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1、最新：虫媒传染病的快速精准实验室诊断摘要近年来随着气候变暖、城市化、土地开垦、人口增长、生活习惯和交通方 式的改变，媒介昆虫传播的人类传染病（虫媒传染病）快速增加，对公共 卫生安全造成严重威胁。该文介绍了当前虫媒传染病的流行病学、临床特 征特别是实验室诊断等方面的内容，强调各医疗机构应重视虫媒传染病的 快速精准实验诊断。而对于原因不明的虫媒传染病，宏基因组二代测序也 展现出了潜在的应用价值。虫媒传染病是一类由节肢动物接触或叮咬动物宿主或人而引起的一类传 染病。全球每年有数亿人感染虫媒病原体并可导致约百万人死亡L 2 L 虫媒病原体包括病毒、立克次体、细菌、螺旋体和寄生虫等，其中虫媒病 毒是最主
2、要的病原体。虫媒病原体通过传播媒介而感染人类，主要传播媒 介包括节肢动物门中的昆虫纲和蛛形纲，如蚊、蝇、白蛉、噱、虻、蚤、 虱、蛾、婢、螭和臭虫等，其中蚊类最常见,其次为婢3, 4, 5, 6 L虫 媒传染病的临床表现常为非特异，与其他感染性疾病有重叠，容易造成漏 诊误诊。实验室检测是明确虫媒传染病病原的重要手段。经典的实验室检 测方法主要包括病原体培养和免疫学检测，但由于培养条件苛刻、耗时长 或较长的窗口期，难以实现早期快速检测。近年来随着微流控技术、等温 扩增技术和成簇间隔的短回文重复序列及其关联蛋白（clustered 变异，导致临床症状不典型或不特异，对虫媒病原体及时、准确地检测是 虫
3、媒传染病防控的关键，对患者的临床救治也具有重要意义。受限于虫媒病原体本身复杂的生物学特性，在实验室检测中仍然以经典的 病原学检测、常规免疫学检测及常规分子生物学检测方法为主。病原体分 离培养是金标准，但是繁琐、不易操作，且很多虫媒病原体并不适用于分 离培养；免疫学检测方法在区分急性期和恢复期方面有优势，但在应用中 也有局限性；分子生物学技术可以检测样本中的虫媒病原体，以其高灵敏 度、高特异性和高扩增效率成为目前虫媒传染病最主要的检测方法。目前 随着科学技术的进步，POCT技术和mNGS技术已成为虫媒传染病快速 精准检测的重要手段，并为虫媒传染病检测领域的发展开拓出崭新的局面。 表1列举了免疫学
4、技术、分子生物学技术、POCT技术和mNGS技术的 优缺点以及应用场景。在实际临床检测中，需保证检测的灵敏度和准确性，确保检测的简便性及 快速检测的需求，此外还有考虑检测通量的需求，实现低成本检测等。因 此，为了满足临床检测的需求，未来需要不断对检测技术进行创新和改进， 检测技术会逐步向高通量、低成本、灵敏精准、简便高效的方向发展，为 虫媒传染病的临床诊疗提供更多可靠准确、及时有效的检测结果，以便更 好地为临床服务。参考文献（略） regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR- associated proteins , CRIS
5、PR/Cas ）技术的快速发展,出现了多种核酸 即时检测（point-of-care testing , POCT ）方法，能够有效地实现虫媒 传染病的快速精准实验诊断。本文介绍了当前虫媒传染病的流行病学、临 床特征，特别是虫媒传染病常用实验室诊断方法及具有潜在应用价值的新 方法，希望能够为我国虫媒传染病的诊断与防控提供参考。一、流行特征虫媒传染病大都属于自然疫源性疾病，传播媒介将病原体通过机械性传播 和生物性传播的方式传播给人类。只有当宿主、传播媒介和易感群体3个 基本条件同时存在并相互作用时才能完成，同时受社会环境、自然地理因 素和季节气候因素的影响和制约2,7。因此，虫媒传染病具有以下流
