《westernblot问题汇总资格考试公务员考试_资格考试-公务员考试.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《westernblot问题汇总资格考试公务员考试_资格考试-公务员考试.pdf（5页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、WesternBlot 问题解答 1.凝胶肿胀或卷曲:注意转膜之前，切割下来的凝胶定要在转膜缓冲液中浸泡平衡 5-10分钟，要含有 20%的甲醇。2.条带歪斜、或漂移 因为转膜仪使用时间太长，两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄。当按照阴极-海棉-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧，因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙，电转移 时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走，形成如图所示的形状。使用十几张普通的草纸垫在两块海棉 之间，条带就可以变得非常的漂亮。另外，转膜时转膜液-定要浸没凝胶和膜，否则也可能出现上述情况。3单个或多个白点：转膜时在膜与胶之间有气泡。做三明治时定要逐层压紧，赶尽气泡。
2、同时 转膜液要提前配置好，加好甲醇，保证转膜前夜体内气泡排净。气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜，降低转膜效率。4、转膜缓冲液过热：缓冲液离（强度太低，或电压及电流过高。按照上述方式配液，同时转膜过程中注意降温。我在 冰水混合物中转膜，效果很好。5 背景过高！1）封闭不全，我用 5%-10%的光明脱脂奶粉，效果还可以，现在做基本上没什么背景。如果你觉 得不够可以加点 BSA,氓吧。2）抗或者是封闭液与膜蛋白的交叉反应。这种情况通常可以通过加入 TWEEN-20或多次洗膜加 以解决。如果问题不能解决，那么降低抗浓度，或更换封闭液种类可能解决 3）抗二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。4）抗体浓度太高，
3、或孵育时间人常都可能遇到这种情况。那么可以适当降低抗二抗的浓度，或是用提高温度的方式来代替杂交时间的延长；另外，少量多次得洗膜效果耍优于多量而长时间 得洗膜效果。5）曝光时间的控制。通常我们线曝光分钟试试，条带淸晰背景也强，可以缩短曝光时间，或者 过段时间等荧光减弱以后再发光，般也可以发出比较好的条带。如果背景强于条带，那么肯 定是前而默默个原因的种，这是可以将膜在 TBST 中漂洗以下再发光，有时会有比较好的效果（仅限于国外较好的试剂盒，国产的不行，洗下啥也没了！）这个时候可以洗膜，洗膜后重新 发光。6、没有信号：1）用单抗时比较容易出现这种情况。因为单抗主要是针对天然蛋白，这个时候.TWE
4、EN-20的作用 就显现出来了，它可以增加抗原抗体复合物与膜的结合。2）确信你的蛋白农达 3）确信蛋白高效的转移到你的膜上 4）抗二抗的效价问题。无论哪个无效都不能发光，因此预实验-定要从最低的稀释度开始，以 排除抗体的因素 5）ECL 试剂盒质量的问题，不可小觑。偶亲身经历。碰到批次品。两个月白搭！7、微虽进样器堵了怎么办？首先从预防入手，每次用后的进样器及时用蒸谓水清洗！如果堵了，不要紧，有办法：可以用如下办法解决：1）首先反复推拉上样针，看是否可将堵塞物吹岀来：2）方法 1 不灵，若是 25 或 50ul 的针，把针从后侧拔出，然后重新插入，使其内部产生气压，可能压出堵塞物质：）如上述方
5、法不灵可以在拔出后注入些淸水，然后重新插入，用水压排出，3.4）最后的方法，最灵的方法：开始步骤同第 3 种方法中，在加入水后，将上样器的前端针部放 在酒精灯上锻烧至红色（估计在什么位置堵的），注意烧红部分不要距离玻璃过近，然后，趁热 突然推针，将水强行推出，通道打开后，再通过稀酸或稀碱冲洗即可！5）或者放在超声淸洗仪里，超声试试 注意，切记在推拉过程中小心不要把针弄弯 8.关于 SDS 蛋白电泳的一点心得 最近在做蛋白电泳时候遇到了些麻烦，在这里发了帖 J；，并且得到了很多同人的恢复。本人在看 过回帖后，结合自己的试验，重新设计 J方案，得到了满意的结果，同时感觉有必耍拿来和人家 分享：1）
