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1、单克隆抗体的制备及应用第1页，本讲稿共39页 目目 录录1 1单克隆抗体的简介2 2单克隆抗体技术发展经历3 3单克隆抗体的制备4 4单克隆抗体的应用5 5 展望第2页，本讲稿共39页单克隆抗体的简介单克隆抗体的简介1 第一部分第3页，本讲稿共39页单克隆抗体的简介单克隆抗体的简介19751975年分子生物学家年分子生物学家G.J.F.G.J.F.克勒和克勒和C.C.米尔斯坦在自然杂交技术的米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术。他们把可在体外培养和无限增殖基础上，创建立杂交瘤技术。他们把可在体外培养和无限增殖的骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合，形成的骨髓瘤细胞与经抗原免
2、疫后的纯系小鼠脾细胞融合，形成B B细细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体的特点。性，又具有脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体的特点。这种杂交瘤，通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆这种杂交瘤，通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（mAbs mAbs），简称单抗。），简称单抗。第4页
3、，本讲稿共39页单克隆抗体技术的发展经历单克隆抗体技术的发展经历2 第二部分第5页，本讲稿共39页鼠源性单克隆抗体嵌合性单克隆抗体人源化单克隆抗体全人源单克隆抗体鼠源性单克隆抗体是来源于鼠蛋白，因此对于人体而言是外来物从而易被抵抗。嵌合性单克隆抗体是指同时具有人和鼠的来源构成，通常是30%比70%。鼠源部分用来结合抗原，人源部分用来诱导产生疗效。人源化抗体就是指抗体的可变区部分或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。单克隆抗体技术发展经历单克隆抗体技术发展经历第6页，本讲稿共39页单克隆
4、抗体的制备单克隆抗体的制备3 第三部分第7页，本讲稿共39页单克隆抗的制备单克隆抗的制备动物免疫动物免疫11234细胞融合和选择性培养细胞融合和选择性培养杂交瘤细胞的筛选及克隆化杂交瘤细胞的筛选及克隆化大量制备及纯化大量制备及纯化第8页，本讲稿共39页单克隆抗体制备的简易流程单克隆抗体制备的简易流程第9页，本讲稿共39页动物免疫动物免疫抗原制备抗原制备：制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不：制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好，同时可以减
5、轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好，同时应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来同时应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混说，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。必须对抗原进行纯化。第10页，本讲稿共39页免免疫疫动动物物的的选选择择：一一般般的的杂杂交交瘤瘤生生产产都都选选用用BALB/c小小鼠鼠或或LOU/c大大鼠鼠作作为为免免疫疫动动物物。但但是是，有有时时为为了了特特殊殊目目的的而而需需进
6、进行行种种间间杂杂交交，则则可可免免疫疫其其他他动动物物。就就小小鼠鼠而而言言，初初次次免疫时以免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于操作。周龄为宜，雌性鼠较便于操作。第11页，本讲稿共39页免免疫疫程程序序的的确确定定：在在设设计计免免疫疫程程序序时时，应应考考虑虑到到抗抗原原的的性性质质和和纯纯度度、抗抗原原量量、免免疫疫途途径径、免免疫疫次次数数与与间间隔隔时时间间、佐佐剂剂的的应应用用及及动动物物对对该该抗抗原原的的应应答答能能力力等等。没没有有一一个个免免疫疫程序能适用于各种抗原。程序能适用于各种抗原。第12页，本讲稿共39页目目前前常常用用的的免免疫疫程程序序第13页，本讲稿共39