6、 行特征：（1 ）传播方式较单一：主要为动物-昆虫-人和人-昆虫-人的形式， 人-人的形式极少见3 1常见的虫媒传染病如乙型脑炎、疟疾、登革热、 流行性出血热等均是通过一些昆虫传播或者鼠类传播，如蚊子先叮咬患者, 然后再叮咬健康人，同时将细菌或病毒传入健康人的体内导致发病。（2 ） 时空特征性强：虫媒传染病具有很强的地域性与季节性。虫媒传染病的发 生和流行与虫媒种类的地理分布有直接关系。我国云南生态环境复杂，是 蚊虫媒介和病毒多样性最高的地区，三带喙库蚊和中华按蚊为优势蚊种， 携带最多的虫媒病毒依次为乙型脑炎病毒、环状病毒和版纳病毒8 L本 期陈易居等9的研究显示四川省西昌市的蚊虫以库蚊为主，
7、主要包括 三带喙库蚊和致倦库蚊,同样携带有G I -b型的乙型脑炎病毒、A2型的 版纳病毒、云南环状病毒及西藏环状病毒等，这些病毒在我国的四川与云 南较多见。季节性是虫媒传染病的另一重要流行特征，因为媒介节肢动物 是变温动物，其孳生和生活等常受环境影响，特别是温度、湿度、光照和 降水量等气候因素与其种群的数量增加密切相关，例如我国乙型脑炎发病 高峰主要集中在7-8月,登革热发病高峰主要集中在810月10 (3)扩散迅速：当某一宿主携带某种病原体时，可以通过媒介叮咬人类 造成当地多人发病，也可以随气温变化，媒介迁移栖息，将病原体从一个 地区带到另一地区，引起扩散，波及更大范围。近年来，由于国际交
8、往和 交通条件日益发达，虫媒传染病的病原体及媒介动物扩散到世界各地，导 致虫媒传染病的传播和流行区域扩大11。如版纳病毒为东南亚十二节 段RNA病毒属的代表毒株，于1987年从我国西双版纳地区无名热和脑 炎患者脑脊液及血清样本中分离出，此后又陆续从老挝、越南、印度尼西 亚等东南亚国家和我国甘肃、山西、内蒙古、湖北等地区采集的蚊虫或库 噱样本中分离出12二、临床特征根据病原体的种类，通常可将虫媒传染病分为虫媒性病毒传染病、虫媒性 立克次体传染病、虫媒性细菌传染病、虫媒性螺旋体传染病和虫媒性寄生 虫病等。每类虫媒传染病均有类似的临床特征，如虫媒性病毒传染病隐性 感染者多见，发病潜伏期常为310 d
9、 ,但临床特征差异也明显，呈现为 不同的症候群：(1 )发热、皮疹和流感样症候群，如寨卡病毒病和基孔肯 雅病毒病；(2)关节炎症候群，如基孔肯雅病毒病和登革热；(3 )脑炎脑 膜炎症候群，如黄热病和西尼罗病毒病、基孔肯雅病毒病及寨卡病毒病； （4 ）出血热症候群，如克里米亚-刚果出血热、裂谷热和登革热4 L本期陈良君等13 在我国新发婢传病毒性疾病的临床特征及实验检测研 究进展一文中详细介绍了重要婢传病毒性疾病的临床特征，并特别强调 发热伴血小板减少综合征的临床表现为非特异性的，大部分患者可能会出 现发热、头痛、乏力和肌肉酸痛等全身症状，但恶心、呕吐、腹痛和腹泻 等胃肠道症状也比较常见，另外一
10、些严重患者则出现意识障碍等神经系统 表现，这些导致很难与其他具有类似症状的疾病进行区分，因此早期诊断 极为关键。虫媒性立克次体传染病近年发病率有所上升，主要包括恙虫病、鼠源性斑 疹伤寒、流行性斑疹伤寒、斑点热、无形体病和埃立克体病等。立克次体 根据血清学反应分为3个群：斑点热群、斑疹伤寒群和丛林斑疹伤寒群。 多数立克次体病临床上可表现为发热、头痛和皮疹三联征，但特异性皮疹 并非在所有虫媒性立克次体传染病患者中存在，因此增加了临床诊断难度。 虫媒性寄生虫病包括虫媒性原虫病（如疟疾、黑热病、弓形体病等）和虫 媒性蠕虫病（如丝虫病、眼结合膜吸吮线虫感染、美丽筒线虫病等）0其 中最受人关注的是疟疾，其
11、是一种由疟原虫经按蚊叮咬而传播的寄生虫病, 发病病程常分为3期，即寒战、发热、出汗。严重疲劳者可出现高热、剧 烈头痛、澹妄抽搐和深昏迷14 ,其临床表现的复杂性和多样性很容易 造成误诊漏诊，因此早期病原诊断极为关键。虫媒性细菌传染病和虫媒性 螺旋体传染病则在我国较少发生。三、实验室诊断虫媒传染病的经典检测方法主要包括病原学检测和血清学检测两个方面。 病原体分离鉴定是目前最可靠的确诊方法，尤其是对新发传染病的病原学 确诊更为重要。但是由于众多虫媒病原体如立克次体、螺旋体以及寄生虫 等难以体外培养15,即使部分病原体能够进行细胞培养和动物接种培 养，也耗时长、成本高和技术难度大，且可能需要在高等级
