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1、种传病毒的检测方法一一原理和方案1、前言病毒和类病毒是两类独特的病源，和其他病源，如真菌和细菌相比完全不一样。 病毒是一类颗粒，此颗粒由蛋白质外壳和核酸组成。绝大多数植物病毒的(基因组) 核酸是单链RNA；只有一小部分植物病毒的基因组是双链RNA或者DNA。类病毒是 迄今为止已知最小的植物病源体；它只含有单链环形RNA,并不含蛋白质外壳。马铃 薯纺锤体茎病就是由类病毒引起的植物疾病之一。病毒和类病毒一样都没有蛋白质合 成体系，而是完全依靠宿主(Hull, 2023)o许久以来，科学家们认为病毒经由种子从病株传播到后代只是偶然的现象。时至 今日，我们已经知道，在已知的植物病毒中大约有七分之一可以
2、经由种子从病株传播 到后代(Hull, 2023),并且此类病毒的数量正与日俱增。病毒种传的三个重要影响是: (i)对作物造成干脆损伤或间接损伤，因为即便是种植了很少量的带毒种子，也会 造成病毒病源大量地、随机地扩散，从而有利于寄主对病毒的二次传播；(五)病毒 可以在农作物一季又一季的耕作中存活下来；(iii)毫无疑问的一点就是，带毒种子 的贸易使得某些病毒和类病毒在全世界传播开来。1. 1种传病毒和类病毒如今，大家都已经知道，病株的种子中往往会出现多种病毒的身影，但是这些种子 并不能把病毒传递给子代，只能说这些病毒能在种子中生存，而并不是所谓的种传病毒。 种传病毒的一个主要特征就是它们都能够
3、侵染种子胚胎。当然也有例外，比如说烟草花 叶病毒属的某些病毒并不能进入种子的胚胎，但是可以在种子上稳定存活，从而侵染子 代。2023年，Hull对各属病毒中种传病毒的种类进行了统计。其中，隐病毒属中含有 31种种传病毒，这些病毒往往不会造成多大的经济损失，一般经由种子和花粉传播。 种传病毒所占比例相对较高的病毒属有：苜蓿花叶病毒属(1/1),就豆花叶病毒属 (6/15),黄瓜花叶病毒属(3/3),烟草线条病毒属(8/17),线虫传多面体病毒(17/40), 马铃薯Y病毒属(16/179),南方菜豆花叶病毒属(4/14),烟草花叶病毒属(7/17)和 烟草脆裂病毒属(3/3),而在诸如香石竹环斑
4、病毒属，黄矮病毒属，玉米雷亚多非纳病 毒属以及纤细病毒属中并没有种传病毒。在双生病毒属(102种)中也没有种传病毒。 在已知的28种类病毒中有10种是种传病毒。附录一列出了种传病毒和类病毒以及它们 所属的病毒属、种名，而表4.1则就对农业生产造成巨大损失的34种病毒和类病毒以 及它们的主要宿主一一列出。1. 2种传病毒的探讨历程1910年，Westerdijk首次怀疑烟草花叶病毒在番茄上存在种传现象，在随后的很 长一段时间里，科学家们先后发觉BCMV在黄豆上、黄瓜花叶病毒在野生黄瓜上、葛 苣花叶病毒在其苣上、蚕豆花叶病毒在蚕豆上存在种传现象。截止到1951年为止，只 发觉了 6种种传病毒，但仅
5、仅过了六年之后，人们就在40种植物上发觉了 20种种传病 毒。到了 1964年，种传病毒的种类已经达到36种，而宿主的数量也达到63种，而1969 年种传病毒的种类则达到47种，1974年85种，到1988年时，据Agarwal和Sinclair 的估计种传病毒的数量则多达156种。自从1951年之后，科学界先后有多篇有关种传病毒的综述发表，比如， Bennett(1969), Bos(1977), Neergarrd(1977), Mandahar(1981), Mink( 1993)以及 Johansen et al. (1994)0其中，Mink于1993年发表的综述主要针对种传病毒探讨