7、页细胞融合和选择性培养细胞融合和选择性培养第14页，本讲稿共39页融合过程中，常采用聚乙二醇（融合过程中，常采用聚乙二醇（PEGPEG）作为融合诱导剂。）作为融合诱导剂。PEGPEG促进细胞融合的机制可能是与临近细胞膜的水分相结促进细胞融合的机制可能是与临近细胞膜的水分相结合使细胞间的水分被取代，降低细胞表面的极性，导致合使细胞间的水分被取代，降低细胞表面的极性，导致脂质双分子层不稳定，引起细胞膜的融合脂质双分子层不稳定，引起细胞膜的融合 。注意注意：PEG PEG 的分子量和浓度与融合效果相关，的分子量和浓度与融合效果相关，PEG PEG 的分子的分子量越大，浓度越高，其促融率也越高，但其粘
8、度和细胞的毒量越大，浓度越高，其促融率也越高，但其粘度和细胞的毒性也随之增大；浓度低于性也随之增大；浓度低于3030时，融合率低。时，融合率低。第15页，本讲稿共39页 HAT选择性培养选择性培养1964年年Littlefield首先发明了首先发明了HAT(HHypoxanthine次黄嘌呤，次黄嘌呤，AAminopterin甲氨喋呤，甲氨喋呤，TThymidine 胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷)选选择性培养。择性培养。HAT选择性培养基是根据次黄嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生选择性培养基是根据次黄嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成途径设计的。物合成途径设计的。第16页，本讲稿共39页细胞内细胞内DNADN
9、A的生物合成途径的生物合成途径主要生物主要生物合成途径合成途径补救途径补救途径甲氨喋呤甲氨喋呤次黄嘌呤次黄嘌呤次黄嘌呤次黄嘌呤核苷酸核苷酸HGPRT+TK+胸腺嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶脱氧核苷酸脱氧核苷酸DNA利用糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA叶酸拮抗物氨基蝶呤可阻断主要途径第17页，本讲稿共39页小鼠小鼠HGPRTHGPRT-骨髓瘤细胞（骨髓瘤细胞（Sp2/0Sp2/0）融合后的细胞在融合后的细胞在HATHAT选择培养基中结局选择培养基中结局Sp2/0+BSp2/0Sp2/0BBSp2/0B死亡死亡死亡死亡 存活存活第18页，本讲稿共39页杂交瘤细胞的筛选及克隆化杂交瘤细胞的筛选及
10、克隆化第19页，本讲稿共39页 克隆化克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。分泌细胞分开。克隆化的克隆化的原则原则：尽早进行，反复：尽早进行，反复4-5次次克隆化方法：克隆化方法：有限稀释法有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法、软琼脂平板法、显微克隆法阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染染第20页，本讲稿共39页mm1144332242444233324444422
11、2443333333333有限稀释法有限稀释法第21页，本讲稿共39页大量制备及纯化大量制备及纯化大量制备大量制备第22页，本讲稿共39页纯化方法纯化方法1 1、盐析、盐析2 2、凝胶过滤、凝胶过滤3 3、离子交换层析、离子交换层析4 4、亲和层析法、亲和层析法第23页，本讲稿共39页盐析盐析：用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中，高浓度的盐离子有：用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出。很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出
12、。血清血清 50%饱和度硫酸胺饱和度硫酸胺 上清上清（清蛋白）（清蛋白）沉淀（球蛋白）沉淀（球蛋白）33%饱和度硫酸胺饱和度硫酸胺 上清上清 沉淀沉淀 拟球蛋白拟球蛋白 r球蛋白球蛋白第24页，本讲稿共39页 凝胶过滤法凝胶过滤法：干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将蛋白质：干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将蛋白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进入。胶粒内，留在胶粒间隙的溶液中，随洗脱液最先流出，小分入。胶粒内，留在胶粒间隙的溶液中，随洗脱液最先流出，小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶的阻留，向下移
