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1、放射性配体与受体结合分析实验方法内容l实验定义与原理l实验材料与仪器l实验方法lScatchard方程与作图(饱与与竞争实验)lRBA得安全问题l实验举例实验定义与原理l定义l放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析(radioassay of receptors),它就是应用放射性核素标记配基与特异受体相结合,研究受体得亲与力与受体得数量,以及研究受体亚型得常用方法。l原理 l放射性标记配基(激动剂或拮抗剂)与组织、细胞,或含有受体得制剂一起温育,使受体与配基充分结合,形成受体-配基复合物,终止反应后,用过滤或离心得方法除去未被结合得标记物,测定滤膜或沉淀物中得放射性,即可计算出与配基结合
2、得受体得量。RBARBA得分类得分类 RBA RBA用放射性核素来标记配基用放射性核素来标记配基,与相应得受体与相应得受体进行特异性结合反应进行特异性结合反应,可对受体得性质进行定性与可对受体得性质进行定性与定量得分析。定量得分析。l 1 1、定性、定性RBARBA:就是通过反应得量效关系得变化就是通过反应得量效关系得变化来判断受体得类型来判断受体得类型,单位点或多位点结合式单位点或多位点结合式,及受及受体与配体结合得特点体与配体结合得特点,反应得可逆性、协作性等。反应得可逆性、协作性等。l 2 2、定量、定量RBARBA:就是在已知配体与受体反应性质就是在已知配体与受体反应性质得基础上得基础
3、上,通过结合反应通过结合反应,给出一定量得组织或细给出一定量得组织或细胞中能与该放射性配体结合得受体数及结合得平胞中能与该放射性配体结合得受体数及结合得平衡解离常数或结合位点数衡解离常数或结合位点数(最大结合容量最大结合容量)。实验材料与仪器实验材料与仪器实验材料l动物组织(皮层、海马、纹状体等)l仪器(组织匀浆机、旋涡混合器、低温高速离心机、电热恒温水温箱、-80冰箱、制冰机、抽虑瓶、液闪仪等)l材料(2ml/6ml分离管、10ul/200ul/1ml枪头、微纤维滤纸等)l药品(放射性配基、各种非标计化合物等)实验仪器l组织匀浆机lIKA,T10B S25 l漩涡混合器lWH-2l低温高速离
4、心机l凯达,TGL20Ml超低温冰箱l海尔l数显恒温水浴锅l金燕,HH-S26Sl制冰机lGELINl型号IMS-50 automatic ice flakes电热恒温水温箱l循环水式多用真空泵l液闪测定计数仪lHIDEX,425-034型大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点实验材料l2ml离心管l6ml一次性软试管枪头1ml10ul200ullTrislPPO与POPOP过滤装置l砂芯过滤装置(抽滤瓶)l1000mllWhatman GF/C玻璃微纤维滤纸 l40mm放
5、射性化合物l放射性配体l低温保存实验方法流程实验方法流程实验方法流程实验方法流程1 1、制备受体样品、制备受体样品;2 2、加样、温育进行结合反应、加样、温育进行结合反应;3 3、终止反应、终止反应,分离结合物与游离物分离结合物与游离物4 4、测定结合物得放射性、测定结合物得放射性;5 5、数据处理。、数据处理。实验具体操作(D1、D2、5-HT)l1、配制各种缓冲液及试剂 l按处方配比配制各种缓冲液贮备液l配制各种非标记配体溶液l配制各种受试药物溶液l注意注意:该项操作所需试剂或仪器该项操作所需试剂或仪器l仪器仪器:分析天平、移液枪、烧杯、量筒、容量瓶、试管、EP管等l试剂试剂:无水乙醇、超