6、蛋口电泳中出现的纵向条带：原因主妥是由于电泳样品或是电极缓冲液中有没有溶解的样品 颗粒所致，上样前充分将样品离心，或重新使用新配电极缓冲液即可解决。2）电泳条带前沿在染色脱色后呈尖形。原因是由于上样量人且工作电压过人引起，我实验中采 用90/120,后来改用了 80 并且不换电压；同时减少上样量到原来的半，得到了满盘的结果（我 的样品分子量 18000 Da,15%的分离胶）；3）电泳结束后，染色脱色结果整个胶而呈现蓝色，背景很重怎么也脱不去，改用新配的电极缓 冲液。问题解决。是电极缓冲液污染的结果（平时本人有个坏毛病：喜欢在缓冲液中涮上样针,导致缓冲液污染）=9.分别用多大电流转膜？1）般跟
7、你的分离胶的浓度有关。2）与你的转印系统型号有关！3）与目的蛋口的分了量有关 1 般 50KD 左右的蛋白，50mA,1.5h：10.好几个蛋白，我做免疫荧光都做得很好，抗体说明也是可以用于 western 的，可是就做不出 来！显影后只有很弱的非特异带。而另个蛋白，perk 却做得很好，操作都是样的，抗体稀 释也是按厂家说明的。D 你用的是单克隆抗体吗？如果是的话，请注 western 是在蛋白质变性的条件下进行的，活 性状态下可以反映的抗体在变形状态下却不定特异性很强,可能其他的蛋白质变性之后产生了 能与之反映的抗原决定簇！另外，耍做好对照！抗体是什么公司的？有的公司会将康体稀释后再卖（奸
8、商），所以抗体的滴 度，根据公司的要求也不一定准！2）如果是单抗，页 estern blotting 电泳后蛋亡 I变性，构象衣位可能消失，仅存在线性衣位，单 抗可能不识别。所以 WESTERN BLOTTING做不出来了。11.我的 WESTERN 为什么出现了多条带，每个加样槽中都出现 f 多条带，而且好象都很有规律，为什么？是封闭时间不够吗？请指教我做 WESTERN 是想知道处理后细胞分泌细胞因子数量的变 化，这样必须要内参吗？可能性 1）抗、或二抗抗体浓度太高 2）多克隆抗体本身的非特异性反应 3）抗体的特异性不强 或漂移因为转膜仪使用时间太长两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄当按
9、照阴极海棉滤纸胶膜滤纸海绵依次放好后两块板不能压紧因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走形成如图所示的则也可能出现述情况单个或多个白点转膜时在膜与胶之间有气泡做三明治时定要逐层压紧赶尽气泡同时转膜液要提前配置好加好甲醇保证转膜前夜体内气泡排净气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜降低转膜效率转膜缓冲液过热缓冲液离闭不全我用的光明脱脂奶粉效果还可以现在做基本没什么背景如果你觉得不够可以加点氓吧抗或者是封闭液与膜蛋白的交叉反应这种情况通常可以通过加入或多次洗膜加以解决如果问题不能解决那么降低抗浓度或更换封闭液种类可4）蛋白异构体或降解！5）你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内
10、参的条带基本均匀致。这样才有说服力，衣明的确 是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化。所以严格 意义上说，内参事必须做的。.12.转膜的时候，最下端的蛋口条带很淸楚，可是上边啥都没有看见，社么原因？1）可能是时间不够，因为般是分了量小的先转上去的，人的后转，看你的目的蛋a r.如小的 话，最后 不要太长时间 2）转膜的时间要根据你的目标蛋白人小和胶浓度而定。蛋白越人、胶浓度越高，时间就要越长。经验是：12%-18%的胶、4 18kD 的蛋白用 100v 衡压/350mA 衡流 75-90min的条件都可以成 功转膜 3）主妥是转膜时间不够，若想证明这个问题，可
