类 翅静 脉采血。6 采样单 填写 采血时 应按 血清 样品采 样登记 表（参见 附录A）的内容 详细填
6、写采 样单，采样单 一式两 份，一份由被 采样 单位 保存，一 份由采 样单 位保 存。7 血清的 分离 与保 存 血清分 离 7.1 采集的 血液 样品 可室 温放 置析出 血清，或 经4000r/min、3-5分 钟离 心，吸出 上 层血清，放 置于 合适的离心 管中。血清编 号 7.2 血清编 号为“行政 区域拼 音大写 字母”加上“不同 动物种 类血清 编号 英文字 母和阿 拉伯数 字 组 合”用防水 记号 笔清 晰标 记于 离心管。猪以“A01、A02、A03An”模 式编 写；牛以“B01、B02、B03Bn”模 式编 写;羊以“C01、C02、C03Cn”模 式编 写；禽以“D0
7、1、D02、D03Dn”模 式编 写。例如：红塔 区猪 血清 编号 为：HT A01;通 海县 禽血 清 编号为：TH D01。血清的 保存 7.3 血清立 即检 测放 置4 保 存；如果 保存 时间 较长，应 放置在-20 冰 箱内 保存。8 样品的 送检 与接 收 DB 5304/T 060 2023 3 运输血 清样 品 时 将血 清放 在盛有 冰块 的冷 藏箱 中运 送。样 品送 检前 送检 单位 填写 实验 室样 品 送 样表（参见附 录表B.1）；样品送 达兽医 实验 室，实 验室人 员进行 接收 样品登 记，填 写实 验室 接样 登记表（参 见附 录表B.2）。9 抗体监 测方
8、法及 结果 判定 高致病 性禽 流感 9.1 9.1.1 免疫抗 体监 测方 法：血凝和 血凝 抑制 试验（HA-HI）9.1.1.1 1%鸡红 细胞 制备 分别至 少采 集三 只无 特定 病原体（SPF）健 康公 鸡或未 免疫（禽流 感和 新城 疫）健 康公鸡 全血35ml，置于盛 有3040ml 灭 菌生 理盐水 离心 管中，洗涤 离 心2次，每 次均 以2000r/min 离心 5min，洗涤 后弃去上清，混合于 一个 离心管 中，以2000r/min 离心 5min。吸 取底层 红细 胞用灭 菌生理 盐水配 置1%体积 的红细胞 悬液。9.1.1.2 血凝试 验（HA）a)在96 孔V
9、 型微 量反 应板 中，每孔 加 25 L 灭菌 生理 盐水。b)在微量 反应 板 第1 孔加 25 L 标 准阳 性抗 原，充分 混匀。c)依次从 第 1 孔 吸取 25 L 液体加 入第 2 孔，混匀 后 吸取 25 L 加 入第 3 孔，如此对 倍稀 释 至第11 孔，从第11 孔吸取25 L 弃去。d)第12 孔加 入25 L 灭菌 生 理盐水 为对 照孔。e)每孔再 分别 加25L 灭菌 生理盐 水 和 25 L 1%鸡 红 细胞悬 液。震荡 混匀，室 温（20 25）静置 30min，对 照孔 红细 胞呈纽 扣状 沉入 板底，进 行结果 判定。f)结果判 定：将反 应板 倾斜 60
10、，观 察红 细胞 有无 泪珠 状流淌，完 全无 泪珠 样流 淌（100%凝集）的最高 稀释 倍数 判为 血凝 效价。9.1.1.3 血凝抑 制试 验（HI）9.1.1.3.1 4 个血 凝单 位病 毒抗 原的 配置 根据HA 试验测 定的 效价配 制4个血 凝单 位（即4HAU）的病毒 抗原。例：以血凝 试验血 凝效价（凝 集终点）为10log2 或210（1：1024）为例，4HAU 为1024/4=256（1：256），在255 份生理 盐水 里加 入1份抗原。9.1.1.3.2 抗原回 测检 查 血凝抑 制试 验前 应对4HAU 抗原进 行回 测，调 整准 确。选 取96 孔V型板5 个
11、孔，在25 孔每 孔加 入25 L灭菌 生理 盐水，将 配制 好 的4HAU 抗原25L加 入第12 孔，从 第2孔 开始 按1：1、1：2、1：4、1：8、1：16 倍 比 稀 释，即 依次 形 成4HAU、2HAU、1HAU、1/2HAU、1/4HAU抗 原 浓 度；再分别 加 入 灭 菌 生 理 盐水25L和1%鸡红 细胞悬液25 L。震荡混匀，室温（20 25）静置30min，观察结果。若配置的4HAU抗原液准 确,则1：4 稀释 度将 出现凝 集终 点；如 高于4HAU,凝集 终点 将后 移，在 已 配 制好 的4HAU抗 原液 中添加等量 的灭菌 生理 盐水，二次回 测；如 低于4
