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1、微生物限度检查标准程序 1/6 微生物限度检查标准程序 1.目的：建立个微生物限度检查标准程序。2.范围：适用于各种原辅料、部分成品及验证的微生物限度检查的操作。3.职责：检验人员对本规程的实施负责。4.程序：41 总则：411 本法是指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。412 供试品应随机抽样。一般抽样量为检验用量（2 个以上最小包装单位）的 3 倍量。413 检查全过程应严格遵守无菌操作，严防再污染。414 除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为 3035，霉菌培养温度为 2528，控制菌培养温度为 361。415 检验结果的报告以 1g
2、、1ml 或 10cm2为单位。42 供试品的检验量 每批供试品检验量一般为 10g 或 10ml。供试品须取自 2 个以上的包装单位。4 3 供试液的制备 按供试品的理化特性及生物学特性可采取适宜的方法制成供试液。431 液体供试品 取供试品 10ml，加入稀释剂 90ml 中，混匀，作为供试液。432 固体供试品 称取供试品 10g，置 0.9%无菌氯化钠 100ml 中，用匀浆仪或其它适宜办法，混匀后，作为供试液。在制备过程中，必要时可加适量聚山梨酯 80，并适当加温，但不应超过 45。433 含抑菌成份供试品 供试品如干扰控制菌检验，可用下列方法处理后，依法检查。4331 稀释法 将供
3、试液种入较大量的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的微生物限度检查标准程序 2/6 浓度。4332 离心沉淀集菌法 取规定量的供试液，离心（每分钟 3000 转）30min，弃去上清液，留底部集菌液约 2ml，再稀释成原规定量的供试液。如有不溶性药渣，可将离心（每分钟 500 转）5min，取全部上层液，再行集菌处理。4333 薄膜过滤法 取规定量的供试液，置稀释剂 100ml 中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约 50mm，孔径不大于 0.45um0.2um 微孔滤膜的薄膜过滤器内，减压抽干后，用稀释剂冲洗滤膜 3 次，每次 50100ml，取出滤膜备检。4334 中和法 凡含磺胺、汞、砷
4、类或防腐剂的供试品，可用相应的试剂钝化活性因子，中和毒性后制成供试液。44 对照用菌液 控制菌检查均应做相应已知菌的对照试验。对照菌株为 大肠杆菌CMCC（B）44 102。取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养 物 1 白金耳，接种置营养肉汤培养基内，培养 1820 小时，稀释至 1:106。对照菌的加入量为 50100 个。45 检查法 451 细菌、霉菌计数 4511 平皿菌落计数法 45111 取均匀供试液，进一步稀释成 1:102、1:103等适宜的稀释级。分别取连续三级 10 倍稀释的供试液各 1ml，置直径约 90mm的平皿中，再注入约 45的培养基约 15ml，混匀，待凝固后，
5、倒置培养，每稀释级应作 23 个平皿。营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌计数。在特殊情况下，前者同时点计霉菌菌落数，后者同时点计细菌菌落数。45112 菌数测定阴性对照试验 取供试验用的稀释剂各 1ml 置于4 个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板，培养，分成品及验证的微生物限度检查的操作职责检验人员对本规程的实施负责程序总则本法是指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法包括染菌量及控制菌的检查供试品应随机抽样一般抽样量为检验用量个以上养温度为控制菌培养温度为检验结果的报告以或为单位供试品的检验量每批供试品检验量一般为或供试品须取自个以上的
6、包装单位供试液的制备按供试品的理化性及生物学性可采取适宜的方法制成供试液液体供试品取供试品加入稀过程中必要时可加适量聚山梨酯并适当加温但不应超过含抑菌成份供试品供试品如干扰控制菌检验可用下列方法处理后依法检查稀释法将供试液种入较大量的培养基中使该供试液稀释至不具抑菌作用的微生物限度检查标准程序浓度微生物限度检查标准程序 3/6 检查，不得长菌。细菌培养时间为 48h，分别在 24h 及 48h 点计菌落数，一般以 48h 菌落数为准。霉菌培养时间为 72h，分别在 48h 及 72h 点计菌落数，一般以72h 菌落数为准。菌落如蔓延生长成片，不宜计数。点计后，计算各稀释级平均菌落数，按菌落报告