11、把原来的 SDS-PAGE,做下染色，看看人分/量的蛋白是否仍在胶上。力外，做 western lit，转膜并不是最复杂的，但无疑是很重要的，如果 胶上残存的目的蛋白过多，会使与抗体结合的蛋白负荷不足，而影响实验结果，因而要反复摸索 转膜时的时间、电压/电泳，直到获得满意转膜效果。WB 的关键点我觉得有下几个：是样品的处理：二是电泳和转膜条件的摸索；三是保证试剂、抗体的质量。13.western blot 怎样做内参照阿？1）可以转膜后先用目的蛋口的抗体做杂交，将抗体洗掉，再用内参蛋口的抗体重新杂交，结果 显示信号亮度-致，认为上样量-致:。2）同样条件做两块胶，等虽上样，同时转膜：块做内参蛋
12、白，块做目的蛋白。3）只做块胶，用蛋口 marker 做标记，转膜后用丽春红染色，可见到 42kd（3-actin）左右 处有浓染的条带，在 42kd 略上方将膜剪开分别作杂交即可。要求目的蛋白和内参蛋白人小有-定的差异。转人分了量的蛋白可以在转膜液中加入 SDS 至 0.05%,并且可以适当减少甲醇用量，如 15 賀的甲 醇 电泳中 SDS 是十二烷基硫酸钠。十二烷基磺酸钠简称为 SAS,两者的区别是其中 S 的化合价不同，各是多少没去考证。由于最初翻译者将 SDS 翻译为十二烷展礦酸钠，彼很多书籍引用，故十二烷 基磺酸钠为误称。真正的十二烷基碘酸钠不能用于 WESTERN。14.胶为什么总
13、是漏？1）每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件，下次用之前，用 75%酒精擦拭玻璃和胶条,能有效防漏，且利于剥胶。2）避免玻璃边缘（与胶条接触处破损很重要，尤其是下面和胶条接触的地方 3）关键是找块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了 4）胶条定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。5）下面的胶条注总不要老化，如果有裂纹的话用保鲜膜垫在上面，也可以有效防止漏胶，或 者反过来用 玻璃在使用过程中容易造成小的缺口，从而导致封条无法完全密封，装好架 f 后，6.在玻璃底边上抹上层薄薄的凡士林就好了，两边多点（容易从两边漏）这样就不会漏了，就算 是用了很久的很多小缺口的玻璃都没有问题，然后转移
14、到电泳槽的时候，去掉封条，把底上的凡 十林擦干就OK f（注意，定要擦干净，尤其是少虽进入厂两隔玻璃之间空腔的，贏伟凡士林 不导电，会影响第 2相的效果的 7）你可以在海绵垫下再垫些纸，使得它与玻璃贴的更紧密。或者在玻璃底部用琼脂糖封上。8）因为两块玻板没有放的完全对齐，底部不在同个平面，所以封条封不严，重新对齐后就 不漏了。以后每次只要在水平的桌面上仔细对齐两块玻板，再夹紧。用手感觉下确定在同平 面上后，放到灌或漂移因为转膜仪使用时间太长两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄当按照阴极海棉滤纸胶膜滤纸海绵依次放好后两块板不能压紧因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中
15、流走形成如图所示的则也可能出现述情况单个或多个白点转膜时在膜与胶之间有气泡做三明治时定要逐层压紧赶尽气泡同时转膜液要提前配置好加好甲醇保证转膜前夜体内气泡排净气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜降低转膜效率转膜缓冲液过热缓冲液离闭不全我用的光明脱脂奶粉效果还可以现在做基本没什么背景如果你觉得不够可以加点氓吧抗或者是封闭液与膜蛋白的交叉反应这种情况通常可以通过加入或多次洗膜加以解决如果问题不能解决那么降低抗浓度或更换封闭液种类可胶架并压在封条上，卡紧。注意两边均匀用力，般不会再漏。9）先把两块玻片放在夹了上，不要加紧，放到架子上，使两块玻片的底部对齐，夹紧两块玻 片，然后取下再在其下血垫上垫片，这样般就