6、中出现的问题 进行了修正，他发觉很多病毒被误归为种传病毒，并认为108种病毒(除隐病毒属之外) 和七种类病毒可以归为种传病毒。从那以后，种传病毒新的发觉以及病毒分类原则的更 改所导致的变更就时时地在种传病毒名称列表中体现出来。附录一中的内容也相应地进 行更新(但并不肯定完全)。在本书以后章节中出现的种传病毒缩写形式的全名以及种 传病毒的归属请参见表4.2o种子在植物病毒传播生态学上的重要性越来越受到各界的重视，从而也导致了国 际上检验检疫机构对种子健康加大了检查的力度。与此同时，科学界对于多种杂草作为 种传病毒的宿主以及除非杂草得到限制否则杂草种子将成田间病毒库等问题的相识日 渐清楚。1. 2
7、. 1从种子中检测病毒种子中检测病毒即使一门科学又是一门技术，它被种子检测站和植物检疫试验室用 来从大批的种子中筛选出具有耕种价值的种子。最早用来检测种子是否携带病毒的方法是检测由种子培育的幼苗，也就是所谓的生 长试验。该方法最早被Fajardo用于从大豆中检测BCMVo后来该方法又被Mckinney 用于从稗草中检测稗草条状花叶病毒，此外Rohloff和Hampton还把该方法用于检测葛 苣花叶病毒。在生长试验中，Rohloff (1966)和Phatak (1974)都认为光线的强度以 及光源的类型对病毒症状的形成起着至关重耍的作用，同时，病毒的株系以及宿主的种 类也同病毒在幼苗上症状的发
8、生有着紧密的关系。与此同时，Lister和Murant探讨发觉，种子在受到由线虫所传播的病毒侵染之后的 特征就是在生长试验时不显示症状。由于病毒在种子中的潜藏性或者症状不明显以及由 其它因素所引起的症状和带毒症状之间的相像，从而使得种传病毒的探讨人员意识到在 生长试验之外必需辅以生物学或者血清学的检测。尽管如此，生长试验在探讨种子携带 子株传播病毒方面依旧具有无可比拟的优势。Quantz发表了检测BCMV的方法，首先, 接种超敏大豆株系Top Crop的初叶，然后将初叶剪下，接着将初叶放在培育皿中的 潮湿滤纸上于32下用恒定人造光孵育3天。后来，在1962年，这种方法又被用来从 大豆种子中检测
9、病毒，略微的修改是让种子在滤纸上预先萌发3-4天。用生物学方法从 葛苣种子中高灵敏地检测茯苣花叶病毒领先由Pelet和Gagnebin于1963年提出，随后 在1967年又得到Marrou和Messiaen的补充，详细的方法是，把葛苣种子在缓冲液中 磨成粉末然后接种在昆诺阿黎的幼苗上,运用该方法可以从700粒种子中检测出一粒带 毒种子。Hamilton (1965)是领先把血清学技术应用于从种子中检测病毒的人之一，详细的 做法就是，把从大麦种子中分别出来的胚压碎涂在小的滤纸盘上，然后把滤纸盘放在琼 脂上，琼脂的另一侧则放着浸满BSMV抗血清的另外一块滤纸盘，假如稗草种子的胚 受到BSMV侵染的
10、话，则琼脂上则呈现用肉眼就可见到的沉淀。在琼脂中加入去污剂 可以防止病毒粒子凝聚的同时也可把病毒裂解成具有迁移实力的抗原，从而提高检测的 灵敏度。病毒和病毒抗血清所形成的特异性条带在大约48小时后依旧可见。后来，Slack 和Shepherd对用琼脂法从小麦和稗草种质中检测BSMV的方法进行了改良，形成了所 谓的放射扩散法。在该法中，把种子刚刚萌发所生成的小叶片(1mm)压进琼脂中， 在琼脂中含有稀释过的抗血清、去污剂以及叠氮化钠。此外，此处制备的抗血清是抗经 四氢毗咯消解的病毒蛋白，因此，针对完整病毒颗粒制备的抗血清和经去污剂降解的病 毒粒子之间反应较弱。在经过24-36个小时的孵育之后，可
11、以用立体显微镜视察结果。 该方法可以在直径为9cm的琼脂盘上同时视察500-600个样品，其优点就在于可以干 脆计算带毒率，与此同时，没有携带病毒的种子就可以干脆生长，于是就使得种质资源 得以保存。在美国蒙大拿州，这两种检测方法都已经成为种子商品评级的常规方法。截 止20世纪七十年头中期，适用于其它病毒的血清学检测方法也相继成型。其中之一便 是由Bercks于1967年开发的乳胶凝集测试。此法相对凝胶扩散法而言具有很高的灵敏 度，已发表的文章中称其是检测大麦中BSMV的可行方法。电镜是分析病毒的一件利器，但它并不适用于种子是否携带病毒的常规检测，但是, 由Derrick于1973年开发的免疫吸