12、的病原微生物 实验室中进行15,因此在临床检验工作中难以实现，且不能满足传染 病早期快速诊断的需要，而借助于免疫学方法特别是分子生物学方法则可 能实现虫媒传染病的快速精准实验诊断。近年来，随着纳米材料、应用化 学、光物理学和生物传感等技术的进步，免疫学检测和分子生物学检测技 术也迎来了革命性和创造性的发展，在虫媒传染病的实验室诊断中具有良 好的应用前景和发展前途。(-)免疫学检测传统的检测虫媒传染病的免疫学方法主要包括酶免疫法、免疫荧光法和免 疫层析法等。近年来又出现了很多新的免疫学检测方法，如基于免疫微球、 免疫荧光和流式细胞分析等实验技术建立的荧光微球免疫分析法，以单个 微球作为分析单位，
13、以荧光信号的强弱来检测抗原或抗体的水平，可同时 检测多种抗原或抗体，灵敏度得到进一步提高，应用于多种虫媒性病毒和 疟原虫的诊断16, 17, 18,19 L例如范丽20 将森林脑炎病毒、日本 乙型脑炎病毒、西尼罗热病毒、东方马脑炎病毒、辛德比斯病毒、登革热 病毒6种虫媒病毒的特异性单克隆抗体偶联到不同的荧光微球上，利用免 疫学经典方法双抗体夹心的技术原理，建立能同时快速检测以上6种病 毒的液相芯片多重检测技术平台，为高通量、快速、准确地检测虫媒病毒 的感染提供新的方法。与传统免疫学方法相比，荧光微球免疫分析法具有 高通量、敏感性高、重复性好、节省样本和时间等优点，特异性相当，但 在实际应用时也
14、存在一些缺点。首先，荧光微球免疫分析法所使用的免疫 分析原理依赖于特异抗原抗体的有效结合，然而临床样品中一些血清蛋白 会诱发抗体的交叉反应，从而降低了其检测的敏感性以及特异性；另外, 目前可分辨的荧光微球的数量较少，荧光的颜色或者强度容易受到荧光光 谱重叠以及背景干扰的影响，会导致其检测限降低。尽管免疫学检测有助 于虫媒传染病的确诊，但局限性也很明显:（1 ）窗口期，如伤寒立克次体 和伯氏考克斯体等感染，其特异性抗体直到感染后的第2周才能检测到 21 ,甚至部分虫媒传染病需要通过急性期和恢复期血清之间的抗体滴 度增加4倍或以上来明确诊断，难以实现早期快速诊断22 L本期高慧 等23 报道的15
15、例海南危重型立克次体病，其中12例最终检出恙虫 病东方体，3例检出莫氏立克次体，但发病早期外斐反应均为阴性。（2 ） 病原体的交叉反应，如黄热病毒、流行性乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病 毒等之间的交叉反应很大，无法有效区分，对某些病毒（如登革病毒）也 无法进行血清学分型24 L（二）分子生物学检测当前，多种分子生物学检测方法，如聚合酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR 核酸分子杂交技术和基因芯片技术等，可用于虫媒传染 病的基因检测和病原学诊断。其中PCR技术又包括多重PCR、巢式PCR 和实时定量PCR技术等，已经成为虫媒病原体感染实验室诊断的重要手段23
16、这些方法的灵敏度应优于培养法、涂片镜检法和免疫学方法，能 够较快实现样品中的目标病原体的定性或定量分析。但是由于这些方法需 要在有资质的实验室中进行，而虫媒传染病较多分布于山区，当地医疗资 源有限，需要将标本长途转运至有资质的实验室，难以实现即时快速检测, 从而延误患者的诊断与治疗。目前，随着等温扩增技术与CRISPR/Cas等 技术的出现，虫媒病原体的即时快速检测有望实现25, 26, 27 1此外, 随着二代测序技术的发展,宏基因组二代测序(metagenomics next-generation sequencing , mNGS )作为一种广谱的检测方法,已 成为检测原因不明的虫媒传染
