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1、枯草芽孑包杆菌常用培 养基配方枯草芽孢杆菌常用培养基配方 枯草芽抱杆菌常用培养基配方：11 蒸馏水+20g 葡萄糖+15g 蛋白胨+5g 氯化钠+0.5g 牛肉膏+20g 琼脂 枯草芽抱杆菌原生质体的制备 1 培养枯草芽抱杆菌 取亲本菌株 t4412、tt2 新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基（cm）的试管 中，36 C振荡培养 14 h，各取 1 ml 菌液转接入装有 20 ml 液体完全培养基的 250 ml 锥形瓶中，36 C振荡培养 3 h，使细胞生长进入对数前期，各加入 25 u/ml 青霉素，使其终浓度为 0.3 u/ml，继续振荡培养 2 h。2 收集细胞 各取菌液 10 m
2、l，4000 r/min 离心 10 min，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲 液中，离心。如此洗涤两次，将菌体悬浮 10 ml smm中，每 ml 约含 108 109 活菌为宜。氯化钠牛肉膏琼脂枯草芽抱杆菌原生质体的制备培养枯草芽抱杆菌取亲本菌株新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基的试管中振荡培养各取菌液转接入装有液体完全培养基的锥形瓶中振荡培养使细胞生长进入对数前期各加入青菌体悬浮中每约含活菌为宜总菌数测定各取菌液用生理盐水稀释取各每稀释度作两个平板倾注完全培养基培养后计数此为未经酶处理的总菌数脱壁二株亲本菌株各取菌悬液加入溶菌酶溶液溶菌酶浓度为混匀后于水浴保温处理定时取质体悬浮于高渗缓
3、冲液中立即进行剩余菌数的测定剩余菌数测定取上述原生质体悬液用无菌水稀释使原生质体裂解死亡取稀释液各涂布于完全培养基平板上培养生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞计算酶处理后剩余细胞数并分3.总菌数测定 各取菌液 0.5 ml，用生理盐水稀释，取 10-5、10-6、10-7各 1ml（每稀释度作 两个平板）、倾注完全培养基，36 C培养 24 h 后计数。此为未经酶处理的总菌 数。4.脱壁 二株亲本菌株各取 5 ml 菌悬液，加入 5 ml 溶菌酶溶液，溶菌酶浓度为 100 ug/ml，混匀后于 36 C水浴保温处理 30 min，定时取样，镜检观察原生质 体形成情况，当 95%以上细胞变成球
4、状原生质体时，用 4000 r/min 离心 10 min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，然后将原生质体悬浮于 5 ml 高渗 缓冲液中。立即进行剩余菌数的测定。5.剩余菌数测定 取 0.5 ml 上述原生质体悬液，用无菌水稀释，使原生质体裂解死亡，取 10-2、10-3、10-4稀释液各 0.1 ml，涂布于完全培养基平板上，36 C培养 24 48 h，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。计算酶处理后剩余细胞数，并分别计算二亲株的原生质体形成率。原生质体 形成氯化钠牛肉膏琼脂枯草芽抱杆菌原生质体的制备培养枯草芽抱杆菌取亲本菌株新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基的试管中振荡培养各取菌
5、液转接入装有液体完全培养基的锥形瓶中振荡培养使细胞生长进入对数前期各加入青菌体悬浮中每约含活菌为宜总菌数测定各取菌液用生理盐水稀释取各每稀释度作两个平板倾注完全培养基培养后计数此为未经酶处理的总菌数脱壁二株亲本菌株各取菌悬液加入溶菌酶溶液溶菌酶浓度为混匀后于水浴保温处理定时取质体悬浮于高渗缓冲液中立即进行剩余菌数的测定剩余菌数测定取上述原生质体悬液用无菌水稀释使原生质体裂解死亡取稀释液各涂布于完全培养基平板上培养生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞计算酶处理后剩余细胞数并分率二未经酶处理的总菌数一酶处理后剩余细胞数。氯化钠牛肉膏琼脂枯草芽抱杆菌原生质体的制备培养枯草芽抱杆菌取亲本菌株新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基的试管中振荡培养各取菌液转接入装有液体完全培养基的锥形瓶中振荡培养使细胞生长进入对数前期各加入青菌体悬浮中每约含活菌为宜总菌数测定各取菌液用生理盐水稀释取各每稀释度作两个平板倾注完全培养基培养后计数此为未经酶处理的总菌数脱壁二株亲本菌株各取菌悬液加入溶菌酶溶液溶菌酶浓度为混匀后于水浴保温处理定时取质体悬浮于高渗缓冲液中立即进行剩余菌数的测定剩余菌数测定取上述原生质体悬液用无菌水稀释使原生质体裂解死亡取稀释液各涂布于完全培养基平板上培养生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞计算酶处理后剩余细胞数并分