7、规则报告菌数。45113 菌数报告规则 细菌宜选取平均菌落数在 30300 之间的稀释级，霉菌宜选取平均菌落数在 30100 之间的稀释级作为报告菌数计算的依据。如有 1 个稀释级在 30300（30100）之间时，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有 2 个稀释级在 30300（30100）之间时，按下式计算两级比值：高稀释级的平均菌落数稀释倍数 比值=低稀释级的平均菌落稀释倍数 当比值2 时，以两稀释级的均值报告，当比值2 时，以低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有 3 个稀释级的平均菌落数均在30300之间时，以后 2 个稀释级计算级间比值报告；如各稀释级的平均菌落数均不
8、在 30300 之间，以最接近 30 或 300 的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在 300（100）以上，按最高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释平均菌落数均小于 30 时，一般按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。如当 1:10（或 1:100）稀释级平均菌落数等于或大于原液（或 1:10）稀释级时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数。4512 培养基稀释法 取供试液（原液或 1:10、1:100 供试液）3 份，每份各 1ml，分别注入 5 个平皿内（每皿各 0.2ml）。每 1 个平皿倾注营养琼脂培养基约 15ml，混匀，凝固后，倒置培养，计数
9、。每 1ml 注入的 5 个平板的菌落数之和，即为每 1ml 的菌落数，共得 3 组数据。以 3 份供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。如各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于 1 时，则报告菌落数为小于 10 个。分成品及验证的微生物限度检查的操作职责检验人员对本规程的实施负责程序总则本法是指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法包括染菌量及控制菌的检查供试品应随机抽样一般抽样量为检验用量个以上养温度为控制菌培养温度为检验结果的报告以或为单位供试品的检验量每批供试品检验量一般为或供试品须取自个以上的包装单位供试液的制备按供试品的理化性及生物学性可采取适宜的
10、方法制成供试液液体供试品取供试品加入稀过程中必要时可加适量聚山梨酯并适当加温但不应超过含抑菌成份供试品供试品如干扰控制菌检验可用下列方法处理后依法检查稀释法将供试液种入较大量的培养基中使该供试液稀释至不具抑菌作用的微生物限度检查标准程序浓度微生物限度检查标准程序 4/6 452 控制菌（大肠杆菌）检查 4521 取胆盐乳糖培养基 3 份，每份各 100ml，2 份分别加入规定量的供试液，其中 1 份加入对照菌 50100 个作阳性对照，第 3 份加入及供试液等量的稀释液作阴性对照。培养 1824h（必要时可延至 48h）。阴性对照应无菌生长。4522 取上述 3 份的培养物各 0.2ml，分别
11、接种至 5mlMUG 培养基管内培养，分别于 5h、24h 时，取未接种的 MUG 培养基管作本底对照，将各管置 365nm紫外光下观察。阳性对照管呈现荧光，MUG 阳性。供试液的 MUG 管呈现荧光，MUG 阳性；无荧光，MUG 阴性。然后加数滴靛基质试液于 MUG 管内，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。4523 当阴性对照呈阴性，阳性对照正常生长，供试液胆盐乳糖培养基培养液澄明，并证明无菌生长，判未检出大肠杆菌。供试液 MUG 阳性，靛基质阳性，判检出大肠杆菌；MUG阴性，靛基质阴性，判未检出大肠杆菌。4524 如 MUG 阳性、靛基质阴性，或 MUG 阴性、靛基质阳性，均应取供试
12、液胆盐乳糖培养基培养物划线于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板，培养 1824h，如上述供试液培养物的分离平板无菌落生长，判未检出大肠杆菌。或有菌落生长，应挑选 23可疑菌落作靛基质试验（I）、甲基红试验（M）、乙酰甲基甲醇生成试验（V-P）、枸橼酸盐利用试验（C）及革兰染色、镜检，按表 1 规定判定结果。4525 靛基质试验（I）取可疑菌落或斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基中，培养 24h，沿管壁加入靛基质试液数滴，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。甲基红试验（M）取可疑菌落或斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养 482h，于管内加入甲基红指示液数滴，立即观察，呈鲜红色或橘