16、不会漏胶了。但是如果你放了垫片再对齐玻片底 部，或考在桌（上对其玻片底部然后放到架了上的话，经常会漏胶 15.条带跑得比正常的窄？1）可能因为胶凝的不均匀，聚合的不是很好，灌胶的时候尽虽混匀 2）是不是有窄有宽？可能与你拔梳/的时候有关，拔梳应该迅速，冲洗加样孔的时候要小心，以免把上样带扭曲；胶配好了用枪吹几下再灌胶，还有就是要等指示剂跑到两层胶交界成线时,再调高电压。3）可能是你样品的问题，如果盐浓度较高，便会挤压其它条带，致使条带宽窄不由于同样 的原因，样品在凝胶中的速度会很慢，造成条带走的较慢，好像与你的预想不致 4）常见的原因是：每孔上样量不均匀，应确保每孔中上样量一致 5）可能是系统
17、的 ph Hl Y 问题，有可能是你的电极缓冲液，也有可能是凝胶缓冲液，更新缓冲液 看看，看是否能成功 16.为什么会有“微笑”和“倒微笑”这样的效果呢？1）微笑是因为你灌胶的时候冷却不均匀，中间部分冷却不好，导致凝胶中的分 有不同的迁移 率所致。这种情况在较厚的凝胶以及垂宜电泳时常常发生。“倒微笑“也称“皱眉“现象常常是 由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的三明治底部有气泡或 靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象 2）书上说出现“微笑”是因为整个胶冷凝的不均匀，中间部分和两端受热不样而致成了“倒 微笑”可能是因为两端的胶凝的不好，加 APS 和 TEMED
18、后应该混合均匀。3）样品中盐浓度过高？点样量人多或每孔点样虽不均匀？电泳电压不稳定或过高？17.Western-blot制胶时好多泡泡怎么办？1）首先，玻璃板-定要洗干净，用洗洁净洗，冲干净后再用双蒸水冲-，晾干。配胶的时候沿 管壁缓缓加入各个成分，混匀的时候用手轻轻摇匀，如果用枪吹打时耍缓慢且不耍打到头。2）配胶时混匀要轻，尽量不产生气泡，上胶时耍快，枪也不打到底。加完分离胶后用双蒸水封，待其凝固。即使在上胶时液而上有气泡，加水后也会浮上来。分离胶凝好后，倒掉里面的水，用 吸水纸吸干，再加浓缩胶，迅速插梳子。3）倒胶的时候，用 1ml 的枪沿侧缓缓加入，不要打到头，以免带入气泡！4）将胶在小
19、烧杯里配好后，将电泳槽略微倾斜，将烧杯的嘴靠在玻璃边缘，自接倒进去，速度 快，而且不容易产生气泡，不妨试试 5）用双蒸水封时建议用 200U1 的枪加水，这样压力小，以免把胶冲起来！6）国产的只能是缓慢加样，别把气泡加进去。如果加进去了，小心把整个板在桌上敲敲可以让 气泡浮上来。5-10）分离胶中的气泡与插梳 f 有关，垂直插容易产生气泡，且不容意捋除。将梳了倾斜 7.度插入，即使产生气泡也可以也可以通过轻轻晃动梳子使气泡从侧逸出。8）pinghw 还有个制胶起泡泡的原因，就是配胶的液体全部在四度存放，室温制胶时由于温差 及凝胶聚合反应放热的关系，液体中微小的气泡在凝固的凝胶中也会放人成可见的
20、较人的泡泡,这种情况在夏天室温较高时更容易出现。避免的力法是将制胶成分中除催化剂外的部分配置后放 室温下静置-会儿，减小温差后再加入催化剂制胶。18.一些琐碎的细节，但却是实验中可能经常遇到的令人头痛的问题：1）安装好的制胶装置，最好先用配置电泳缓冲液的水加满检验下是否漏水，检验确认不漏水 的装置或漂移因为转膜仪使用时间太长两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄当按照阴极海棉滤纸胶膜滤纸海绵依次放好后两块板不能压紧因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走形成如图所示的则也可能出现述情况单个或多个白点转膜时在膜与胶之间有气泡做三明治时定要逐层压紧赶尽气泡同时转膜液要提
21、前配置好加好甲醇保证转膜前夜体内气泡排净气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜降低转膜效率转膜缓冲液过热缓冲液离闭不全我用的光明脱脂奶粉效果还可以现在做基本没什么背景如果你觉得不够可以加点氓吧抗或者是封闭液与膜蛋白的交叉反应这种情况通常可以通过加入或多次洗膜加以解决如果问题不能解决那么降低抗浓度或更换封闭液种类可再用于制备凝胶。确认不漏水后，倒出水，然后使其尽虽流出，其实残留的点水并不 影响结果，而且还会使电泳好的凝胶容易剥落下来。漏水的装置制作的凝胶尽管可以使用，但 它会造成电泳时候电流的分流，不但影响电流的效率，而且还会使部分加样孔的条带歪曲。2）制胶时最好最后加入 AP,这样可以避免偶然情况下不能