12、HAU,凝 集终点 将前移，在 已配制 好的4HAU 病 毒抗原 液中 添加等量 的抗 原，二次 回测。DB 5304/T 060 2023 4 9.1.1.3.3 血清抗 体效 价测 定 a)在微量 反应 板的 第 1 孔 第11 孔加 入25 L 灭菌 生 理盐水，第 12 孔加 入50 L 灭菌 生理 盐水作为空 白对 照。b)吸取 25 L 血 清加 入第 1 孔内，充分 混匀 后，吸取 25L 加 入到 第 2 孔，依 次对倍 稀释 至 第10 孔，从 第10 孔吸 取 25 L 弃 去。第 11 孔 为抗 原 对照。c)1 孔11 孔 均加 入 25 L 4HAU 抗 原，在室 温
13、（2025）静置 30min。d)每孔加 入 25 L 1%鸡 红细 胞悬液，震荡 混匀，室温（20 25）静 置 30min，待 对照 孔（12孔）红 细胞 呈纽 扣状 沉入 孔底时 判定 结果。e)当抗原 对照 孔（第 11 孔）完全凝 集，且阴 性对 照血 清抗体 效价 不高 于 2log2 或 22（1：4），阳性对 照血 清抗 体效 价与 已知效 价误 差不 超 过 1 个 滴度时，试 验方 可成 立。以完全 抑 制 4HAU病毒抗 原的 最高 血清 稀释 倍数判 为该 血清 的 HI 抗 体 效价。9.1.2 结果判 定 血清HI 抗体 效价 3log2 或23判为HI试 验阴 性
14、；HI效 价4log2 或24判为HI 试 验 阳性。口蹄疫 9.2 9.2.1 免疫抗 体监 测方 法 酶联免 疫吸 附试 验（ELISA）9.2.1.1 液相阻 断ELISA 液相阻 断ELISA 试验 方法 按 照GB/T 18935 执 行；9.2.1.2 竞争ELISA 采用商 品试 剂盒 进行 检测，按其 说明 书进 行操 作。9.2.2 结果判 定 液相阻 断ELISA：按 照 GB/T 18935 执 行；商品 化ELISA 试 剂盒 按其 说明书 进行 判定。小反刍 兽疫 9.3 9.3.1 免疫抗 体监 测方 法 竞争ELISA 试验 方法 按照GB/T 27982 执 行
15、；采用 商品 化ELISA 试剂 盒进 行检 测，按 其说明 书进 行操 作。9.3.2 结果判 定 竞争ELISA：按 照 GB/T 27982 执 行；商品 化ELISA 试 剂盒 按其 说明书 进行 判定。新城疫 9.4 9.4.1 免疫抗 体监 测方 法 血凝和 血凝 抑制 试验（HA-HI），具体 试验 步骤 同9.1.1。DB 5304/T 060 2023 5 9.4.2 结果判 定 血清HI 抗体 效价 3log2 或23判为HI试 验阴 性；HI效 价4log2 或24判为HI 试 验 阳性。猪瘟 9.5 9.5.1 免疫抗 体监 测方 法 9.5.1.1 间接ELISA 间
16、接ELISA 检测 方法 按照GB/T 35906 执 行；9.5.1.2 竞争ELISA 采用商 品化ELISA 试 剂盒 进 行检测，按 其说 明书 进行 操作。9.5.2 结果判 定 间接ELISA：按 照 GB/T 35906 执 行；商品 化ELISA 试 剂盒 按其 说明书 进行 判定。猪繁殖 呼吸 综合 征 9.6 9.6.1 免疫抗 体监 测方 法 间接ELISA 试验 方法 按照GB/T 18090 执 行；采用 商品 化ELISA 试剂 盒进 行检 测，按 其说明 书进 行操 作。9.6.2 结果判 定 间接ELISA：按 照 GB/T 18090 执 行；商品 化ELIS
17、A 试 剂盒 按其 说明书 进行 判定。10 监测结 果记 录与 汇总 监测结 果记 录 10.1 实验室 完成 血清 抗体 检测 后，按要 求填 写试 验结 果 记录表。血凝 抑制 试验 填 写 血凝 抑制 试验 结果记录表（参见 附录 表C.1）；ELISA 试验 填写 ELISA 试验 结果 记录 表（参 见 附录表C.2）。监测结 果汇 总 10.2 以监测 县（市 区）、乡 镇（街 道）、规 模畜 禽场、行政村 为单 位，分 动物 病 种、动物 种类 等进 行结果汇总，填 写 血清 学监 测结果 统计 表（参 见附 表C.3）。11 血清留 样 血清检 测完毕 后，需要对 血清样 品