13、动子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶的阻留，向下移动较慢洗脱出来较慢，据此将不同大小的蛋白质分离出来。较慢洗脱出来较慢，据此将不同大小的蛋白质分离出来。交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶(SephadexSephadex）琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶(Sepharose)Sepharose)第25页，本讲稿共39页离子交换层析法离子交换层析法DEAEDEAE纤维素纤维素：结合溶液中带负电荷的蛋白质，又称阴离：结合溶液中带负电荷的蛋白质，又称阴离子交换剂子交换剂CMCM纤维素纤维素：结合溶液中带正电荷的蛋白质，又称阳离子：结合溶液中带正电荷的蛋白质，又称阳离子交换剂交换剂第26页，本讲稿共39页将抗原（
14、或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附液相将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物，然后改变中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物，然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化的抗体（或抗条件，使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化的抗体（或抗原）。原）。A A蛋白蛋白-Sepharose CL 4BSepharose CL 4B亲和层析法：亲和层析法：第27页，本讲稿共39页单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用4 第四部分第28页，本讲稿共39页作为生物治疗的导向武器作为生物治疗的导向武器作为免疫抑制剂作为免疫抑制剂作为研究工作中的探针作为研究工作中的探针增强
15、抗原的免疫原性增强抗原的免疫原性检验医学诊断试剂检验医学诊断试剂农兽药的快速检测农兽药的快速检测作为亲和层系的配体作为亲和层系的配体应用单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用第29页，本讲稿共39页作为亲和层系的配体作为亲和层系的配体单单克克隆隆抗抗体体能能与与其其相相应应的的抗抗原原特特异异性性结结合合，因因而而能能能能够够从从复复杂杂系系统统中中识识别别出出单单个个成成分分。只只要要得得到到针针对对某某一一成成分分的的单单克克隆隆抗抗体体，固固定定在在层层析析柱柱上上，通通过过亲亲和和层层析析，即可从复杂的混合物中分离、纯化这一特定成分。即可从复杂的混合物中分离、纯化这一特定成分。优优点点：与与
16、其其他他提提取取方方法法相相比比，具具有有简简便便、快快速速、经济、产品活性高等优点。经济、产品活性高等优点。第30页，本讲稿共39页蛋白质提纯蛋白质提纯先用待提纯蛋白质制成单抗，再将单抗固定在惰性固相先用待提纯蛋白质制成单抗，再将单抗固定在惰性固相 基质上，制基质上，制成层析柱。而后倒入混合液，当混合液流经单抗时，相应的蛋白质与成层析柱。而后倒入混合液，当混合液流经单抗时，相应的蛋白质与单抗特异性结合，杂质则随洗脱剂流走。再用特殊的洗脱剂将蛋白质单抗特异性结合，杂质则随洗脱剂流走。再用特殊的洗脱剂将蛋白质洗脱下来，则可将蛋白质提纯洗脱下来，则可将蛋白质提纯。在亲和层析中单克隆抗体是在亲和层析
17、中单克隆抗体是主要的配体主要的配体第31页，本讲稿共39页作为生物治疗的导向武器作为生物治疗的导向武器以抗肿瘤为例：将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或以抗肿瘤为例：将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将药物或放疗物质放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将药物或放疗物质携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为肿瘤导向治疗。另外，将携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为肿瘤导向治疗。另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射免疫放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。显像，协助肿瘤的诊断。常见抗
