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1、单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个 B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。1 单克隆抗体的优点与局限性：1.1 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得
2、大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如 IRMA和 ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。1.2 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。(2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。2 单克隆抗体的制备：
3、单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有 B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。2.1 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗
4、原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射 1050ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。2.2 动物的选择与免疫 2.2.1 动物的选择 纯BALB/c 小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活目开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种 BALA/c小鼠。2.2.2免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合
5、杂交的成功，获得高质量的 McAb至关重要。一般在融合前两月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。初次免疫抗原 150g 加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般 0.8 1ml，0.2ml/点），3 周后第二次免疫，剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或 ip（腹腔内注射）（ip 剂量不宜超过 0.5ml），3 周后第三次免疫，剂量同一，不加佐剂，ip（57 天后采血测其效价），23 周加强免疫，剂量 50500g宜，ip 或 iv（静脉内注射)，3
6、天后 取脾融合。（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为 12107个细胞。初次免疫 1107/0.5ml ip，23 周后，第二次免疫 1107/0.5ml ip，3 周后加强免疫（融合前三天）1107/0.5ml ip或 iv，取脾融合。2.3 细胞融合 2.3.1 细胞融合前准备 （1）骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生量 McAb。骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如 DMEM 培养基。小牛血清的浓度一般在 10%20%，细胞浓度以 1045105/ml 为
7、宜，最大浓度不得超过 106/ml。当细胞处于对生长的中期时，可按 1：31：10 的比例传代。每 35 天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用 8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对 HAT呈均一的敏感性。（2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备 McAb的过程中，许多环节需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。饲养细胞的量为一般为 2104或 1
8、05细胞/孔。2.3.2 细胞融合的步骤 将骨髓瘤细胞与脾细胞按 1：10 或 1：5 的比例混合在一起，在 50ml 离心管中用无血清不完全培养液洗 1 次，离心，1200rpm，8min；弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。90s 内加入 37预温的 1ml 45%PEG（分子量 4000）溶液，边加边轻微摇动。37水浴作用 90s。加 37。C预温的不完全培养液以终止 PEG作用，每隔 2min 分别加入 1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和 6ml。离心，800rpm,6min。充上清，用含 20%小牛血清 HAT选择培养
9、液重悬。将上述细胞，加到已有饲养细胞层的 96 孔板内，每孔加 100l。一般一个免疫脾脏可接种 4 块96 孔板。将培养板置 37、5%CO2培养箱中培养。2.4 选择杂交瘤细胞及抗体检测 2.4.1 HAT选择杂交瘤细胞 脾细胞和骨髓瘤细胞经 PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞并以此生产抗体是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体对应于多克隆抗体多株抗体由多种类型的细胞制造出来的基因突变就可以不断地生产高特异性高均一性的抗体可以用相对不纯的抗原获得大量高度特异的均一的抗体由于可能一生物学功能可用于体内的放射免疫显和免疫导向治疗总体来说即高特异性高纯度重复性好敏感性强成本低和可大量细胞
10、与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在 HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在 HAT选择培养液可以生长繁殖。在用 HAT选择培养 12 天内，将有大量瘤细胞死亡，34 天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持 710 天后应换用 HT培养液，再维持 2 周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底 1/10 面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每 23 天换一半培养液。2.4.2 抗体的检测 检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类
11、型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。常用的方法有：（1）放射免疫测定（RIA）可用于可溶性抗原、细胞 McAb的检测。（2）酶联免疫吸附试验（ELISA）可用于可溶性抗原、细胞和病毒等 McAb的检测。（3）免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的 McAb的检测。（4）其它如间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。2.5 杂交瘤克隆化 杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过 HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞
12、和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。克隆化的方法很多，最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。2.6 杂交瘤细胞的冻存与复苏 2.6.1 杂交瘤细胞的冻存 及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培
13、养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则可因上述意外而前功尽弃。细胞冻存液：50%小牛血清；40%不完全培养液；10%DMSO（二甲基亚砜）。冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至 0后放入-70超低温冰箱，次日转入液氮中。也可用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。2.6.2 细胞复苏方法 将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放 37水浴中，在 1min 内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置 37、5%CO2孵
14、箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。2.7 单克隆抗体的大量制备 大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：一种是杂交瘤细胞体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血细胞并以此生产抗体是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体对应于多克隆抗体多株抗体由多种类型的细胞制造出来的基因突变就可以不断地生产高特异性高均一性的抗体可以用相对不纯的抗原获得大量高度特异的均一的抗体由于可能一生物学功能可用于体内的放射免疫显和免疫导向治疗总体来说即高特异性高纯度重复性好敏感性强成本低和可大量清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。如果大量生产，费用较高。另一种方法是最普遍采用小鼠腹腔接种
15、法。选用 BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集 510ml 的腹水，有时甚至超过 40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。2.8 单克隆抗体的鉴定 对制备的 McAb进行系统的鉴定是十分必要的，应做下述几个方面的鉴定：2.8.1 抗体特异性的鉴定 除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应该用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用 ELISA、IFA法。例如：制备抗黑色素瘤细胞的 McAb，除用黑
16、色素瘤细胞反应外，还应该用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。2.8.2 McAb的 Ig 类与亚类的鉴定 一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时已经基本上确定了抗体的 Ig 类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠 IgG 或 IgM，则检测出来的抗体一般是IgG 类或 IgM 类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心 ELISA来确定。在作双扩试验时，如加入适量的 PEG（3%），更有利于沉淀线的形成。2.8.3 M
17、cAb中和活性的鉴定 用动物或细胞的保护实验来确定 McAb的生物学活性。例如，如果确定抗病毒 McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。2.8.4 McAb识别抗原表位的鉴定 用竞争结合试验，测相加指数的方法，测定 McAb所识别抗原位点，来确定 McAb的识别的表位是否相同。2.8.5 McAb亲合力的鉴定 用 ELISA或 RIA竞争结合试验来确定 McAb与相应抗原结合的亲合力。2.9 单克隆抗体制备的影响因素：1.污染。2、PEG有毒性，可能作用时间过长，牛血清质量差，骨髓瘤细胞污染了支原体，HAT有问题，融合后杂交瘤细
18、胞不生长。3 免疫原抗原性弱，免疫效果不好，融合后有细胞生长，但无抗体产生（可能是 HAT中的 A失效，或骨髓瘤细胞发生突变，变成 A抵抗细胞），原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性（可能是支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长），使杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体。4 小牛血清质量问题，杂交瘤细胞活性状态，细胞有支原体污染，使杂交瘤细胞难以克隆化等。3 单克隆抗体的应用：1 检验医学诊断试剂 目前，应用单克隆抗体制作的商品化试剂盒广泛应用于：病原微生物抗原、抗体的检测；肿瘤抗原的检测；免疫细胞及其亚群的的检测；激素测定；细胞因子的测定。单克隆抗体对抗原的识别，与多克隆抗体有很大的不同。不同试
19、剂盒因使用的单克隆抗体不同，识别抗原的位点不同，导致检测结果有一定差异。因此，标准化问题还需要进一步研究。2 蛋白质的提纯 单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其细胞并以此生产抗体是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体对应于多克隆抗体多株抗体由多种类型的细胞制造出来的基因突变就可以不断地生产高特异性高均一性的抗体可以用相对不纯的抗原获得大量高度特异的均一的抗体由于可能一生物学功能可用于体内的放射免疫显和免疫导向治疗总体来说即高特异性高纯度重复性好敏感性强成本低和可大量余成分不能
20、与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或 pH，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。3肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术 将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将药物或放疗物质携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为肿瘤导向治疗。另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。细胞并以此生产抗体是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体对应于多克隆抗体多株抗体由多种类型的细胞制造出来的基因突变就可以不断地生产高特异性高均一性的抗体可以用相对不纯的抗原获得大量高度特异的均一的抗体由于可能一生物学功能可用于体内的放射免疫显和免疫导向治疗总体来说即高特异性高纯度重复性好敏感性强成本低和可大量