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1、活体组织氧化应激活性氧(ROS)初级荧光测定试剂盒产品说明书主要用途活体组织氧化应激活性氧(ROS)初级荧光测定试剂是一种旨在通过透膜荧光染色剂二氯荧 光乙酰乙酸盐，在组织氧化损伤条件下，产生荧光，来定量检测组织内活性氧族的生成和增 加的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。适宜于活 体动物组织的分析。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。产品 严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。技术背景超氧自由基阴离子(superoxide radical； 02-) 过氧化氢(hydrogen peroxide； H2O2) 羟自 由基或氢氧
2、基(hydroxyl radical； 0H-)、过氧化基(peroxy 1 radical； R00-)氢过氧自由基 (hydroperoxyl； HOO) 烷氧自由基(alcoxyl radical) 氮氧基(nitric Oxide； N0-) 过氧 亚硝基阴离子(peroxynitrite anion； ONOO-)次氯酸(hypochlorous acid； H0C1)、半醍自 由基(semiquinone radical) 单线态氧气(singlet oxygen)等细胞内活性氧族(Reactive Oxygen Species； ROS)的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。27-
3、二氯荧光乙酰乙酸盐 (ZJdichlorofluorescein diacetate, DCFH-DA) 一种完全自由通过细胞膜的染色剂。一旦被 过氧化氢、过氧化基、过氧亚硝基阴离子等氧化，便产生绿色荧光。据此测定组织细胞内活 性氧族的浓度。产品内容清理液(ReagentA)300毫升染色液(Reagent B)1毫升稀释液(Reagent C)200毫升说明书1份保存方式保存染色液(Reagent B)在一20冰箱里，严格避免光照；其余的保存在4c冰箱里，有效 保证12月用户自备50毫升锥形离心管：用于组织收集的容器15毫升锥形离心管：用于工作液配制和组织处理的容器1.5毫升离心管：用于工作
4、液配制的容器6孔细胞培养板：用于组织染色的容器培养箱或恒温水槽：用于染色孵育荧光显微镜：用于观察荧光组织荧光分光光度仪：用于组织荧光定量检测实验步骤方法一：新鲜组织薄片定性检测 实验开始前，将一20C冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液 （Reagent C）放进37c恒温水槽里预热。然后移出25微升染色液（Reagent B）到新的15 毫升锥形离心管，加入2.5毫升稀释液（Reagent C）,混匀后，将染色工作液置入暗室里。 然后进行下列操作。1 .手术取出动物组织.放进预冷的50毫升锥形离心管2 .加入3毫升清理液（Reagent A）浸泡15秒.用镇子
5、取出组织，用无菌绵纸吸干3 .即刻用刀片切离组织为1cm X 1cm大小的片状组织.用镣子将组织薄片放进6孔培养板的一个孔4 .加入2.5毫升含有染色液（ReagentB）和稀释液（ReagentC）的染色工作液.放进37c培养箱孵育20分钟，避免光照（注意：如果组织薄片较厚，可以增加孵育时 间至60分钟）5 .小心抽去染色工作液.加入3毫升清理液（Reagent A）6 .用镶子将组织薄片放在载玻片上.压片7 .即刻在荧光显微镜下观察（定性检测）：激发波长490nm,散发波长520nm绿色荧 光增强,表明活性氧族（ROS）含量高方法二：组织匀浆定量检测实验开始前，将一20C冰箱里的试剂盒中的
6、染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液 （ReagentC）放进37恒温水槽里预热。然后移出25微升染色液（ReagentB）到新的1.5毫升离心管，加入99。微升稀释液（ReagentC）,混匀后，将染色工作液置入喑室里。然后 进行下列操作。1 .手术取出动物组织，并秤重以确定组织重量.移取1克组织，放进预冷的50毫升锥形离心管2 .加入3毫升的清理液（Reagent A）.用镣子取出组织，用无菌绵纸吸干3 .即刻用刀片切碎组织.放进一个预冷的15毫升锥形离心管4 .加入5毫升预冷的稀释液（ReagentC）.涡旋震荡5秒，充分混匀5 .即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器.在冰槽里
7、用研磨棒匀化组织（注意：切莫过度匀化）6 .将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管.置入冰槽里备用7 .移取5微升组织匀浆物进行蛋白定量检测.移取50微升组织匀浆物（样品）或50微升稀释液（ReagentC）（背景对照）至口毫升 石英比色杯里8 .加入950微升升含有染色液（ReagentB）和稀释液（ReagentC）的染色工作液.上下倾倒混匀9 .放进37c恒温水槽孵育20分钟，避免光照.即刻放进荧光分光光度仪检测：激发波长490nm,散发波长520nm（样品RFU-对方法三：组织匀浆微量检测实验开始前，将一20C冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液 （Re
8、agent C）放进37恒温水槽里预热。然后移出10微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入200微升稀释液（Reagent C）,混匀后，将染色工作液置入暗室里。然后 进行下列操作。1 .手术取出动物组织，并秤重以确定组织重量.移取200毫克组织，放进预冷的15毫升锥形离心管2 .加入1毫升的清理液（ReagentA）.用镇子取出组织，用无菌绵纸吸干3 .即刻用刀片切碎组织.放进一个预冷的15毫升锥形离心管4 .加入1毫升预冷的稀释液（ReagentC）.涡旋震荡5秒，充分混匀5 .即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器.在冰槽里用研磨棒匀化组织（注意：切莫过度匀化）6 .将所
9、有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管.置入冰槽里备用7 .移取5微升组织匀浆物进行蛋白定量检测.移取50微升组织匀浆物（样品）或50微升稀释液（ReagentC）（背景对照）至U 1毫升 石英比色杯里8 .加入200微升升含有染色液（ReagentB）和稀释液（ReagentC）的染色工作液.上下倾倒混匀9 .放进37恒温水槽孵育20分钟，避免光照.即刻放进荧光酶标仪检测：激发波长490nm,散发波长520nm（样品RFU-对照RFU）=实际RFU：增加，表明活性氧族（ROS）含量高注意事项1 .本产品为20次（1克组织）、100次（200毫克组织）、500次（200毫克组织，酶标板） 或40次（组织薄片）操作.建议使用新鲜组织，手术切除后1小时内的样品2 .操作时，须戴手套.孵育时，须避免光照3 .如果组织薄片较厚，可以增加孵育时间至60分钟.组织匀浆时，切莫过度4 .建议组织染色完成后，即刻进行荧光定量或定性分析.本公司提供阳性对照甲蔡醍溶液，观察组织荧光增强现象5 .本公司提供系列活性氧检测试剂产品质量标准1 .本产品经鉴定性能稳定.本产品经鉴定荧光清晰