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1、附件2专业技能训练（）指导书课程类别: 专业必修课适用对象:室内检测/环境工程专业（三年学制）独立实践学时：54一、实训内容及要求实验一、普通光学显微镜的构造和使用实训要求：（一）学习普通光学显微镜的结构、各部分功能及使用方法。（二）学习并掌握油镜的原理和使用方法。 （三）需提交资料 实训结束时，学生需要提供以下资料：1.细菌标本的观察绘制图稿。2.实验报告。 实验二、培养基的制备实训要求：（一） 学习制备培养基的基本技术（二） 制备牛肉膏蛋白琼脂培养基 （三）需提交资料 实训结束时，学生需要提交实验报告。实验三、干热灭菌及高压蒸汽灭菌实训要求：（一）了解干热灭菌及高压蒸汽灭菌的操作方法。 （
2、二）需提交资料 实训结束时，学生需要提交实验报告。实验四、细菌的革兰氏染色实训要求：（一） 掌握染色的原理和操作过程、掌握简单染色和革兰氏染色法（二） 熟悉显微镜的使用技术 （三）需提交资料 实训结束时，学生需要提交实验报告。实验五、大肠菌群的测定实训要求：（一）学习大肠菌群的测定方法（二）学会使用大肠菌群最可能数检索表 （三）需提交资料 实训结束时，学生需要提交实验报告。二、实训过程（含步骤）实验一、普通光学显微镜的构造和使用一、目的与要求（一）学习普通光学显微镜的结构、各部分功能及使用方法。（二）学习并掌握油镜的原理和使用方法。二、原理普通光学显微镱由机械装置和光学系统2大部分构成。在光学
3、系统中，物镱的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜中配置的几种物镱以油镱的放大倍数最大，与其它物镜相比，使用较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，以增加照明亮度和提高分辨率。三、材料与仪器（一）菌种金黄色葡萄球菌及枯草杆菌染色玻片标本，啤酒酵母水浸片。（二）其他 香柏油、二甲苯、显微镱、擦镜纸。四、操作步骤 （一）显微镜的安置置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘34cm，镱检时姿势要端正。（二）调节光源安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镱采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或平面反光镜度调节其
4、角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。 （三）低倍镜观察 将标本玻片置于载物台上，用标本夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方，下降10物镜，使其接过标本，用粗调节器（粗调螺旋）慢慢升起镜筒，出现图像后再用细调节器（细调螺旋）调节图像至清晰。通过标本夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适目的物，仔细观察。 （四）高倍镜观察 在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置，以聚光镜器光圈及视野进行适当调节后微调细调节器使物象清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录。（五）油镜观察 在低倍镜或高倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高约2厘
5、米，然后在待观察区域滴加12滴香柏油，将油镜转到工作位置，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接，将聚光器升至最高位置并开足光圈，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物象并用细调节器使其清晰为止。（六）显微镜用后处理1、上升镜筒，取下载片。2、用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上残留的油迹，然后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。3、用擦镜纸清洁其他物镜和目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。4、将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八字形”再向下旋，同时把聚光镜降下，以免物镜与聚光镜发生碰撞危险。五、实验报告（一）结果分别绘出在
