《细胞内氧化应激活性氧单线态氧气比色法定量检测试剂盒产品说明书中文版主要用途.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞内氧化应激活性氧单线态氧气比色法定量检测试剂盒产品说明书中文版主要用途.docx（3页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、细胞内氧化应激活性氧单线态氧气比色法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)主要用途细胞内氧化应激活性氧单线态氧气比色法定量检测试剂是一种旨在通过二甲基4亚硝基苯胺，受到单线 态氧气-的作用，出现去色现象，由分光光度仪比色分析，定量检测细胞内单线态氧气活性氧族的生成和增 加的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。可以被用于细胞凋亡、信号传递、 衰老、代谢和营养学等的研究。其适用于各种活体细胞(动物、人体等)内单线态氧气的检测。产品严格 无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感。技术背景超氧自由基阴离子(superoxide radical； O2 )过氧化氢(hydrogen
2、 peroxide； H2O2)、羟自由基或氢氧基 (hydroxyl radical； OH) 过氧化基(peroxyl radical； ROOD、氢过氧自由基(hydroperoxy 1； H00) 烷氧自由基(alcoxy 1 radical)、氮氧基(nitric Oxide； NO)、过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite anion； 0N00 ) 次氯酸(hypochlorous acid； HC1O)、半醍自由基(semiquinone radical) 单线态氧气(singlet oxygen)等 细胞内活性氧族(Reactive Oxygen Species； RO
3、S)的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。其中单线态氧 气(singletoxygen； 1 O2)是分子氧(02)的抗磁形式或电激发形式。通过染料分子，例如孟加拉红(Rose Bengal)、亚甲基兰(Methylene Blue)、口卜咻类化合物(Porphyrins)染料的光敏过程中能量转移产生，或过 氧化氢和次氯酸的化学反应产生。单线态氧气可以调节紫外线A辐射的生物学作用、激活各种细胞信号通 路等。单线态氧气会导致植物的光动力损伤(photodynamic damage)和动物心血管问题。基于二甲基.4.亚 硝基苯胺(N,N-Dimethyl-p-nitrosoaniline； PNDA
4、或RNO)作为单线态氧气的选择性受体，在单线态氧气的 存在下，产生去色作用，在分光光度仪下(440nm波长)，呈现吸光峰值的降低。据此定量检测细胞内单线 态氧气活性氧族的浓度。产品内容清理液(Reagent A)120毫升裂解液(Reagent B)10毫升缓冲液(Reagent C)20毫升反应液(Reagent D)2毫升阴性液(Reagent E)1毫升产品说明书1份保存方式保存 清理液(Reagent A)在4c冰箱里；其余的保存在-20C冰箱里；反应液(Reagent D)避免光照；有 效保证6月用户自备1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
5、细胞刮脱棒：用于细胞脱离(微型)台式离心机：用于样品操作培养箱：用于反应孵育比色皿或96孔板：用于比色分析的容器分光光度仪或酶标仪：用于比色分析实验步骤一、样品准备1 .准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞(1至5X 1()6细胞).小心加入3毫升 清理液(Reagent A),覆盖生长表面2 .小心抽去清理液.使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意：避免使用胰酶消化)3 .加入3毫升 清理液(Reagent A),混匀细胞.移入到预冷的15毫升锥形离心管。注意、悬浮细胞从这一步骤开始)4 .放进4台式离心机离心5分钟，速度为300g.小心抽去上清液5 .加入500微升 裂解
6、液(Reagent B),充分混匀.转移到预冷的1.5毫升离心管6 .强力涡旋震荡15秒.置于冰槽里孵育30分钟7 .放进4微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g (或13000RPM,例如eppendorf 5415).小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管8 .移取10微升进行蛋白定量检测(注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒一GMS30030.1).即刻放进一70C保存或置于冰槽里继续后续操作二、测定准备.开启并设定好分光光度仪(温度为30C )：波长440nm,并置零1 .从一20C冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；反应液(Reagent D)避免光照
7、. 缓冲液(Reagent C)室温下均衡温度三、背景对照测定.移取800微升 缓冲液(Reagent C)到新的比色皿1 .加入100微升 阴性液(Reagent E).加入100微升 反应液(Reagent D)2 .上下倾倒数次，混匀.在30温度下孵育40分钟3 .即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照四、样品测定1 .移取800微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿.加入100微升待测样品（50微克蛋白）（注意：样品须清2 .加入100微升 反应液（Reagent D）.上下倾倒数次，混匀3 .在30温度下孵育40分钟.即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数五、计算样品浓度 （样
8、品读数一背景读数）X 1 （体系容量；毫升）X样品稀释倍数卜0.1 （样品容量；毫升）X34.4 （毫摩 尔吸光系数）=微摩尔 02/毫升：（样品蛋白浓度）毫克/毫升=微摩尔 02/毫克六、酶标仪测定1 .在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品.分别移取200微升 缓冲液（Reagent C）到96孔板的所有孔里2 .分别加入25微升阴性液（Reagent E）或待测样品（20微克蛋白）到相应孔里（注意：样品须清.分别加入25微升 反应液（Reagent D）到96孔板的所有孔里3 .轻轻摇动96孔板.在30温度下孵育40分钟4 .即刻放进酶标仪检测：获得吸光读数.浓度计算：（样品读数一背景
9、读数）X 0.25 （体系容量；毫升）X样品稀释倍数卜0.025 （样品容量；毫升）X 34.4 （毫摩尔吸光系数）X 0.6 （光径距离；厘米）=微摩尔 02/毫升（样品蛋白浓度）毫克/毫升=微摩尔 02/ 毫克注意事项1 .本产品为20次（比色皿）或80次（96孔板）操作.避免使用叠氮化钠处理样品2 .操作时，须戴手套.孵育时，避免光照3 .系统操作过程中，背景测定只需1次.建议使用比色皿测定4 .样品须澄清，至关重要.测定值由高到低变化5 .比色测定后，比色皿须清洗彻底.建议待测样本蛋白浓度为50微克/100微升；如果样本浓度过低或过高，则可以增加或降低样本量（本 公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒一GMS3OO3O.1）6 .如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度.可以使用单线态氧气抑制剂或清除剂（scavenger）,即NaN3和DABC0作为抑制剂对照或阴性对照7 .可以使用单线态氧气激发剂（generator）,即蔡咤酮酸（Nalidixic acid）等作为阳性对照.本公司提供系列活性氧检测试剂产品质量标准.本产品经鉴定性能稳定1 .本产品经鉴定检测敏感