6、纯水、Tris、抗血酸、优降宁、HCl、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、DMSO、甲苯、PPO、POPOP、Methysergide、Butaclamol及5HT 等 2、制备膜受体 l大鼠断头取脑 l分离出目标组织 l加10倍体积(V/W)冰冷得缓冲液 l用组织匀浆机匀浆3次,每次数秒钟,制成组织匀浆液 l组织匀浆液用低温高超离心机离心(12000转/分)3次,每次20分钟l弃上清液,沉淀(膜受体)放-80度超低温冰箱保存备用 l注意注意:该项操作所需试剂或仪器该项操作所需试剂或仪器l仪器仪器:手术器械、组织匀浆机、制冰机、超低温冰箱、低温高超离心机 l试剂试剂:超纯水3、加样加样
7、l取出膜受体,加入一定体积得冰冷得缓冲液,混匀,使成一定浓度得膜受体溶液。l取放射性配体母液取放射性配体母液,用无水乙醇稀释成实验所需浓度用无水乙醇稀释成实验所需浓度 l按以下顺序及比例加入各种反应液。l(1)总结合管:100ul膜受体+200ul缓冲液+10 ul 放射性配体l(2)非特异管:100ul膜受体+100ul缓冲液+100ul非标记配体+10 ul 放射性配体l(3)受试物管:100ul膜受体+100ul缓冲液+100ul药物溶液+10 ul 放射性配体l注意注意:该项操作所需试剂或仪器该项操作所需试剂或仪器l仪器仪器:移液枪、烧杯、量筒、EP管等l试剂试剂:超纯水、无水乙醇、放
8、射性配体母液放射性配体母液 4、受体配体结合反应受体配体结合反应l以上各管在加完放射性配体后,立即放入37度得水浴锅中,孵育20分钟。20分钟后把各管放入冰中终止反应。l注意注意:该项操作所需试剂或仪器该项操作所需试剂或仪器l仪器仪器:恒温水浴锅,制冰机 l试剂试剂:无 5、分离游离及结合得放射性配体、分离游离及结合得放射性配体l上述各管在反应结束后,分别倒入抽滤装置进行过滤,并用5-10ml冰冷得缓冲液冲洗滤膜2次。滤膜放入85度烘箱中烘干,随后放入测试管中,关加入一定体积得闪烁液,浸泡过夜。l注意注意:该项操作所需试剂或仪器该项操作所需试剂或仪器l仪器仪器:抽滤器、烘箱、滤纸、移液枪、液闪
9、杯l试剂试剂:甲苯、PPO、POPOP6、测定结合型放射配体每分钟放射计数测定结合型放射配体每分钟放射计数l采用放射性计数仪,测定各测试管中结合型放射配体每分钟放射计数l注意注意:该项操作所需试剂或仪器该项操作所需试剂或仪器l仪器仪器:液闪仪l试剂试剂:无7、数据处理l按以下公式计算各化合物对同位素配基结合得抑制率百分率:l抑制率(I%)=(总结合管cpm化合物cpm)/(总结合管cpm非特异结合管cpm)100%l化合物每次实验做两复管,进行两次单独实验。8、各种指标lIC50:半数抑制浓度lKD:平衡解离常数(mol/L),物理意义为受体有一半结合配基时所需要得配基浓度。lBmax:受体最
10、大结合容量(fmol/mg蛋白质)lnH:Hill系数Scatchard方程与作图(饱与实验)Scatchard方程与作图l简单单位点系统受体与配体结合反应简单单位点系统受体与配体结合反应(Clark模型模型)条条件件:l(1)配基与受体结合反应为可逆双分子反应配基与受体结合反应为可逆双分子反应;l(2)所有受体都就是等效与独立得所有受体都就是等效与独立得,同一受体得不同同一受体得不同分子对配基得亲与力都相等分子对配基得亲与力都相等,而且不受邻近受体分子而且不受邻近受体分子结合配基与否得影响结合配基与否得影响;l(3)配体本身不代谢配体本身不代谢,也不与其它位置结合也不与其它位置结合;l(4)
