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1、仪器分析仪器分析一、影响分离的因素factors influenced separation二、柱外展宽choice of separation types三、分离条件的选择choice of HPLC第四节第四节第四节第四节影响分离的因素与操影响分离的因素与操影响分离的因素与操影响分离的因素与操作条件的选择作条件的选择作条件的选择作条件的选择 factors influenced separation and choice of operation condition1、塔板理论一、一、影响分离的因素影响分离的因素 factors influenced separationfactors i
2、nfluenced separation2 2、速率理论（与、速率理论（与GCGC对比）对比）(1)(1)2）涡流扩散项及其影响(2)(2)讨论：1）流动相流速对）流动相流速对HPLC板高的影响（与板高的影响（与GC对比）对比）3）传质阻抗项及其影响）传质阻抗项及其影响 3 3、影响分离的因素、影响分离的因素(1)(2)对流动相的要求：对流动相的要求：1）与固定液不反应）与固定液不反应2）对样品有良好溶解度）对样品有良好溶解度 k=110 k=25 最理想的最理想的3）与检测器匹配：）与检测器匹配：UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）荧光，电化学荧光
3、，电化学4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用前过滤、脱气使用前过滤、脱气(3)洗脱方式洗脱方式 1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）类似类似GC的等温度洗脱的等温度洗脱2）梯度洗脱：）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例 即不断改变其极性（两个泵）即不断改变其极性（两个泵）适于分析极性差别较大的复杂组分适于分析极性差别较大的复杂组分 类似类似GC的程序升温（沸程较长样品）的程序升温（沸程较长
4、样品）二、柱外展宽二、柱外展宽柱外展宽柱外展宽：指从进样点到检测池之间除柱子：指从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积引起的色谱峰展宽，本身以外的所有死体积引起的色谱峰展宽，柱效下降。柱效下降。柱前展宽柱前展宽：由进样引起：由进样引起 减小进样器的死体积，进样到中心，可减减小进样器的死体积，进样到中心，可减小柱前谱带展宽，提高柱效小柱前谱带展宽，提高柱效柱后展宽柱后展宽：由接管、检测器流通池记检测器：由接管、检测器流通池记检测器响应时间等因素引起。响应时间等因素引起。可用短而细的接管，减少流通池体积，改进可用短而细的接管，减少流通池体积，改进检测器和记录系统的响应速度减少柱后展宽检测器
5、和记录系统的响应速度减少柱后展宽1.1.影响分离的因素与提高柱效的途径影响分离的因素与提高柱效的途径 在在高高效效液液相相色色谱谱中中,液液体体的的扩扩散散系系数数仅仅为为气气体体的的万万分分之之一一，则速率方程中的分子扩散项则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可忽略不计，即：较小，可忽略不计，即：H=A+C u 故液相色谱故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。三、HPLC法中分离条件的选择 液液体体的的黏黏度度比比气气体体大大一一百百倍倍，密密度度为为气气体体的的一一千千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途
6、径。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色谱中，不可能通过液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温增加柱温来改善传质。恒温 改变淋洗液组成、极性是改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。改善分离的最直接的因素。2.2.固定相及分离柱固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。谱，其选用原则与气相色谱一样。选粒径小的、分布均匀的球形固定相选粒径小的、分布均匀的球形固定相 （dp10m）首选化学键合相，匀浆法装柱首选化学键合相，匀浆法装柱但在高效液相色谱中，分离
7、柱的制备是一项技术要但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。求非常高的工作，一般很少自行制备。3.流动相及其流速的选择选粘度小、低流速的流动相选粘度小、低流速的流动相甲醇甲醇 流速大于流速大于0.5 cm/s时时,Hu曲线是一段斜率曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。出峰时间的重要可选择参数。4.柱温的选择：柱温的选择：选室温选室温250C左右左右 柱温提高，可减少传质阻力，但柱温提高，可减少传质阻力，但分辨率降低。分辨率降低。分离类型选择分离类型选择 choice of separation typeschoice of separation types