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1、蛋白质组第二节蛋白质组（proteome）基因：物种遗传信息的“总词典”控制发育的“总程序”生物进化历史的“总档案”蛋白质：生命活动的实际“执行者”蛋白质组（proteome）蛋白质组（proteome）：蛋白质组是澳大利亚学者Williams和Wilkins于1994年首先提出，指一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质空间时间蛋白质组学（Proteomics）：是指在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科。蛋白质组学分类表达蛋白质组学（ExpressionProteomics）研究在特定时间或环境下某个细胞或组织内所有蛋白质的表达模式，包括表达数量、种类、丰度和定位等功能
2、蛋白质组学（FunctionalProteomics）研究蛋白质的功能，并着重于蛋白质的生物学功能、蛋白质的翻译后修饰及蛋白质与蛋白质分子及与其他生物大分子的相互作用的研究蛋白质组学研究技术蛋白质组研究更为复杂和困难：蛋白质数目大大超过基因数目。蛋白质随时间和空间而变化。存在磷酸化、糖基化、巯基化等修饰。（一）蛋白质分离技术1.双向凝胶电泳（Two-dimensionalelectrophoresis，2-DE）1st：等电聚焦电泳（isoelectricfocusingelectrophoresis，IFE）2nd：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）第一向按照等电点分离，第二向按
3、照分子量分离，得到的电泳图是二维分布的蛋白质图高通量表达蛋白质组学研究的重要手段1st：等电聚焦电泳（IFE）利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的pH处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷），形成一个很窄的区带。原理-SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：分子筛效应、电荷效应、浓缩效应 十二烷基磺酸钠（SDS）：SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。蛋白质最基本的操作之一蛋白质最基本的操作之一2nd：SDS-聚丙
4、烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）SDS-PAGE 原理 SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，形成SDS蛋白质复合物，长度与其分子量成正比。SDS的强电荷可使蛋白的电荷被忽略。蛋白的迁移率取决于分子量SDS-PAGE 原理2-DE流程影响重复性和分辨率的关键考马斯亮蓝染色银染色荧光染料染色染色方法常用、简单兼容性好灵敏度低、重复性差应用广泛、灵敏度高、线性效果不好、分析不便寻找差异蛋白耐药相关蛋白质筛选2-DE的特点优点：简便、快速、高分辨率、重复性唯一分离上千蛋白质的方法缺点：低丰度蛋白 极酸或极碱蛋白 极大或极小蛋白 难溶蛋白 等电点漂移现象 繁琐 应用：临床诊断、病理研究、药
5、物筛选、新药开发等2.凝胶转印与蛋白质免疫印迹WesternBlotting（免疫印迹）：在电场的作用下将电泳分离的蛋白从凝胶转移至一种固相支持物，然后利用抗原-抗体的特异性反应，从蛋白混合物中检测出目标蛋白，从而定量或定性的确定正常或实验条件下细胞或组织中目标蛋白的表达情况。实验流程3.液相色谱（liquidchromatography，LC）液相色谱是蛋白质组学研究中常用的一种蛋白质分离方法。色谱法是依据混合物中各组分物理化学性质（如吸附力、分子形状及大小、分子的荷电性、溶解度及亲和力等）的差异，使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的流动速度或分布程度
6、不同，从而达到使各组分得以分离的方法。液相色谱（LC）原理吸附力分子形状及大小分子的荷电性溶解度亲和力二维液相色谱（Twodimensionalliquidchromatography，2D-LC）（二）蛋白质鉴定技术质谱（massspectrum，MS）法基本原理：样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定样品的分子量。质谱技术应用核酸研究：测序、SNP蛋白质组学：肽段序列、修饰多糖研究代谢组学研究ESI-MSMADLI-TOF(/TOF)MSMS-MS不同的蛋白质经专一酶解后产生特定的肽段序列，采用生物质谱对肽混合物进行质量分析，结合数据库检索对库中的已知蛋白质进行鉴定
7、。肽质量指纹谱（PeptideMassFingerprinting，PMF）（三）蛋白质芯片技术（proteinmicroarray）基本原理：对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上（如酶、抗原、抗体等），根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白（存在于血清、血浆、等），经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析。蛋白质检测、功能检测 正向蛋白质芯片：样品与正相蛋白质检测芯片表面的抗体阵列进行温育来进行多个样品的分析反向蛋白质芯片：先将不同的样品在芯片表面进行点样，然后用大量的探针检测是否有目标蛋白质蛋白质芯片的分类SELDI-TOFMS组成及工作原理SELDI-T