18、肿瘤细胞毒剂常见抗肿瘤细胞毒剂：化疗药物、细菌毒素、植物：化疗药物、细菌毒素、植物毒素或放射性同位素等。毒素或放射性同位素等。这不仅提高了抗体的疗效，也可降低细胞毒剂对正这不仅提高了抗体的疗效，也可降低细胞毒剂对正常细胞的毒性反应。常细胞的毒性反应。第32页，本讲稿共39页作为免疫抑制剂作为免疫抑制剂抗人抗人T T淋巴细胞单抗（淋巴细胞单抗（McAbMcAb）作为一种新型免疫抑制剂，已广）作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应，泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应，其作用机理有赖于其作用机理有赖于McAbMcAb的种类及其免疫学特性。的种类
19、及其免疫学特性。例子例子：对于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗：对于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T T细胞单抗细胞单抗加补体处理，能够减轻移植物抗宿主病的发生。加补体处理，能够减轻移植物抗宿主病的发生。第33页，本讲稿共39页作为研究工作中的探针作为研究工作中的探针利用单克隆抗体的特性可把它作为研究工作中的探针。此时，利用单克隆抗体的特性可把它作为研究工作中的探针。此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能关系，进而可以从理论上阐明其机理。构与功能关系，进而可以从理论上阐明其机理。例子例子：用荧光物质标记单抗作
20、为探针，能快速地确定与其结：用荧光物质标记单抗作为探针，能快速地确定与其结合的相应生物大分子在细胞中的位置和分布合的相应生物大分子在细胞中的位置和分布。第34页，本讲稿共39页3佐剂能刺激佐剂能刺激吞噬细胞对吞噬细胞对抗原的处理抗原的处理5可可刺刺激激致致敏敏淋淋巴巴细细胞胞的的分分裂裂和和浆浆细细胞胞产生抗体产生抗体2增增加加抗抗原原的的表表面面积积，使使抗抗原原易易于于被被巨巨噬噬细胞吞噬细胞吞噬7改改变变抗抗体体的的产产生生类类型型以以及及产产生生迟迟发发型型变变态态反反应应，并使其增强并使其增强4可可促促进进淋淋巴巴细细胞胞之之间间的的接接触触，增增强强辅辅助助T T细胞的作用细胞的作
21、用6可可提提高高机机体体初初次次和和再再次次免疫应答免疫应答增强抗原的免疫原性增强抗原的免疫原性1改变抗原的物理性状，可改变抗原的物理性状，可使使抗抗原原物物质质缓缓慢慢地地释释放放，延长了抗原的作用时间延长了抗原的作用时间将单抗制成佐剂加在疫苗里，则可减少疫苗接种时药物的用量和避免多次接种并不将单抗制成佐剂加在疫苗里，则可减少疫苗接种时药物的用量和避免多次接种并不能引起机体更好地产生免疫应答，从而减少疫苗接种的风险能引起机体更好地产生免疫应答，从而减少疫苗接种的风险。佐剂的佐剂的作用机理作用机理：第35页，本讲稿共39页细胞因子的测定激素测定肿瘤抗原的检测免疫细胞及其亚群的的检测病原微生物抗
22、原、抗体的检测作为检验医学实验室的诊断试剂，单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术。并且单克隆抗体的应用，很大程度上促进了商品化试剂盒的发展。检验医学诊断试剂检验医学诊断试剂第36页，本讲稿共39页农兽药快速检测农兽药快速检测农兽药属于小分子物质，半抗原，无免疫原性，不农兽药属于小分子物质，半抗原，无免疫原性，不 能刺激动物产生抗体，必须先将其制备成人工抗原，能刺激动物产生抗体，必须先将其制备成人工抗原，以人工抗原免疫动物，使动物的免疫系统发生应答反以人工抗原免疫动物，使动物的免疫系统发生应答反 应，应，从而制备出对
23、该农药具特异性的多或单克隆抗体从而制备出对该农药具特异性的多或单克隆抗体 国外已国外已制备多种农兽药单克隆抗体并应用于农药和兽制备多种农兽药单克隆抗体并应用于农药和兽 药残留的药残留的免疫分析。免疫分析。第37页，本讲稿共39页展望展望5 第五部分第38页，本讲稿共39页展望展望单克隆抗体的这些特性使得它成单克隆抗体的这些特性使得它成为治疗学上的热点为治疗学上的热点最最突突出出的的问问题题是是如如何何降降低低单单抗抗的的免免疫疫原原性性，单单抗抗的的异异源源性性所所引引起起的的抗抗体体反反应应，不不但但降降低低了了单单抗抗的的效效价价，而而且且会会给给患患者者带来严重的后果。带来严重的后果。对对异异源源性性单单抗抗进进行行改改造造及及人人源源性性单单抗的研制成为单抗的重要研究方向抗的研制成为单抗的重要研究方向第39页，本讲稿共39页