6、不同物镜下观察到的不同的菌种的形态，同时注明放大倍数。（二）思考题1油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？2显微镜中调节光线强弱的装置有哪些？实验二、培养基的制备一、目的与要求（一）学习制备培养基的基本技术。（二）制备牛肉膏蛋白琼脂培养基。二、原理 牛肉膏蛋白培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌培养基，这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，可供作繁殖之用，制作固体培养基时须加2%琼脂，培养细菌时，应用稀酸或稀碱将PH调至中性或微碱性。牛肉膏蛋白培养基的配方：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，pH7.47.6。三、材料与仪器（一）试剂牛肉膏，蛋白胨
7、、NaCl、琼脂、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。(二)其他试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，漏斗，乳胶管，弹簧夹，纱布，棉花，牛皮纸，线绳，pH试纸，电炉，台称。四、操作步骤（一）称量根据用量按比例依次称取成分，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，蛋白胨易吸湿，称量时要迅速。（二）溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，加热，ZHU一加入各成分，使其溶解，琼脂在溶液煮沸后加入，融化过程需不断搅拌。加热时应注意火力，勿使培养基烧焦或溢出。溶好后，补足所需水分。（三）调PH 用1mol/L NaOH或1mol/L HCl把PH调至所需范围。（四）过滤趁热用滤纸或
8、多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察，如无特殊要求时可省去此步骤。（五）分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三解瓶内，分装装置如实验图8所示；分装时注意，勿使培养基沾染在容器口上，以免沾染棉塞引起污染。1液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜，分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的1/2为宜。2固体分装 分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，斜面长度不超过管长的1/2。分装三解瓶，以不超过容积的1/2为宜。3半固体分装装置以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。（六）加棉塞分装完毕后，在试管口或三解瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等，以阻止外界
9、微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性能。 （七）包扎棉塞头上包一层牛皮纸，扎紧，即可进行灭菌。（八）保存灭菌后的培养基放入37养箱中培养24小时，以检验灭菌的效果，无污染方可使用。五、实验报告（一）结果说明你配制培养基过程中的情况。（二）思考题1培养基配制时应注意什么问题？为什么？2分装培养基时为什么要使用弹簧夹？3培养基配好后，为什么要立即灭菌？实验三、干热灭菌及高压蒸汽灭菌一、目的与要求了解干热灭菌及高压蒸汽灭菌的操作方法。二、原理干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白凝固变性而达到灭菌的目的，细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则
10、蛋白凝固越快，反之含水量越小凝固越慢。因此与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160170），时间长（12h）。高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放入一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾产生蒸汽，水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于水蒸汽不能溢出而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点升高，得到高于100的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。一般培养基用0.1MPa、121.1. 1530min可达到彻底灭菌,灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变. 三、材料与仪器吸管、培养皿、试管、电热干燥箱，手提试高压蒸汽灭锅，