12、附电镜却时常被用来检测种子是否带毒或者被用于 校正其它检测方法所得结果的合理性。在本书5.5中就早期抗血清方法以及免疫吸附法 的基本原理进行了简短的介绍。和20-30年前相比，现如今我们已经可以用高灵敏度以及高保真的方法来检测病 毒以及检测种子是否携带病毒。在基于抗体的检测方法中，酶联免疫反应法最常常被运 用，它的优势在于操作简便、高灵敏度、高保真、适于大规模检测以及部分步骤自动化。 建立在核酸为基础上方法，特殊是PCR,以其高特异性和奇高的灵敏度，越来越多地 被用于植物病毒检测，其中就包括检测种子是否携带病毒。尽管PCR法在原理上简洁 且在病毒检测上有着明显的优势，但是PCR法和酶联免疫反应
13、法相比其缺点依旧很明 显，如操作起来不简便以及不适用于大规模检测。目前，科学界对改善和简化PCR方 法的探讨正在紧锣密鼓地进行中。1. 3种传病毒的经济危害一旦农作物受到病毒的侵染，它将终身与病毒为伍，且往往会导致产量的损失。 单从每年来看，这个损失就相当大，但对于果树这种多年生作物来讲，病毒侵染后的危 害更为深远。在世界上，90%的粮食作物是通过种子繁殖的，因此，由于种子携带的病 源，包括病毒，所造成的经济损失是相当巨大的。种传病毒所造成的经济损失包括产量 锐减或者品质下降等干脆损失也包括用于限制作物病势所耗费的间接损失。如前所述, 在高效寄主存在的状况下，即便是播种下的种子中只有极少量的种
14、子携带病毒也会造成 病毒在整片农田扩散，有的时候会导致全部的植株都获病。因此，举一个例子来说，每 公亩所种的种子为25万粒，也就是每平方米的土地上的种子为25粒,这个数字并不高, 假如其中有0.1%的种子带毒的话，每公亩土地上感病的植株也只有250株。但是，一 旦出现病情之后，这些随机种植的植株就成了病源库。表1.1显示了几种种传病毒所造 成的单位面积农作物的损失率。种传病毒对农作物生产造成严峻损失的两个众所周知的例子是，在1957-1970年 间，在美国的蒙大拿州，据估计由BSMV的侵染而造成的大麦经济损失就高达3千万 美圆；在上个世纪50年头，由LMV病毒侵染而造成的莒苣“六月黄”也导致加
15、利福 尼亚州的离苣生产严峻受创。运用完全无病毒种子或者几乎无病毒种子才使得这两件事 情最终得以解决。最近的例子就是由于草原受到SCMoV的侵染而造成澳大利亚奶制品 工业巨大损失，据估计每年的损失高达3100万澳大利亚圆。对于瓜类作物来讲，小西 葫芦黄花叶病毒是一种危害巨大的病源，它可以导致瓜类产量损失高达90%,但是， 该病毒的种传特性在其流行性病学探讨中所占角色并不重要，因为，即便是发生种传的 话，也只是在极少量种子中。截止到2023年为止，只有5%的南瓜种子中携带有种传 病毒。复合侵染导致农作物产量急剧下滑的缘由或许应归结为病毒间的协同效应。豆豆 矮化病是由BCMV的黑眼或豆花叶病毒株系和
16、黄瓜花叶病毒共同侵染而造成的，它可 导致吏豆种子在数量上和重量上分别削减84%和87%o倘如这两种病毒单独侵染豆豆, 则损失要少得多，黄瓜花叶病毒造成的损失为19%和14%, BCMV的黑眼史豆花叶病 毒株系所造成的损失仅为11%和3%o如前所述，植物病毒经由种子传播的两大风险就是：（i ）在农作物的代代种植中， 病毒病依旧如影随形；(ii)种子贸易使得种子作为一个载体把病害传播到新的地区。 和绝大多数经由种子传播的病害相比，病毒病具有明显的特点。病毒侵染的症状往往不 明显或者说田间的肉眼观测很难将其定性。相对于其他病害病源的检测而言，如真菌， 检测种子是否携带病毒的所需的人力和经济成本更高。
17、同时；尽管科学界就使种子脱毒 进行了很多尝试，但是这些方法都会导致种子生命力的降低。种传病毒所造成的间接损失主要包括农夫为限制病害所付出的成本以及在种子评 级和检验检疫过程所产生的损耗。植物病害诊断的其中一个特点就是，对于拿来测试的 样品来说，是低附加值的。因此，我们在实行限制措施以及投入成本时，其程度必 需和作物的价值以及经济损失的风险做一权衡。目前，有一些例子说明，我们可以运用 合格的种子从而有效限制病毒，比如说对前面提到的受BSMV以及LMV严峻侵害的 作物，在这些例子中，经济损失大幅度降低，可以用相对少的经济投入就可几乎消退病 毒。尤其是在发展中国家，农夫通常把他们省下的粮食做为来年耕