17、病的强有力工具。1 .核酸POCT :随着检测技术的进步、医学检验理念的革新以及国家分级 诊疗的持续推进，对POCT的需求越来越多。POCT也是虫媒传播性疾病 未来检验的发展方向28 Xu等29 通过结合逆转录环介导等温扩增 的原理和CRISPR-Cas12a的靶向切割特点,开发了一种单管快速可视化 检测乙型脑炎病毒的方法，在60 min内检测到9个拷贝数川的乙脑病毒 RNA ,且与其他病毒无交叉反应性，特异性极高。You等30 开发了一 种基于 CRISPR-Cas12a x上转磷技术(up-converting phosphor technology , UPT )和侧流免疫层析分析(la
18、teral flow immunochromatographic assay , LFA )，构建了 Cas12a-UPTLFA ,用 于快速检测鼠疫杆菌，具有高灵敏度和特异性，且便携和易于操作，能实 现即时快速检测。本期陈禹希和余方友31 在即时检测技术与虫媒传 染病的实验诊断：应用与挑战一文中系统地介绍了 POCT在虫媒性病毒 病、虫媒性细菌病和虫媒性寄生虫病等的应用现状，指出相较于传统的检 测手段，如涂片镜检与分离培养等，POCT具有更高的灵敏度和特异性， 而且大多使用便携式检测设备和仪器，从而使操作更简单。当然POCT技 术也面临一些问题，包括如何实现标准化的室内质控及如何实现不同来源
19、 试剂检测结果的一致性等。基于当前遇到的这些问题，强调未来应建立标 准化的POCT检测指南以及系统、完善的质量管理体系，减少POCT检验 结果的误差,确保批间检测的一致性,从而使POCT在虫媒传染病的早期 快速诊断中发挥优势。2.mNGS :多研究报道显示虫媒传染病的临床特征不典型,如本期高慧等 23 提到对立克次体病具有诊断意义的典型皮疹或焦痂仅占20%。本 期龚萍等32 称归县日本斑点热流行和实验室特征分析一文中提到 只有61.1 %的患者具有非瘙痒无痛有晕轮样红斑的陨石坑样黑色焦痂。由 于缺乏典型的临床表现，临床医生难以选择合适的实验室生物标志用于明 确诊断。高慧等23 和龚萍等32 两
20、个研究组先后均采用mNGS技 术明确立克次体病诊断。mNGS是一种通过对临床标本中人和病原体的遗 传物质（DNA或RNA ）构建宏基因组文库后,利用二代测序平台对数十 万到数百万条核酸分子序列进行读取，经过生物信息学分析去除人源片段 后，可以鉴定数据库中已有基因组序列的病原体，同时获得病原体的序列 数和丰度等数据。当发现未知序列时，通过组装全基因组并与现有的病原 体基因组进行差异比较和溯源，则有可能发现新的病原体，在比较理想情 况下可以对感染的病原实现一样全检。相较于其他常规分子生物学方法, mNGS在新发、少见、罕见、变异病原以及混合感染等方面的检测优势明 显33 ,众多专家共识把mNGS作
21、为感染性疾病的病原诊断的一种有效 方法34L mNGS能够同时检出细菌、真菌、病毒和寄生虫等多种病原 体，病原谱覆盖广，而且能够通过非序列同源性的方式发现新病原体。同 时极低含量的病原体也可以检测出来，灵敏度相对更高。能对不同来源的 样品同时进行检测，样本谱广。本期王曼媛等35 在宏基因组测序技 术在虫媒传播疾病诊断中的应用与思考一文中详细介绍了 mNGS在虫 媒性病毒病、虫媒性细菌病、虫媒性立克次体病、虫媒性螺旋体病和虫媒 性寄生虫病的应用现状,肯定了 mNGS在这些疾病的诊断以及病原体溯 源中的价值，但也指出mNGS有其局限性，包括检测过程影响因素众多、 背景微生物的干扰不可避免、不同的方法和平台可能影响检测结果、用于 耐药性检测与宿主免疫力的评估尚不成熟等。尽管如此，随着检测流程、 检测结果分析和解读等方面的不断优化，未来mNGS有望成为临床表现 不典型的虫媒传染病的重要检测工具36, 37 J,四、总结与展望尽管虫媒传染病具有很强的地域性与季节性，但随着城市化、生活习惯和 交通方式的改变，不仅虫媒传染病会出现跨地区播散，人类也会跨区域跨 地区生活与居住。在环境和宿主改变的双重压力下，病原体可发生适应性