18、进行 保存 不少于15 天。样 品留 存填写 血 清 留样记 录表，(参见附录D)。12 无害化 处理 DB 5304/T 060 2023 6 实验完 毕后，及 时分 类收 集实验 室废 弃物。具 有感 染性实 验室 废弃 物应 进行 高压蒸 汽灭 菌或 放 入 消毒剂中 浸泡24小 时，移 交 专业医 疗废 弃物 或无 害化 处理机 构处 置。无 害化 处 理填写 实验 室废 弃物 处 理记录表，（参 见附 录E）。DB 5304/T 060 2023 7 A A 附录A（资料 性）实验室 血清 样品 采样表 表A.1 血清样 品采 样登 记表（散 养户）样品编号 样品所在县（市区）、乡镇
19、、村 畜主姓名 动物种类 年龄 免疫时间 疫苗类型 疫苗生产 厂家 畜主签字 备注 采 样时间：采样人 员：表A.2 血清样 品采 样登 记表（规 模场）养殖场（户）名称 场点地址（经纬度）联系人 电话 动物种类 存栏数 饲养批次 日龄 样品编号 疫苗类型 末次免疫时间 备注 被采样 单位（畜 主）：采 样时 间：采 样人 员：DB 5304/T 060 2023 8 B B 附录B（资料 性）实验室 样品 送检 及接 样登 记 表B.1 实验室 样品 送检 表 样品编号 样品所在地 样品来源 采样日期 动物种类 样品类型 健康状况 末次免疫时间 疫苗类型 疫苗厂家 疫苗批号 备注 县（市区）
20、乡 镇 村 畜主姓名 规模场 散养户 市场 屠宰场 饲养量 采样数量 饲养量 采样数量 饲养量 采样数量 饲养量 采样数量 填表人：联系电话：送样人：送样日期：负责人：表B.2 实验室 接样 登记 表 受理编号 检测流转编号 送检单位 送样人 样品类型 样品数量 送样时间 检测项目 送样人 联系电话 接样人 签字 备注 DB 5304/T 060 2023 9 C C 附录C（资料 性）实验室 检测 结果 记录 表 表C.1 血凝抑 制试 验结 果记 录表 检测流转编号 样品数量 检测项目 检测时间 试剂生产厂家 试剂生产批号 检测标准 4 HAU 检测 流水号 原始 编号 血凝抑制滴度 结果
21、 备注 21 22 23 24 25 26 27 28 29 210 抗原 对照 空白 对照 检测人 员：复 核人员：DB 5304/T 060 2023 10 表C.2 ELISA 试验 结果 记录 表 检测流转编号 样品数量 样品名称 检测时间 检测项目 检测方法 样品编号 检测结果 检测 流水号 原编号 结果 检测 流水号 原编号 结果 检测 流水号 原编号 结果 检测 流水号 原编号 结果 1 26 51 76 2 27 52 77 3 28 53 78 4 29 54 79 5 30 55 80 6 31 56 81 7 32 57 82 8 33 58 83 9 34 59 84
22、10 35 60 85 11 36 61 86 12 37 62 87 13 38 63 88 14 39 64 89 15 40 65 90 16 41 66 91 17 42 67 92 18 43 68 93 19 44 69 94 20 45 70 95 21 46 71 96 22 47 72 23 48 73 24 49 74 25 50 75 备注 检测人 员：复核 人员：DB 5304/T 060 2023 11 表C.3 血清学 监测 结果 统计 表 畜（禽）类 别：监测 方法 单位：个、份 监测范围 监测结果 合计 县 县（市区）乡（镇）村数 规模场数 散养户数 屠宰场数
23、市场数 规模场样品数 抗体合格数 合格率（%）散养户样品数 抗体合格数 合格率（%）屠宰场样品数 抗体合格数 合格率（%）市场样品数 抗体合格数 合格率（%）场户数 监测样品数 抗体合格数 合格率（%）合计 DB 5304/T 060 2023 12 D D 附录D（资料 性）血清留 样记 录表 受理编号 样品流转 编号 样品种类 数量 留存地点 留样时间 保存条件 留样负责人 备注 备注：样品 留存 不少 于15 天，根 据实 际需 要留 存。DB 5304/T 060 2023 13 E E 附录E（资料 性）实验室 废弃 物处 理记 录表 时间 处理物品 受理编号 数量（单位：份、重量）处理方法 处理人员 移交医疗废弃物处理时间 备注 处理物品：血清样品、组织样品、细菌培养物、废弃培养基、试验废弃物等 处理方法：高压灭菌、浸泡消毒、煮沸消毒、焚烧、其他