8、OFMS主要包括三个基本部分：蛋白芯片阵列（proteinchip）蛋白质芯片解读仪（proteinchipreader）蛋白质芯片软件控制分析系统（Software）（五）酵母双杂交系统（Yeasttwo-hybridsystem）酵母双杂交系统的建立与发展是基于对真核生物转录调控起始过程的认识。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4等都可以与上游激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS)结合并大大增加启动子的转录速度，从而在转录水平对靶基因表达进行调控。GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构
9、域（domain）构成，其中有DNA结合功能域（DNAbindingdomain,GAL4-BD）转录激活结构域（activationdomain，GAL4-AD）。酵母双杂交系统原理+-+酵母双杂交系统的应用 酵母双杂交及其衍生系统是鉴定及分析蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用的最常用、最有效的工具之一。分析已知蛋白之间的相互作用 确定未知蛋白之间的相互作用 在药物设计中的应用（六）定量蛋白质技术1.双向荧光差异凝胶电泳(Two-dimensionalfluorescencedifferencegelelectrophoresis,2D-DIGE)电泳前以两种荧光染料分别
10、标记蛋白质样品，将标记好的蛋白质样品混合，在同一块胶上进行双向电泳，电泳结果分别用2种不同的激发波长得到不同颜色的荧光信号，根据这些信号的比例来判定样品之间蛋白质的差异。由于荧光染料的使用，使得双向荧光差异凝胶电泳具有高灵敏度的特性，DIGE技术可检测到样品间小于10%的蛋白表达差异，统计学可信度达到95%以上。2.细胞培养氨基酸稳定同位素标记（StableIsotopeLabelingwithAminoacidsinCellculture,SILAC）分别采用含有同位素标记的必需氨基酸的培养基培养细胞，新合成的蛋白质即嵌合了同位素氨基酸，如此培养5-6代后，细胞的所有蛋白质均被同位素标记上。
11、经处理因素刺激后，等量混合各类型蛋白质，然后经SDS-PAGE分离和质谱分析，通过比较一级质谱图中同位素峰型的面积大小进行相对定量，同时二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。同位素亲和标记（isotopecodedaffinitytag，ICAT）ICAT技术是利用一种新的化学试剂-同位素亲和标签试剂预先选择性地标记某一类蛋白质,分离纯化后,质谱鉴定，并根据质谱图上不同ICAT试剂标记的一对肽段离子的强度比例,定量分析它的母体蛋白质在原来细胞中的相对丰度。ICAT试剂由三部分组成。试剂与蛋白质反应的基团;中间的连接子;亲和标签-生物素(Biotin）。试剂分为两种形式,分别称之为重(连接子
12、含有8个氘原子)和轻(连接子含有8个氢原子);由8个氘原子与8个氢原子分别标记的ICAT质量正好相差8Da。一组，两个样本同位素相对标记与绝对定量技术(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ）iTRAQ的4种同位素标记试剂包括：种相对分子质量分别为114、115、116和117的报告基团(reportergroup)，相对分子质量分别为31、30、29和28的质量平衡基团(balancegroup)相同的肽反应标记试剂基团(peptidereactivegroup)不同的报告基团分别与相应的平衡基团相配后，相对分子质量均为145
13、，即等量异位标签(isobarictag)。iTRAQ基本原理一组，多个样本iTRAQ技术的特点可同时对2-8个样品进行蛋白差异分析与以凝胶为基础的定量方法比较，该技术可检测膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白，可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10kDa或大于200kDa的蛋白。可标记修饰后的氨基酸，因此可对磷酸化蛋白等翻译后修饰蛋白进行定性定量研究检测思路2D-DIGE荧光染料SILAC同位素标记ICAT同位素标记iTRAQ同位素标记2-DE样本混合检测样本分别检测激光捕获显微切割技术(Lasercapturemicrodissection,LCM)在显微镜下，从组织切片中高选择性的分离、纯化单一类型的细胞群或者单个细胞的技术。LCM技术的完成需要显微镜和激光发生器。相应位置覆盖转移膜找到细胞细胞转移到膜上提取蛋白研究激光照射原位，无损，重复性好二、蛋白质组学在医学研究中的应用（一）蛋白质组学在疾病诊断中的应用疾病蛋白质组学（diseaseproteomics）寻找疾病诊断和预后的特异性蛋白质肿瘤标志物（tumormarker，TM）（二）蛋白质组学在新药研发中的应用药物治疗的靶标生物标志物（Biomarker）的筛选