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1、 ICS 67.120.01 CCS B 45 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 28332022 狼源性成分检测 实时荧光 PCR 法 Real-time PCR method for detection of canis lupus-derived materials 2022-12-08 发布 2023-01-08 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 28332022 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国二连海关。
2、本文件主要起草人：王伊琴、陈少博、包勇敢、杨帆、荆文魁、苏日娜、张志峰、常鸿、寇福军、赵治国。DB15/T 28332022 1 狼源性成分检测 实时荧光 PCR 法 1 范围 本文件规定了动物源性产品中狼源性成分实时荧光PCR检测方法。本文件适用于动物源性产品（肉制品、皮毛制品、饲料等）中狼源性成分的鉴定，灵敏度为0.15ng/L。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T
3、27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。实时荧光 PCR real-time PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyl trithyl ammonium bromide)DNA:脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid）EDTA：乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid
4、)FAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein)PCR:聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）TAMRA:羧基四甲基罗丹明(carboxy-tetramethyl-rhodamine)Tris：三（羟甲基）氨基甲烷tris(hydroxymethyl)aminomethane 5 试剂与材料 DB15/T 28332022 2 水：符合 GB/T 6682 的要求。引物对序列:a)上游：5-CCGTACTCTAGCTTACATA-3；b)下游：5-GAGACCTTCCAGATGAAA-3；c)探针序列：5-(FAM)-TACCTCACATTAG
5、CCAAGAAGCCA-(TAMRA)-3。DNA 提取试剂盒。CTAB。Tris-HCl(pH 8.0)。NaCl。EDTA。蛋白酶 K 溶液(20 mg/mL)。三氯甲烷。异丙醇。75%乙醇。实时荧光 PCR 预混液。阳性对照样品：采用已知含有狼源性成分样品的 DNA，或经测序确认的阳性质粒。见附录 B。阴性对照样品：采用已知不含有狼（包括其他犬科动物）源性成分样品的 DNA。空白对照：ddH2O。6 仪器与设备 实时荧光 PCR 仪（加热速率 10/s 以上）。高速台式离心机（最高转速 12000 rpm）。旋涡振荡器（最高转速 3000 rpm）。核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。恒温水
6、浴锅。天平（感量 0.01 g）。单孔道微量移液器：0.5 L10 L、10 L100 L、20 L200 L、100 L1000 L。7 实验方法 DNA 提取 参照附录A中提取样品DNA的方法提取DNA，也可采用等效商品化的组织基因组DNA提取试剂盒进行。当DNA浓度吸光度值A260/A280在1.71.9之间时，适宜于PCR扩增。设置至少两个平行样品且需设立阴性、阳性及空白提取对照。实时荧光 PCR 检测 7.2.1 反应体系 反应体系体积为25.0 L，见表1。DB15/T 28332022 3 表1 狼源性成分实时荧光 PCR 检测方法的反应体系 试剂名称 贮备液浓度mol/L 反应
7、体系体积L PCR 反应预混合液 12.5 上游引物（F）10.0 1.0 下游引物（R）10.0 1.0 探针（P）10.0 1.0 模板 2.0 ddH2O 补足至总体积为 25.0 检测过程分别设阴性对照、阳性对照和空白提取对照。7.2.2 反应条件 预变性：94，3 min；变性：94，10 s；延伸退火：60，10 s，35个循环。在60 时收集荧光信号值。8 结果判定与表述 质量控制 质控对照应满足以下条件，否则应重新实验：a)空白对照：无荧光对数增长，相应的 Ct 值大于等于 35.0；b)阴性对照：无荧光对数增长，相应的 Ct 值大于等于 35.0；c)阳性对照：有荧光对数增长
8、，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 Ct 值小于等于 28.0。结果判定 8.2.1 质控对照成立条件下，2 个平行样检测结果 Ct 值大于 28.0，可判定被检样品为阴性。8.2.2 质控对照成立条件下，2 个平行样检测结果 Ct 值小于等于 28.0，可判定被检样品为阳性。8.2.3 质控对照成立条件下，至少 1 个平行样检测结果 Ct 值 28.035.0，并出现典型的扩增曲线，此时应适当增加 DNA 模板量重做实时荧光 PCR 检测。再次检测结果仍然 Ct 值小于等于 28.0，并出现典型的扩增曲线，可判定被检样品为阳性；再次检测结果 Ct 值大于 28.0，可判定被检样品为阴性。
9、结果表述 8.3.1 结果为阳性者，表述为“检出狼源性成分”。8.3.2 结果为阴性者，表述为“未检出狼源性成分”。9 防止交叉污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T 27403中的规定执行。DB15/T 28332022 4 A A 附录A （资料性）溶液配制及提取方法 A.1 CTAB-提取缓冲液 将5 g CTAB，20.45 g NaCl，3.03 g Tris，1.86 g Na2-EDTA溶于200 mL水中，用盐酸调pH 8.0后，定容至250 mL，115 高压15 min。A.2 CTAB-沉淀液 称0.2 g CTAB,0.234 g NaCl，定容至100 m
10、L，115 高压15 min。A.3 1.2 mol/L NaCl 溶液：称取28 g NaCl，定容至400 mL，115 高压15 min。A.4 DNA 提取方法：A.4.1 称取样品0.5 g1 g加入1.5 mL3.5 mL CTAB提取液中，再加入12 L20 L蛋白酶K（根据CTAB量调节），每个样品提取2管，同时用水做空白提取对照。混匀后65 至少1 h(过夜孵育最好)，如样品膨胀，则可再多加CTAB,每次多1 mL，最多10 mL。A.4.2 4000 rpm/min5000 r/min离心10 min。A.4.3 将上清（约1 mL）加入无菌EP中（2 mL管），加入700
11、 L氯仿，涡旋30 s后，再12000 rpm离心10 min。A.4.4 取上清600 L650 L加入无菌EP管中，加入2倍体积的CTAB沉淀液，旋涡混匀，室温静置1 min。A.4.5 12000 rpm离心10 min，去上清。沉淀溶解于350 L的1.2 mol/L NaCl溶液。（2管合并共用350 L溶液）。A.4.6 加入350 L氯仿，涡旋30 min，12000 rpm离心10 min。A.4.7 取上清液至无菌EP管中（确定体积），加入0.8倍体积的异丙醇，手摇混匀，室温孵化至少20 min，12000 rpm离心10 min，去上清，沉淀用500 L 75%的乙醇洗涤，再12000 rpm离心10 min。A.4.8 去上清后，干燥沉淀，60 下15 s20 s（开盖倒立）。A.4.9 将沉淀溶于100 L灭菌水或TE buffer或DEPC水中。DB15/T 28332022 5 B B 附录B （规范性）狼源性成分的目标扩增序列 142 bp CCGTACTCTAGCTTACATAACTCAGGAAGGTGGGTACCTCACATTAGCCAAGAAGCCATTTTAGTCTTGGTGTCTGAAGG TGGGGTGGCTGGAAATTTC GTAGAAAGAATTTTTATATCTGCATTTCATCTGGAAGGTCTC