11、生物效应得强度与浓度近似于总配基浓度。生物效应得强度与浓度近似于总配基浓度。饱与曲线l固定得受体数量固定得受体数量,固定数量得非标与不同浓固定数量得非标与不同浓度体积得放射性配体度体积得放射性配体 饱与曲线饱与曲线(saturation curve)1)饱与曲线饱与曲线 受体数量一定受体数量一定,当配体当配体(一般就是不同浓度体积得放射一般就是不同浓度体积得放射性配体与固定数量得非标性配体与固定数量得非标)得浓度从零开始上升时得浓度从零开始上升时,形成得形成得复合物也逐渐增多。但由于受体数量有限复合物也逐渐增多。但由于受体数量有限,又就是可逆反又就是可逆反应应,因此因此RL(受体配体复合物受体
12、配体复合物)得增加不就是直线上升得增加不就是直线上升,而而就是一条上升先快后慢得曲线就是一条上升先快后慢得曲线,最后绝大部分受体与配体最后绝大部分受体与配体结合时结合时,RL得增加就非常缓慢得增加就非常缓慢,渐趋水平渐趋水平,即受体已经饱即受体已经饱与了与了,此即饱与曲线此即饱与曲线。#饱与曲线得作用？饱与曲线得作用？Scatchard作图作图,求得求得KD与与Bmax 2 2)曲线得高度取决于曲线得高度取决于RTRT。在曲线起始段。在曲线起始段,曲线上升得快曲线上升得快慢即曲线得斜率取决于配基与受体得亲与力慢即曲线得斜率取决于配基与受体得亲与力,所以所以,KDKD越小越小 (亲与力越大亲与力
13、越大),饱与曲线上升越快饱与曲线上升越快,KDKD越大越大 (亲与力越小亲与力越小),饱与曲线上升越慢。饱与曲线上升越慢。(即:亲与力越大,受体与配件结合速度越快,时间越短)k1,v1k1,v1 R+L R+L RL RL k2,v2 k2,v2 KDK2/K1=RL/RL 饱与曲线得形状与饱与曲线得形状与KD有关有关(如图如图1)。图图1 KD对饱与曲线得影响对饱与曲线得影响 饱与曲线曲线得高度取决于饱与曲线曲线得高度取决于RT(如图如图2)。图图2 RT对饱与曲线影响对饱与曲线影响 质量作用定律质量作用定律 (Mass action law)(Mass action law):受体与配基得
14、结合反应服从可逆反应得质受体与配基得结合反应服从可逆反应得质量作用定律量作用定律,可用下式表示可用下式表示:k1,v1 k1,v1 R+L R+L RL RL (1 1)k2,v2k2,v2 上式中上式中,RR与与L L 为游离受体与游离配基得浓度为游离受体与游离配基得浓度,RLRL为复合物浓为复合物浓度度,v1v1与与v2v2为结合速率与解离速率为结合速率与解离速率,k1k1与与k2k2为结合速率常数为结合速率常数 (association(association rate constant)rate constant)与解离速率常数与解离速率常数 (dissociation rate co
15、nstant)(dissociation rate constant)。数学表达数学表达l根据质量作用定律:v1=k1 R L;v2=k2 RLl当反应达到平衡后,v1 =v2,即:k1 RL=k2 RL,则l平衡解离常数(KD)得数学表达式为:KDK2/K1=RL/RL (2)Scatchard作图作图l设LT为配体得初始浓度,RT为受体得初始浓度(即受体总量),则有:L=LT RL R=RT RLl由式由式(2)整理可得整理可得:KD RT-RLL RL l将上式整理可得将上式整理可得:RL=RT 1_ RL (Scatchard 方程方程)L KD KD 变形:RL为受体与配基特异结合得
16、量,换成B表示,L为自由配基得量,换成F表示,RT为受体总量,也即受体最大结合量,换成Bmax表示,则上式方程变为 B/F=Bmax/KD-B/KD(RT 为受体总量为受体总量,等于等于R与与RL之与之与,也就是最大结合量也就是最大结合量Bmax)以复合物浓度以复合物浓度RL为横坐标为横坐标,以复合物浓度与游离配体得浓度比值以复合物浓度与游离配体得浓度比值RL/L为纵坐为纵坐标作图标作图,即为即为Scatchard作图。作图。图图3 简单单位点系统简单单位点系统RBA得得Scatchard作图作图简单单位点系统简单单位点系统Scatchard作图为一条直线作图为一条直线,斜率为斜率为-(1/K
