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1、细胞周期调控cellcycleregulation1细胞增殖是生命的基本特征，种族的繁衍、个体的发育、机体的修复等都离不开细胞增殖。细胞增殖是通过细胞周期（cell cycle）来实现的，而细胞周期各时相细胞的结构、功能及生化特征的变化都按照一定的时序性受到不同因素的调节。在细胞周期中发生细胞增殖、分化、衰老、癌变等生物学现象。2内容介绍内容介绍 细胞周期概述细胞周期概述 细胞周期调控细胞周期调控 细胞周期与肿瘤细胞周期与肿瘤3一、细胞周期概述一、细胞周期概述 1 1细胞周期细胞周期细胞增殖周期，简称细胞周期(cellcycle)，是指连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束开始到下一次有丝分裂结束
2、为止所经历的整个序列过程。这个过程所需要的时间称为细胞周期时间。4细细胞胞周周期期5（1 1）G G1 1期期：是指从有丝分裂完成到DNA复制之前的这段间隙时间。首先，mRNA、rRNA、tRNA的合成加速，导致结构蛋白和酶蛋白的形成。其次，与DNA合成有关的一些酶如胸腺嘧啶激酶、胸腺嘧啶核苷酸激酶、脱氧胸腺嘧啶核苷酸合成酶、DNA聚合酶等活性增高，为细胞进入S期作好准备。6 （2 2）S S期期：是指从启动DNA复制开始到DNA复制完成这段时间。此期最主要的特点是DNA进行复制及组蛋白、非组蛋白等染色体组成蛋白的合成。通过DNA复制，精确地将遗传信息传递给M期分裂的子细胞，保证遗传性状的稳定
3、性。所以S期是细胞周期中最关键的阶段。7（3）G2期期：是DNA复制完成到有丝分裂开始的时期。在G2期加速合成RNA和直接与有丝分裂相关的蛋白质，如微丝、微管蛋白、有丝分裂调控的重要因子MPF(maturationpromotingfactor,M-phasepromotingfactor)，为有丝分裂做准备。8（4）M期期：该期很短，一般持续时间为0.52小时。光镜下可见细胞的形态有明显的变化。这一时期历经前期、中期、后期、末期四个阶段。前前期期染色质凝缩；分裂极确立与纺锤体开始形成；核仁解体；核膜消失。中中期期核膜破裂，染色体排列在细胞的赤道面。纺锤丝与染色体着丝点相连，牵引染色体移向赤道
4、面，通常小染色体排在中间，大染色体排在周围。9 后后期期此期是指姐妹染色单体分开并向两极移动，到两极时为止。姐妹染色单体是否分开是中期和后期的标志。末期末期从染色体到达两极后开始至两个新细胞形成为止。染色体解聚、分散成染色质；核仁出现；核膜重新形成；纺锤体解体消失。微丝组成收缩环（contractile ring）,收缩环收缩，使细胞产生缢束，然后在缢束处起沟使胞质分裂，细胞一分为二。10二、细胞周期调控二、细胞周期调控 细胞周期周而复始地进行着，这种周期性的重复过程受到严格地控制，使得不同的细胞周期事件在空间和时间上相互协调。11l 研究背景研究背景l 细胞周期的检验点细胞周期的检验点l 细
5、胞周期蛋白细胞周期蛋白l CDKCDK及其调控及其调控l 生长因子、癌基因和抑癌基因生长因子、癌基因和抑癌基因细胞周期调控细胞周期调控12（一）研究背景 1.1.MPF MPF 的发现及其作用的发现及其作用1960年，Masui和Markert研究爪蟾卵母细胞，提出了成熟卵母细胞中存在一种促成熟因子（maturation promoting factor，MPF）。Rao和Johnson(1970、1972、1974)以Hela细胞为材料，发现M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，即促细胞分裂因子(mitosis-promoting factor，MPF)。13 2.2.cdccdc基因