18、种的种子。正是在 这种耕作传统下，不仅每年收获的粮食中都会有携带病毒的种子，而且病源库的规模也 在逐年地扩大。当然另一方面，农夫手中种子的带毒率也可能会比种子培育站的低，就 如在尼泊尔会偶然在小扁豆种子中发觉或豆种媒花叶病毒。这也就使得在种子培育和生 产安排中，培育者的种子以及基本种在成为种质库和商品库之外必须要确保完全无病毒 化。除此之外，在培育种子的初期，限制病毒所须要的成本要比种子数量儿何增长之后 要少的多。1. 4检测种子是否带毒：为何？在很多状况下，由于病毒病害而引起的农作物产量的巨大损失是可以预防的，比 如说种植无毒或者带毒率较低的种子。仅凭田间观测来衡量种子商品种植中的带毒率往
19、往是低效的。由于植株较为稠密或者由于病毒-宿主之间相互作用而导致病害症状不明 显从而使得病株往往不被留意，也使得基于田间症状而进行诊断的难度很大，甚至无法 施行。从检疫学的角度来看，健康植株的体内也可能存在着潜在的侵染，是否存在侵染 以及病毒的类型唯有通过检测才可获悉。因此在检疫方面也须要特异性较高的检测方法 来检测和剔除病毒或者病毒株系。在种质收集的过程中，也须要种子健康检测来把携带 病毒的种子从野性型近亲或者经基因改良的基因型种子中剔除出去以及把在种质分化 过程中所引入的病毒检测出来。因此，在种子生产、基因库建立和种子检疫等方面都须 要牢靠的、特异的以及高灵敏度的病毒检测和诊断方法。依据病
20、毒、作物种类以及田间条件，尤其作物种植区内存在高效寄主，the degree of freedom from seed-transmissible viruses needed to minimize disease in the field varies 。1. 4. 1种子评级对于种子检疫和种子评级来说，它们所检测的种传病毒的最低带毒率是完全不一样 的。种子评级的目的在于给种植者供应质量最优化的种子，假如在这个过程中也包括种 子健康检测的话,其目的就是通过对种子样品的检测而使得合格种子中的带毒率处于一 个满意生产需求的最低限度。但是，就目前的状况来看，人们对于何为最低限度依旧是 存在很大的
21、分歧。Stace-Smith和Hamilton (1988)就曾经指出和种传病毒发病的最低 阈值相关的数据极度缺乏。根据Jones的说法，这种相关数据极度缺乏的状况在12年 内依旧未变。相对于检测技术的日新月异来说，科学界对于检测的结果、病源在田间扩 散以及不同侵染率所造成的产量损失这三者之间相互关联所做的探讨之少，达到令人惊 异的地步。正如Jones所说的那样，“科学界须要在投入到植物病毒传播学和投入到细 胞以及分子病毒学这两方面探讨的科研资源上来一个更为均衡的安排，尤其是在探讨种 传病毒时。”种子携带病毒率的实际阈值必需通过在不同地区、经年的田间试验才能确定下 来，在田间试验中，不同带毒率
22、的种子应当随机成块种植（见第三章）。在众多的田间试验中，在加利福尼亚州塞林那谷地进行的试验最被人熟知。这个 试验发觉，假如不能保证葛苣种子完全不带毒，即便是带毒率小于0.003%,那么离苣 花叶病毒依旧可以在该地区大爆发。而在欧洲和那些病毒寄主压力较低的地区以及在那 些葛苣并特别年种植的地区（正如塞林那谷地），葛苣种子带毒率为0.1%依旧不会造成 葛苣花叶病毒的大爆发。在2000年，Jones报道称，分别历经5年、7年以及7年在西 澳大利亚的不同地方于田间试验中为羽扇豆种子中CMV、地三叶草种子中CMV以及 南苜蓿种子中苜蓿花叶病毒确定了牢靠的接种物阈值。但是，对于发展中国家的绝大多数种植者来