11、牛肉膏蛋白胨培养基、蒸馏水。四、操作步骤（一）干热灭菌法适用于空的、干燥的玻璃器皿的灭菌。培养基不适用。1将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电热干燥箱（注意留有一定的间隙），关好箱门。2接通电源，打开排气孔，使箱内湿空气能逸出，旋动恒温调节器，保持加热升温状态，至箱内达到100时关闭排气孔。3当温度升到160170时，借恒温调节器的自动控制，保持此温度2h。 4切断电源，冷却至70时，打开箱门，取出灭菌物品（未降至70度以前，切勿打开箱门，否则温度骤降导致玻璃器皿炸裂）。（二）高压蒸汽灭菌1首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角架相平为宜。2放回内层锅，并装入待灭
12、菌物品（内装培养基或小的三角瓶），不要装得太挤，以免妨碍汽流通影响灭菌效果，三角瓶口不要与桶壁接触，以免冷凝水淋温包口的纸而透入棉塞。加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个棉栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。 3用电炉或其他方法加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气，待冷空气排尽后，关上排气阀让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内达到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。 4停止加热，待压力表的压力降至零位时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。注意：当压力不为零时，不能开盖取物否则由于压力突然下降，容器内外压力不平衡而冲
13、出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染而发生污染，甚至灼伤操作者。5高压灭菌锅上的安全阀，是保障安全使用的重要机构，不得随意调节。五、实验报告（一）结果检杳灭菌是否彻底。（二）思考题1干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？2为什么干热灭菌所需温度要比湿热灭菌高？ 3高压蒸汽灭菌时，为什么要排尽锅内的空气？ 实训四 细菌的革兰氏染色一、目的与要求（一）掌握染色的原理和操作过程（二）掌握简单染色和革兰氏染色法（三）熟练显微镜的使用技术二、原理由于菌体极小，折光率低，在显微镜下不容易看清，如将其染色，使菌体和背景之间反差增大，折光率增强，就容易看清，简单染色法只用一种染料着色。革兰氏染色法是细菌染色中一
14、种重要的鉴别染色法。通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌和阴性菌两大类。其过程是：草酸铵结晶紫初染路哥尔氏碘液媒染95%乙醇脱色蕃红花红复染。若细胞能保持结晶紫与碘所形成的复合物而不被乙醇脱色，则细菌呈紫色，称革兰氏阳性菌，若被乙醇脱色而被蕃红复染成红色，则称革兰氏阴性菌，三、材料与仪器（一）革兰氏染色液（草酸铵结晶紫液路哥尔氏碘液95%乙醇蕃红花红）、蒸馏水、菌落培养物（培养1824小时）、二甲苯、香柏油 （二）载玻片、盖玻片、酒精灯、废液缸、洗瓶、吸水纸、接种环、显微镜、镊子 （三）金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（1216h），大肠杆菌。四、操作程序（一）简单染色法涂片干燥固定染色水洗干
15、燥镜检1涂片取洁净载玻片，在中央滴一滴生理盐水（或无菌水），用接种环以无菌操作挑取欲观察菌体，和水充分混匀，涂成极薄的菌膜。2干燥室温自然干燥或略微加热干燥。3固定涂面朝上，快速通过火焰23次（勿使涂片烫手）。4染色放平染料，用自来水冲洗，直到涂片上流下的水无色为止。6干燥自然干燥或吸水纸吸干，或用电吹风吹干。 （二）革兰氏染色法涂片干燥固定草酸铵结晶紫初染水洗碘液媒染95%酒精脱色2030秒水洗蕃红花红液复染水洗干燥镜检1涂片：先滴一小滴蒸馏水于载玻片中央，然后用接种环取少量菌体轻轻混入水中，涂成一薄层并使细胞均匀分散。2干燥：在空气中令其自然干燥或在酒精灯火焰上端高处微微加温但勿靠近火焰。
16、3固定：把涂有细菌的面朝上，在酒精灯火焰上通过三次，目的是杀死菌体细胞以及改变对染色剂的通透性，同时使涂片的菌体紧贴载玻片而不易被水冲洗脱落。4初染：用草酸铵结晶紫液初染1min，水洗、吸干。5媒染：加一滴路哥尔氏碘液媒染1min、水洗。（此时结晶紫与碘液成复合物）6脱色：斜置载玻片，用95%酒精冲洗约2030s，立即水洗，吸干。7复染：用蕃红花红液复染12min，水洗晾干或用吸水纸吸干。 8镜检：在显微镜油浸镜下检查革兰氏阳性菌和阴性菌染色的差异，并观察菌体形态。（三）革兰氏染色成败的控制点1涂片厚度：涂片过厚，细胞重叠，无法较好地观察单个细菌细胞形态，涂片过薄，细胞数量少，不利于观察； 2