6、基因Leland Hartwell、Paul Nurse分别以不同的酵母为实验材料，发现了许多与细胞分裂有关的基因(cell division cycle gene，CDC)。如芽殖酵母的cdc28、裂殖酵母cdc2基因。进一步研究发现：P34P34cdc2cdc2与与P34P34cdc28cdc28是同源物，二者本身并不具有激酶活性，只有当其与有关蛋白结合后，其激酶活性才能够表现出来。例如：P34cdc2必须与另一种蛋白P56cdc13结合后才具有激酶活性。14 3.3.cyclincyclin 1983年Timothy Hunt首次发现海胆卵受精后，在其卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期
7、剧烈振荡，在每一轮间期开始合成，G2/M时达到高峰，M结束后突然消失，在下一个周期中又重复这一消长现象，故命名为周期素或周期蛋白(cyclin)。随后cyclin很快被分离和克隆出来，证明其广泛存在于从酵母到人类等各种真核生物中，而且在功能上存在互补性。15 4.4.MPF P34cdc2Cyclin？1988年M.J.Lohka 纯化了爪蟾的MPF，经鉴定由34KD和45KD两种蛋白组成，二者结合可使多种蛋白质磷酸化。1990 Paul Nurse进一步的实验证明P34实际上是P34cdc2的同源物，P45是cyclinB的同源物，而且，对于P34cdc2的活性而言，cyclin是必需的。从
8、而将细胞周期三个领域的研究联系在一起。MPF=P34cdc2(CDK1)+Cyclin B（催化亚单位）（催化亚单位）（调节亚单位）（调节亚单位）16The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2001for their discoveries of key regulators of the cell cycleLeland Hartwell Timothy Hunt Paul Nurse 17（二）细胞周期的检验点1989年，Hartwell通过构建酵母细胞突变模型证实了细胞周期检验点（check point）的存在，并首次提出检验点的概念。细胞周期
9、的运行，是在一系列检验点的严格检控下进行的，它保证前一个事件完成之后，才启动下一个事件，检查点是细胞的错误监测机制。18主要检验点包括：主要检验点包括：G1/S检验点检验点：在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restriction point)，控制细胞由静止状态的G1进入DNA合成期，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？S期检验点期检验点：DNA复制是否完成？19G2/M检验点：检验点：是决定细胞一分为二的控制点，相关的事件包括：所有DNA都正确复制了吗？DNA是否有损伤？细胞体积是否足够大？中中-后期检验点（纺锤体组装检验点）：后期检验点（纺锤
10、体组装检验点）：所有染色体都排列在纺锤体上了吗？任何一个着丝点没有正确连接到纺锤体上，引起细胞周期中断。20（三）细胞周期蛋白cyclin的种类繁多，目前从芽殖酵母、裂殖酵母和各类动物中分离出的周期蛋白有30余种，在脊椎动物中为A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。分别参与细胞周期中不同时相的调节。分为G1型、G1/S型S型和M型4类。21人类细胞周期蛋白线性结构示意图实心方框代表“cyclinbox”，方框代表“destructionbox”圆形框代表PEST序列22cyclin box：各类周期蛋白均含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白盒(cyclinbox
11、)，介导周期蛋白与CDK(cyclindependentkinase)结合。Cyclin也含有降解盒（destruction box）或PEST（脯氨酸谷氨酸丝氨酸苏氨酸）序列，它可以通过定时降解或恒定地迅速周转来调节这些蛋白质的水平，起着CDK的调节亚基的作用。23G G1 1期期细胞在生长因子的刺激下，G1期cyclin D表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸化，磷酸化的Rb释放出转录因子E2F，促进许多基因的转录。24Cyclin D与CDK结合使Rb释放结合的转录因子E2F 25G1/S期期 cyclinE与CDK2结合，促进细胞通过G1/S限制点而进入S期。向细