23、说，把经过检验评级的合格种子拿来耕 种有点不太现实。在某些国家，种植者耕种的种子中有90%或者更多是来自上一年收 获的种子。在2023年，坦桑尼亚农夫96%的种子是上一年存下来的。在这些国家，由 于落后的经济使得农夫买不起来合格的种子来耕作。尽管农夫没有实力检测种子是否携 带病毒，但是他们也可以通过简洁易行的方式来生产完全不携带病毒或者低带毒率的种 子。1. 4. 2检疫经由胚传播的绝大多数病毒在种子中经年都保持着生命力，且通常只要种子有生命 力，这些病毒就可生存；因此，国际间的种子贸易和交换也使得种子成为病毒长距离传 播的常见途径。一些病毒在世界范围内得以快速扩散无疑就是通过这种途径，如蚕豆
24、花 叶病毒借助蚕豆以及PSbMV借助豌豆。因此，即便是已经知道在某个国家或者地区存 在着某种病毒，检验检疫部门也得时刻留意防止该病毒危害性更大的新株系的入境。正 如Mathur所说的那样，检疫部门应当就某些重点种传病毒的现状，包括新病的发生以 及病毒新株系的出现，与探讨机构保持亲密的联系。在20世纪80年头，花生条纹病毒（后来被定为BCMV的一个新株系），一种对 花生危害极大的病源，经由从中国进口而来的花生种质而被带到了美国。该种病毒在澳 大利亚进出口检疫部门所扣压的花生种子中也有发觉。像种子评级那样仅仅对一批种子 中的代表样品进行检测是无法摒除种子所携带的病害。对于诸如种质这样小批量的种子
25、来说，是可以获得零耐受水平。近年来，澳大利亚进出口检疫检验部门多次从进口而来的种质库中发觉种子系被侵 染现象，其中,在1978-1981年间，9.6%（29/302）的史豆和17.5% （54/309）大豆以及菜 豆的受到种传病毒的侵染。绝大多数受侵染的子代都呈现出明显的症状，病毒详细的属 性通过生物学、血清学以及电镜学的方法就可确定。在澳大利亚，从外国进口的多年生 作物的种子被种植在无寄主的温室中，只有那些从完全不带病毒植株收获而来的种子才 进入市场。Jones认为，目前，迫切须要建立完全无病毒的种质库，这样就使得那些检 验检疫体系不完善的国家能够进口到不带病毒的种子，在改善这些国家农作物生
26、产的同 时又不会引发新的病害问题。通过这种方式摒除种质中的病毒不行避开地就会造成种子 投入生产的延后。对种子非破坏性的检测会相应地缩短这段延后期。但是，这种方法只 适用于一部分病毒宿主之间。直到20世纪的70年头，PSbMV在北美豌豆培育安排中大爆发，科学家们才意识 到美国的豌豆种质库是PSbMV的主要来源。最近几年来，在世界性的种子公司所出售 的豌豆种子也检测到这种病毒。在由美国农业部植物引种机构引种的豌豆中，来自印度北部的豌豆种子携带 PSbMV的频率高达138/472 （批/批），与此同时，也在北印度发觉了 33批引种豌豆为 免疫种质。相比而言，从发达国家引种的500批豌豆中无一含有针对
27、PSbMV的免疫种 质。PSbMV病毒库和抗PSbMV的豌豆种质在北印度的区域性集中分布在全世界是独 一无二的，这种集中分布在其它地区并不存在。因此，有人推想北印度地区是PSbMV 传播的源头，PSbMV正是从这个地方扩散到世界的其他地方。从美国豌豆众多的种质库系中把PSbMV这种危害极大的病源剔除是一个长期的 工程，在1976年，由美国三个试验室组成的工作小组，它们的目的就是从豌豆种质中 剔除PSbMV,当时由于病毒的危害严峻，该安排并位被种植者所看好。从每一批的种 子中，选取大量的种子种植在无寄主的温室中，一旦植株出现症状就被剔除掉，进而从 每一批中选择至少24个表型、外表健康的植株作为母代来繁殖种子。这些植株在生长 的过程中至少要做一次酶联免疫反应来加以检测，从无毒植株收获的种子就作为完全不 携毒种子贮存为种质库。在1988-1991年，这个小组一共对2700批种子进行无病毒化 处理。据从事探讨的科学家们称，运用这种方法仅会导致种质极少数遗传多样性的消逝。 在其他作物上中建立完全不携病毒种质库的努力也已进行，如美国对史豆，巴西 对花生。不幸的是，在那些种传病毒和昆虫传病毒猖獗的地区无毒种子所长出的植株最 终也会受到病毒的侵染，损失依旧严峻。在和7.3中，有关种传病毒的检疫也将进一步探讨。