13、红色为阳性，呈黄色为阴性。乙酰甲基甲醇生成试验（V-P）取可疑菌落或斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养 482h，于每 2ml 培养液中加入-萘酚乙醇试液 1ml，混匀，再加 40%KOH 溶液 0.4ml，充分振摇，在 4h 内出现红色为阳性，无红色反应为阴性。分成品及验证的微生物限度检查的操作职责检验人员对本规程的实施负责程序总则本法是指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法包括染菌量及控制菌的检查供试品应随机抽样一般抽样量为检验用量个以上养温度为控制菌培养温度为检验结果的报告以或为单位供试品的检验量每批供试品检验量一般为或供试品须取自个以上的包装单位供试液
14、的制备按供试品的理化性及生物学性可采取适宜的方法制成供试液液体供试品取供试品加入稀过程中必要时可加适量聚山梨酯并适当加温但不应超过含抑菌成份供试品供试品如干扰控制菌检验可用下列方法处理后依法检查稀释法将供试液种入较大量的培养基中使该供试液稀释至不具抑菌作用的微生物限度检查标准程序浓度微生物限度检查标准程序 5/6 枸橼酸盐利用试验（C）取可疑菌落或斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基的斜面上，一般培养 4872h，培养基斜面有菌落生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变为阴性。结果判断见表 1。对及 MUG-I反应不符的可疑菌株（见注、），应重新分离培养，再作生化试验证实。表 1 MU
15、G的结果判断 MUG-I 曙红亚甲蓝琼脂 IMVic 结 果+检出大肠杆菌-未检出大肠杆菌+-无菌生长 未检出大肠杆菌+-有菌生长-+-检出大肠杆菌-+有菌生长+-检出大肠杆菌 注：、如出现+-或出现-+-，均应重新分离菌株，再作 MUG-I和 IMVic 试验。革兰阴性杆菌。5仪器和用具 51 操作台：检验操作在超净工作台内进行。工作台设在半无菌操作室内，室内设有紫外线灯使室内灭菌，室内装有空调设备，控制室温在2025。52 恒温培养箱：两台，各设定在 3537及 2426，分别作细菌和霉菌培养用。53 高压蒸汽灭菌锅 54 电热干燥箱：50300。55 扭力天平 56 酒精灯 57 玻璃器
16、皿：培养皿、刻度吸管、三角烧瓶、毛细滴管、刻度离心管、试管等。6试液（试剂）610.9%无菌氯化钠溶液 取氯化钠 9.0g，加水溶解使成 1000ml，121灭 分成品及验证的微生物限度检查的操作职责检验人员对本规程的实施负责程序总则本法是指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法包括染菌量及控制菌的检查供试品应随机抽样一般抽样量为检验用量个以上养温度为控制菌培养温度为检验结果的报告以或为单位供试品的检验量每批供试品检验量一般为或供试品须取自个以上的包装单位供试液的制备按供试品的理化性及生物学性可采取适宜的方法制成供试液液体供试品取供试品加入稀过程中必要时可加适量聚山梨酯并适当
17、加温但不应超过含抑菌成份供试品供试品如干扰控制菌检验可用下列方法处理后依法检查稀释法将供试液种入较大量的培养基中使该供试液稀释至不具抑菌作用的微生物限度检查标准程序浓度微生物限度检查标准程序 6/6 菌 20 分钟。62 95%乙醇。63 靛基质试液 取对二甲氨基苯甲醛 5.0g，加入戊醇(或丁醇)75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸 25ml 徐徐滴入，边滴边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深；或取对二甲氨基苯甲醛 1.0g，加入 95%乙醇 95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸 20ml 徐徐滴入。64 a-萘酚乙醇试液 取 a-萘酚 6.0g，加无水乙醇使溶解成 100ml。6
18、5 甲基红试液 取甲基红 0.1g，加入 95%乙醇 300ml，使溶解后，加水至 500ml，即得。66 40%氢氧化钾试液 取氢氧化钾 40.0g，加水使溶解成 100ml。分成品及验证的微生物限度检查的操作职责检验人员对本规程的实施负责程序总则本法是指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法包括染菌量及控制菌的检查供试品应随机抽样一般抽样量为检验用量个以上养温度为控制菌培养温度为检验结果的报告以或为单位供试品的检验量每批供试品检验量一般为或供试品须取自个以上的包装单位供试液的制备按供试品的理化性及生物学性可采取适宜的方法制成供试液液体供试品取供试品加入稀过程中必要时可加适量聚山梨酯并适当加温但不应超过含抑菌成份供试品供试品如干扰控制菌检验可用下列方法处理后依法检查稀释法将供试液种入较大量的培养基中使该供试液稀释至不具抑菌作用的微生物限度检查标准程序浓度