12、胞内注射CyclinE的抗体能使细胞停滞于G1期，说明细胞进入S期需要CyclinE的参与。S期期 将CyclinA的抗体注射到细胞内，发现能抑制细胞的DNA合成，推测CyclinA是DNA复制所必需的。26G2/M期期 cyclinA、cyclinB与CDK1结合，CDK1使底物蛋白磷酸化,如将组蛋白H1磷酸化导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜解体等下游细胞周期事件。27 M期期 在分裂中期当MPF活性达到最高时，通过一种未知的途径，激活后期促进因子APC(anaphase promoting complex)，负责将泛素连接在cyclinB上，导致cyclinB被蛋白酶体（protea
13、some）降解，完成一个细胞周期。28哺乳动物细胞周期中各时相不同cyclin的作用 29（四）四）CDKCDK及其调控及其调控CDK即细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclindependentkinase,CDK)，控制着细胞周期各期之间的顺序转换。CDK是一组相关联的Ser/Thr蛋白激酶，酵母中细胞周期的进程主要由单一的CDK（P34cdc2/cdc28）所控制。多细胞生物中，细胞周期各期之间的转换需要不同的CDK。30脊椎动物的CDK CDK结合的相应cyclin 作用的细胞周期 CDK1CDK2CDK3CDK4CDK5CDK6CDK7 CyclinA,BCyclinACyclinD1,D
14、2,D3CyclinECyclinD1,D2,D3P35*,CyclinD1,D2,D3CyclinD1CyclinH,P36*G2/M转换；M早期S期G1期G1/S转换G1期G0/G1转换、G1期神经纤维的磷酸化、G1期G0/G1转换活化CDK*P35，P36的结构与细胞周期蛋白无相似性31 1 1 CyclinCyclin的结合是的结合是CDKCDK激活的第一步激活的第一步CDK活性的最初调节者是cyclin亚单位。Cyclin与相应的CDK结合后，引起CDK空间构象改变，暴露其催化亚基。各种细胞周期蛋白程序化的合成和降解保证各对应CDK适时的活化，维持细胞周期的正确时序。32 2 2CD
15、KCDK的磷酸化与去磷酸化的磷酸化与去磷酸化以P34cdc2(CDK1)为例，如果对P34cdc2磷酸化作用位点不同，则对该酶的活性分别产生正向和负向的控制。完整的P34cdc2-cyclin复合物需要磷酸化才能被激活，驱动细胞进入有丝分裂。33P34cdc2的Thr14和Tyr15的磷酸化引起P34cdc2-cyclin复合物的失活，Weel是催化Tyr15磷酸化的激酶，另有一个是Thr14磷酸化的激酶；催化Thr14及Tyr15脱磷酸化的蛋白磷酸酶为双特异性磷酸酶Cdc25蛋白。34P34cdc2的Thr161的磷酸化是酶的活性所必需的。CDKs活化激酶CAK（CDKsactiviting
16、kinase）应答Thr161的磷酸化，这是另一种蛋白激酶CDK7-CyclinH复合物。当磷酸酶-1将此位点的磷酸水解，P34cdc2又失去激酶活性。35 3 3CDKCDK抑制剂的作用抑制剂的作用除了磷酸化去磷酸化可以调节MPF活性外，另有一类CDK抑制因子（CDC kinase inhibitor,CKI）可与CDK结合抑制其活性。36（1）Ink4(Inhibitor of cdk 4)：如P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，专一地与CDK4、CDK6结合，阻止CDK和cyclinD的结合。使细胞周期不能从G1期的调控点进入到下一个时相。37（2）C
