《DB15_T 2833-2022 狼源性成分检测 实时荧光PCR法.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DB15_T 2833-2022 狼源性成分检测 实时荧光PCR法.docx（5页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、DB15/T28332022狼源性成分检测实时荧光PCR法1范围本文件规定了动物源性产品中狼源性成分实时荧光PCR检测方法。本文件适用于动物源性产品（肉制品、皮毛制品、饲料等）中狼源性成分的鉴定，灵敏度为0.15ng/mL。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。实时荧光PCRreal-timePCR
2、在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。Ct值cyclethreshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4缩略语下列缩略语适用于本文件。CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammoniumbromide)DNA:脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)FAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein)PCR:聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）TAMRA:羧基四甲基罗丹明
3、(carboxy-tetramethyl-rhodamine)Tris：三（羟甲基）氨基甲烷tris(hydroxymethyl)aminomethane5试剂与材料1DB15/T28332022水：符合GB/T6682的要求。引物对序列:a)上游：5-CCGTACTCTAGCTTACATA-3；b)下游：5-GAGACCTTCCAGATGAAA-3；c)探针序列：5-(FAM)-TACCTCACATTAGCCAAGAAGCCA-(TAMRA)-3。DNA提取试剂盒。CTAB。Tris-HCl(pH8.0)。NaCl。EDTA。蛋白酶K溶液(20mg/mL)。三氯甲烷。异丙醇。75%乙醇。实时
4、荧光PCR预混液。阳性对照样品：采用已知含有狼源性成分样品的DNA，或经测序确认的阳性质粒。见附录B。阴性对照样品：采用已知不含有狼（包括其他犬科动物）源性成分样品的DNA。空白对照：ddH2O。6仪器与设备实时荧光PCR仪（加热速率10/s以上）。高速台式离心机（最高转速12000rpm）。旋涡振荡器（最高转速3000rpm）。核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。恒温水浴锅。天平（感量0.01g）。单孔道微量移液器：0.5mL10mL、10mL100mL、20mL200mL、100mL1000mL。7实验方法DNA提取参照附录A中提取样品DNA的方法提取DNA，也可采用等效商品化的组织基因组DN
5、A提取试剂盒进行。当DNA浓度吸光度值A260/A280在1.71.9之间时，适宜于PCR扩增。设置至少两个平行样品且需设立阴性、阳性及空白提取对照。实时荧光PCR检测7.2.1反应体系反应体系体积为25.0mL，见表1。2试剂名称贮备液浓度mmol/L反应体系体积mLPCR反应预混合液12.5上游引物（F）10.01.0下游引物（R）10.01.0探针（P）10.01.0模板2.0ddH2O补足至总体积为25.0DB15/T28332022表1狼源性成分实时荧光PCR检测方法的反应体系检测过程分别设阴性对照、阳性对照和空白提取对照。7.2.2反应条件预变性：94，3min；变性：94，10s
6、；延伸退火：60，10s，35个循环。在60时收集荧光信号值。8结果判定与表述质量控制质控对照应满足以下条件，否则应重新实验：a)空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值大于等于35.0；b)阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值大于等于35.0；c)阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值小于等于28.0。结果判定8.2.1质控对照成立条件下，2个平行样检测结果Ct值大于28.0，可判定被检样品为阴性。8.2.2质控对照成立条件下，2个平行样检测结果Ct值小于等于28.0，可判定被检样品为阳性。8.2.3质控对照成立条件下，至少1个平行样检测结果Ct值28.035.
7、0，并出现典型的扩增曲线，此时应适当增加DNA模板量重做实时荧光PCR检测。再次检测结果仍然Ct值小于等于28.0，并出现典型的扩增曲线，可判定被检样品为阳性；再次检测结果Ct值大于28.0，可判定被检样品为阴性。结果表述8.3.1结果为阳性者，表述为“检出狼源性成分”。8.3.2结果为阴性者，表述为“未检出狼源性成分”。9防止交叉污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的规定执行。3DB15/T28332022AA附录A（资料性）溶液配制及提取方法A.1CTAB-提取缓冲液将5gCTAB，20.45gNaCl，3.03gTris，1.86gNa2-EDTA溶于200mL水
8、中，用盐酸调pH8.0后，定容至250mL，115高压15min。A.2CTAB-沉淀液称0.2gCTAB,0.234gNaCl，定容至100mL，115高压15min。A.31.2mol/LNaCl溶液：称取28gNaCl，定容至400mL，115高压15min。A.4DNA提取方法：A.4.1称取样品0.5g1g加入1.5mL3.5mLCTAB提取液中，再加入12mL20mL蛋白酶K（根据CTAB量调节），每个样品提取2管，同时用水做空白提取对照。混匀后65至少1h(过夜孵育最好)，如样品膨胀，则可再多加CTAB,每次多1mL，最多10mL。A.4.24000rpm/min5000r/mi
9、n离心10min。A.4.3将上清（约1mL）加入无菌EP中（2mL管），加入700mL氯仿，涡旋30s后，再12000rpm离心10min。A.4.4取上清600mL650mL加入无菌EP管中，加入2倍体积的CTAB沉淀液，旋涡混匀，室温静置1min。A.4.512000rpm离心10min，去上清。沉淀溶解于350mL的1.2mol/LNaCl溶液。（2管合并共用350mL溶液）。A.4.6加入350mL氯仿，涡旋30min，12000rpm离心10min。A.4.7取上清液至无菌EP管中（确定体积），加入0.8倍体积的异丙醇，手摇混匀，室温孵化至少20min，12000rpm离心10min，去上清，沉淀用500mL75%的乙醇洗涤，再12000rpm离心10min。A.4.8去上清后，干燥沉淀，60下15s20s（开盖倒立）。A.4.9将沉淀溶于100mL灭菌水或TEbuffer或DEPC水中。4DB15/T28332022BB附录B（规范性）狼源性成分的目标扩增序列142bpCCGTACTCTAGCTTACATAACTCAGGAAGGTGGGTACCTCACATTAGCCAAGAAGCCATTTTAGTCTTGGTGTCTGAAGGTGGGGTGGCTGGAAATTTCGTAGAAAGAATTTTTATATCTGCATTTCATCTGGAAGGTCTC5