17、染色时间。染色时间过长,结晶紫与细胞结合，脱色不易，染色不够，结晶紫尚未与细胞结合。染色控制不好，易引起误判；3乙醇脱色的程度。如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌；若脱色不够， 则阴性菌被误染为阳性菌。五、实验报告（一）结果说明3株细菌的染色观察结果（形态、颜色革兰氏染色结果）。（二）思考题1你认为制备细菌染色标本时，应注意哪些环节？2哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？实验五 大肠菌群的测定 大肠菌群系指一群在37培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，具有指示菌的一般特征，故以此作为粪便污染指标评价饮水的卫生
18、质量。 水中总大肠菌群数系以100ml水样中污染的总大肠菌群最可能数（MPN）表示。按国家饮用水卫生标准规定，1ml自来水中杂菌数不得超过100个，大肠菌群数1000ml水中不得超过3个才算合格。一、目的和要求1学习大肠菌群的测定方法。2学会使用大肠菌群最可能数检索表。二、基本原理1乳糖发酵试验 乳糖胆盐发酵管内装有乳糖胆盐液体培养基，并在试管内倒置一杜氏管，乳糖起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群则能发酵并产酸产气，经培养后有酸产生，则培养基中的指示剂溴甲酚紫就会变色，培养基由原来的紫色变为黄色。若产气，则小倒管中有气体生成。2分离试验经初步发酵试验后，并不能确定上述产酸产气的微
19、生物为大肠菌群，需进一步证实。伊红美蓝琼脂平板含有伊红美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖产酸产气而使环境变酸时，这两种染料即结合成复合物，使大肠菌群生成带核心的、有金属光泽的深紫色的菌落。3证实试验 挑取认为是大肠菌群的菌落，一方面革兰氏染色，一方面进行乳糖发酵，若既为革兰氏阴性又能发酵乳糖产酸、产气，则可确定大肠菌群的存在，即大肠菌群阳性。三、设备和材料温箱（361） 冰箱（04）天平均数 显微镜子试管 杜氏管 吸管 载玻片 酒精灯 试管架 四、培养基与试剂1乳糖胆盐发酵管注：双料乳糖胆盐发酵管是指除蒸馏水外，其他成分加倍。2伊红美蓝琼脂平板（EMB） 3乳糖发酵管4革兰氏染色液5
20、生理盐水五、操作步骤1水样的采取与稀释，同“水中细菌菌落总数测定”2乳糖发酵试验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置于361温箱中培养242h时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。3分离试验将产气的发酵管分别接在伊红美蓝琼脂平板上，置361温箱内，培养1824h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。4证实试验在上述平板上，挑取符合下列特征的菌落12个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置361温箱内培养242h，观察产气情况，
21、凡是乳糖管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。大肠菌群菌落特征：深紫色、有金属光泽紫黑色，不带或略带金属光泽淡紫色，中心颜色较深六、结果报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml（100g）大肠菌群的最可能数（即MPN值） 七、思考题1大肠菌群有何特点？2大肠菌群认为是被肠道病原菌污染的指示菌，为什么？3经检查，水样是否合乎应用水标准？污染程度如何？三、实训报告的编写指导实验结束后，应严格地根据实验记录数据进行处理和计算，作出相应的结论，并对实验中的问题进行讨论，独立完成实训报告，及时交给指导教师审阅。实训报告应该包括实验报告包括七部分内容： 1
22、、实验目的 2、实验原理。 3、实验步骤（采用流程方框图简单明了地表示）。 4、实验数据记录和数据处理（采用表格形式表示，在表格的左下端注明计算公式和其他采用的数据）。 5、实验结果的讨论（对实验结果的可靠性与合理性进行评价，并解释所观察到的实验现象）。 6、回答思考题 7、问题讨论（针对本实验中遇到的疑难问题，提出自己的见解和收获，也可对实验方法和实验内容提出自己的见解，对训练创新思维和创新能力有何帮助）。 书写实训报告应用语科学、规范，字迹端正，简单扼要，整洁清洁。实训报告写得潦草者，应重写；实训报告中数据是抄袭他人的或是伪造的，实验成绩记为“0”分。实训成绩的评定包括下列内容：实验操作训练；实验结果的正确度与精密度；实验原理和实验基本知识的理解；实验报告的书写与实验结果的讨论；设计性或综合性实验情况。实验成绩的考核既有注意课程要求的全面性，又要注意各测定方法的特殊性，更要注意在实践过程中探索学生能力的考核。四、实训学时分配学时分配: 实训教学总学时数为26学时，其中讲授学时6，实操学时20。学时分配表序号实 训 内 容学时其 中讲授实操其他1光学显微镜的使用4132培养基的制备4133干热灭菌及高压蒸汽灭菌4134革兰氏染色6155大肠菌群的测定826学 时 总 计26620五、参考资料：*对个别实训，必要时加实训设备的详细说明