17、ip/Kip：包括P21cip1(cyclin inhibition protein 1)、P27kip1(kinase inhibition protein 1)、P57kip2等，能与多种cyclin-CDK复合物包括cyclinECDK2、cyclinDCDK6、cyclinDCDK4结合，抑制cyclin-CDK复合物的蛋白激酶活性，使一些细胞增殖所需要的蛋白质磷酸化受阻，细胞停留在G1期。38此外P21cip1还可与DNA聚合酶亚单位PCNA(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)相互作用，抑制DNA复制，但不影响DNA修复。39CDK1的激活需要
18、Thr14和Tyr15去磷酸化和Tyr161的磷酸化 40（五）生长因子、癌基因和抑癌基因（五）生长因子、癌基因和抑癌基因1生长因子生长因子 生长因子是促细胞周期运行的重要因子。RTK-Ras-MAPK信号传递途径是细胞外的信号传递到细胞核内最基本的途径。41 2 2癌基因癌基因 原癌基因被激活，其编码蛋白大量表达，这些蛋白对细胞周期具有促进作用。42 癌基因 癌蛋白种类来源存在功能类型1：生长因子sis逆转录病毒分泌生长因子（PDGF)类型2：生长因子受体erbB逆转录病毒膜表皮生长因子（EGF)受体fms逆转录病毒膜集落刺激因子1（CSF-1)受体trk肿瘤膜神经生长因子（NGF)受体类型
19、3：细胞内信号蛋白Src逆转录病毒细胞质酪氨酸激酶Raf逆转录病毒细胞质丝氨酸激酶Ras逆转录病毒、肿瘤细胞质GTP/GDP结合蛋白类型4：核转录因子Jun、Fos逆转录病毒核转录因子（AP-1)Myc逆转录病毒、肿瘤核DNA结合蛋白erbA逆转录病毒核类固醇受体家族成员癌基因的主要类型及其表达产物癌基因的主要类型及其表达产物43 3 3抑癌基因抑癌基因抑癌基因可抑制细胞周期于静止期，并使DNA复制不完全或损伤的细胞不能进入分裂期，避免细胞的癌变。44（1）P53一般情况下，细胞中很少有P53蛋白。DNA损伤会引起P53蛋白浓度和活性的提高。P53蛋白可同P21基因调节区结合，激活P21基因转
20、录。使细胞停滞在G1期的调控点处不能进入S期。这样，即可有足够的时间修复DNA。4546P53蛋白可促进GADD45基因（growth arrest and DNA damage inducible gene）表达生成GADD45蛋白，后者与CDK及PCNA形成的复合物，参与DNA损伤的修复。当DNA损伤不能修复时，p53基因的过量表达导致P34cdc2的过早激活，结果导致核膜破裂，引起细胞凋亡。47（2）RbRb基因位于人染色体13q14，由27个外显子构成，分布在总长180200kb以上的DNA片段上。Rb基因转录的mRNA大小为4.7 kb，编码一个分子量为105 kD的蛋白质，由928
21、个氨基酸残基构成，定位于细胞核内，是多种cyclinCDK的底物，具有多个被磷酸化的位点。48Rb有高、低磷酸化两种状态。低磷酸化的Rb蛋白可与一些转录因子如E2F结合，抑制这些转录因子的活性，阻止细胞的生长。而高磷酸化状态则失去这种功能，使E2F游离，进入核内，发挥转录活性，促进细胞周期进行。49Rb在细胞周期内的磷酸化 50三、三、细胞周期与肿瘤细胞周期与肿瘤肿瘤细胞最显著的特点是生长失控和幼稚化（即不分化）。51（一）肿瘤细胞分类（一）肿瘤细胞分类 增殖的细胞群：增殖的细胞群：是肿瘤中处于连续增殖的细胞，与肿瘤生长直接相关，该群细胞对药物高度敏感，是化疗药物最易攻击的细胞群。52 暂暂不
22、不增增殖殖的的细细胞胞群群：该群细胞处于G0期或延长了的G1期，肿瘤细胞在G0期时，生化代谢不活跃，对药物不敏感，致使化疗不易取得成功。但在一定条件下细胞可进入增殖状态，是肿瘤治疗后复发的根源。不不增增殖殖的的细细胞胞群群：该类细胞完全丧失了增殖能力，不再进入细胞周期，最终通过分化、衰老直至死亡。53（二）肿瘤细胞周期失控的分子基础（二）肿瘤细胞周期失控的分子基础 1 1细胞周期蛋白异常细胞周期蛋白异常 G1cyclin基因突变、重排，使这些cyclin异常表达，从而使细胞通过G1期，进入S期，细胞即自发增殖，出现转化特征。许多人类肿瘤中，均发现有cyclin D1基因的扩增。54B型肝炎病毒