22、马上灌胶而导致胶的聚合，确认所 有的东西准备齐全了，再最后加入 AP,混合均匀后马上灌胶。定要使配胶的几种溶液混合均 匀，这是制得性质均的凝胶的前提。3）进口的 AP 可以很快使胶凝聚。所以，AP 的用量最好比书上推荐的用量少点，这样可以使胶 的溶液慢慢聚合，这更有利于形成均匀一致的凝 胶。也不会使操作变得手忙脚乱。4）有时候，梳了拉出以后，明明看不到加样孔中有凝胶，但是就是加不进去样品，这主要是由 于梳 f与较人的那块玻璃之间的缝隙中存留的制胶溶液凝聚后形成的很薄的层凝胶造成的。由 于很薄，当梳了拉出后，它就会和玻璃分离，刚好将加样孔的口封住了，如果用 20ul 的加样器 加样的话，这层凝胶
23、很容易将样品堵在外而，只要将这层凝胶除去，就可以顺利加样了。如果用 专门的微量进样器，不会存在这样的问题。5）薄膜原因可能是由于梳了和 slide 的厚度不是十分致，而这可能是无法避免的。除此之外，也有由于拔出梳 f时候造成的堵塞现象，个人认为，这样的堵塞现象可以通过插入梳了时先用水（配置电泳缓冲液的水）湿润梳 f 的方法避免，这样还有利于形成整齐的加样孔。不管怎么做，定要等胶完全聚合好了再拉出梳如果孔的形状变化了，扭曲了，肯定会导致条带不致，结果不好。6）wangjun2002274 主任的:加样的时候也是用专门的微量进样器,是宁波出的,50ul 容量,每次都是用20ul 的上样量。以前等胶
24、干后拔出梳马上用水冲洗进样孔，就是用的那种塑料 瓶挤压冲洗，薄膜就没有了，注意不要用力过猛，如果胶还没有完全凝，很可能导致进样孔不整 齐，那么跑出来的条带就有窄有宽了 将变性的和不变性蛋白同时加样，相同浓度的抗体反应后，不变性的条带也可见，但明显较弱。其原因，查资料后认为蛋白的某些抗原性被其天然的结构所掩盖，通过蛋白变性可使其抗原农位 暴露。而且，现在的抗体都是用细菌衣达的某段融介蛋白并且变性后来诱导产生的血清，与体内 真正的蛋白有区别的，因此需耍通过煮沸来变性体内蛋白，暴露需耍的抗原部位。SDS 主要为统 一不同蛋白的电荷，去除其对电泳迁移率的影响。抗孵育：分别与相应的抗体（初次做建议按照试
25、剂要求的最高浓度开始，别舍不得，否则没结 果更难受），及内参照抗体（P-actin抗体 1:10 000,这蛋白抗体效价特别高，所以预实验做 下般会有阳性结果，.旦没条带可以扌II：除你的实验操作中的因素）于室温温育 90min,4 C 过 夜,再次室温温育60mino抗体稀释液为 TBST（内含 1賀的 BSA）（其实直接室温 2h 就够了，背景 老是太高放 4 度过夜有时候对降低背景效果不错）。19.漂洗：室温下以 TBST 液在平缓摇动条件下漂洗 3次以上，每次各 5mino動换液比延长漂洗 时间更有效。否则粘糊糊的，很重耍！以后再收藏，晾干不划伤，冲干净胶片，要用 H来水显影定影完毕，
26、很容易把你本来漂亮的条带给破坏了，这里出岔子就功亏一箸了！配胶准备：将玻璃板、梳/有清洁剂或稀酸泡洗，电泳装置用水冲洗并晾干，亦可用酒精棉球擦 洗灌胶而晾干 或漂移因为转膜仪使用时间太长两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄当按照阴极海棉滤纸胶膜滤纸海绵依次放好后两块板不能压紧因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走形成如图所示的则也可能出现述情况单个或多个白点转膜时在膜与胶之间有气泡做三明治时定要逐层压紧赶尽气泡同时转膜液要提前配置好加好甲醇保证转膜前夜体内气泡排净气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜降低转膜效率转膜缓冲液过热缓冲液离闭不全我用的光明脱脂奶粉效果还可以现在做基本没什么背景如果你觉得不够可以加点氓吧抗或者是封闭液与膜蛋白的交叉反应这种情况通常可以通过加入或多次洗膜加以解决如果问题不能解决那么降低抗浓度或更换封闭液种类可