23、（hepatitisBvirus,HVB）感染人体后成为导致肝癌的因素之一，有研究发现，HVB基因组整合入cyclinA基因的一个内含子中，产生异常、过量表达的转录物。和正常的cyclinA相比，它缺少N端的“destructionbox”，逃脱了对它的降解，大量异常的cyclinA刺激细胞增殖。55 2 2CDKCDK和和CKICKI基因的突变基因的突变研究中发现肿瘤细胞CDK的水平一般较高，而CKI基因常见纯合性缺失突变，细胞内缺少CKI，或CKI抑制CDK功能的丧失。56 3 3抑癌基因突变抑癌基因突变不少癌细胞中发现Rb或P53基因发生了突变，使Rb失去了阻断mRNA转录，P53失去了
24、使细胞休止在G1后期的功能，造成细胞周期失控。57（三）细胞周期与肿瘤的基因治疗（三）细胞周期与肿瘤的基因治疗 1.抑制G1期cyclins的过度表达G1期cyclins反义核酸，在体外和裸鼠体内都可抑制肺癌的增殖。反义DNA可以与基因结合而阻止基因的转录，反义的RNA可与mRNA结合，而抑制其翻译，都可以达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是将双链RNA导入细胞内引起特异基因的mRNA降解的一种细胞反应过程。属于转录后基因沉默的一种。58 2.2.促使肿瘤细胞表达正常的促使肿瘤细胞表达正常的CKIsCKIs有报道用正常的P16、P21、P27基
25、因与腺病毒载体重组，将重组的腺病毒导入肿瘤细胞，重组的腺病毒在肿瘤细胞内表达有功能的P16、P21和P27蛋白，抑制CDKs的活性，使肿瘤细胞停止在G0G1，抑制肿瘤细胞增殖。593.抑制抑制E2F的活性的活性把对E2F有高度亲和性的双链DNA片段导入细胞，该DNA能够结合游离状态的E2F生成一种复合物，复合物中的E2F不再与有关基因的启动子结合，从而阻断这些基因的表达，抑制细胞增生。60思考题名词：名词：cyclin box、R点(restriction point)问答：问答：1.简述细胞周期各时相简述细胞周期各时相cyclin的种类及作用。的种类及作用。2.简述细胞周期的主要检验点（简述
26、细胞周期的主要检验点（check point）及功能。及功能。61非洲爪蟾卵细胞发育过程分为六个阶段、和期。前四个时期为卵母细胞生成和生长阶段。其中 第期时细胞核较大，称为生发泡(germinal vesicle,GV)，此时细胞就停留在该时期，等待成熟。62实验表明：成熟卵细胞的细胞质中必然有一种物质，可实验表明：成熟卵细胞的细胞质中必然有一种物质，可以诱导卵母细胞成熟，称之为促成熟因子以诱导卵母细胞成熟，称之为促成熟因子（maturation promoting factor，MPF）。63G1期PCC为单线状，因DNA未复制。S期PCC为粉末状，因DNA由多个部位开始复制。G2期PCC为
27、双线染色体，说明DNA复制已完成。与M期细胞融合的间期细胞产生了形态各异的早熟凝集染色体(prematurely condensed chromosome，PCC)，这种现象叫做早熟染色体凝集(premature chromosome condensation)64人M期细胞与袋鼠（Ptk）G1、S、G2期细胞融合诱导PCC不仅同类M期细胞可以诱导PCC，不同类的M期细胞也可以诱导PCC产生。65芽殖酵母及其细胞周期芽殖酵母及其细胞周期 L.Hartwell在芽殖酵母中发现cdc28基因的表达产物是一种相对分子量为34KD的蛋白，被称为P34cdc28，它是一种蛋白激酶，在G2/M转换过程中起中心调节作用。66裂殖酵母及其细胞周期裂殖酵母及其细胞周期 P.Nurse在裂殖酵母中发现cdc2基因的表达产物也是一种相对分子量为34KD的蛋白，被称为P34cdc2,进一步研究发现，P34cdc2具有激酶活性，可使多种蛋白底物磷酸化，在裂殖酵母周期调控中起关键性调节作用。67686970717273747576