17、D),横轴截距为横轴截距为RT,纵轴截距为纵轴截距为RT/KD(见图见图3)。由此求得KD与BmaxHill方程与作图l当一个受体分子可以结合一个以上得配基时,配基受体结合反应不就是简单得双分子反应,而就是 k1,v1k1,v1 R+nL R+nL nRL nRL,根据质量作用定律推导出根据质量作用定律推导出HillHill方程方程:k2,v2k2,v2经过变形得其中n为hill系数,以结合分数B/Bmax对游离配基L作图,得Hill作图(如右)。(3)l将(3)式两边取对数 非特异性结合非特异性结合(non-specific binding,NSB)NSB 在在RBA系统中系统中,放射性配体
18、除与受体特异性结合外放射性配体除与受体特异性结合外,还可与其还可与其她成分她成分(如非特异蛋白、反应容器、分离材料等如非特异蛋白、反应容器、分离材料等)结合。结合。NSB得特点得特点 亲与力小而结合容量大亲与力小而结合容量大,不易被饱与不易被饱与,随反应系统内配体随反应系统内配体浓度增加而线性增大浓度增加而线性增大,而且这种结合与生物效应无关而且这种结合与生物效应无关(见图见图4)。图图4 饱与曲线实验中饱与曲线实验中TB、SB与与NSB得关系得关系在在RBA得数据处理时得数据处理时,测得得总结合得放射性测得得总结合得放射性(total binding,TB),必须减去必须减去NSB,才能得到
19、特异性结合才能得到特异性结合(specific binding,SB)得数据。得数据。竞争曲线l固定得放射性配基浓度,一定量得受体与不同浓度得未标记化合物数学表达l此实验用于测定非标计药物与放射性配基竞争结合同一受体得能力。通常用IC50与Ki来表示。闪烁液l包括溶剂、闪烁剂与添加剂l溶剂:溶解闪烁剂与放射性样品,吸收与传递射线能量。l闪烁剂:第一闪烁剂(吸收受激溶剂能量,退激发光)、第二闪烁剂(波长转移,匹配光电倍增管光谱;提高淬灭耐受)l添加剂:助溶剂、抗淬灭剂各受体得非标与同位素受体非标放射性配基受体组织5-HT1A 5-HT(serotonin)3H-8-OH-DPAT大鼠纹状体/皮层
20、5-HT2AMethysergide3H-Ketanserin大鼠纹状体/皮层D2Butaclamol3H-Spiperone大鼠纹状体1Prazosin3H-prazosin大鼠皮层2Rauwolscine3H-Rauwolscine大鼠皮层M阿托品3H-QNB(毕兹)大鼠脑去小脑/回肠心得舒3H-DHA鸭红细胞/大鼠脑RBA得安全问题得安全问题射线射线放射型物质发出得射线有三种放射型物质发出得射线有三种:天然放射现象三种射线三种射线l射线射线l射线射线 l射线射线 射线射线l根根据据射射线线得得偏偏转转方方向向与与磁磁场场方方向向得得关关系系可可以以确确定定,偏偏转转较较小小得得一一束束由
21、由带带正正电电荷荷得得粒粒子子组组成成,我我们们把把它它叫叫做做射射线线,射射线线由由带带正正电电得得粒粒子子组组成成、科科学学家家们们研研究究发发现现每每个个粒粒子子带带得得正正电电荷荷就就是是电电子子电电荷荷得得2倍倍,粒粒子子质质量量大大约约等等于于氦氦原原子子得得质质量量、进一步研究表明进一步研究表明粒子就就是氦原子核粒子就就是氦原子核、l由由于于粒粒子子得得质质量量较较大大,所所以以射射线线得得穿穿透透本本领最小领最小,我们用一张厚纸就能把它挡住我们用一张厚纸就能把它挡住、射线射线l与与射射线线偏偏转转方方向向相相反反得得那那束束射射线线带带负负电电荷荷,我我们们把把它它叫叫做做射射
22、线线、研研究究发发现现射射线线由由带带负负电电得得粒粒子子(粒粒子子)组组成成、进进一一步步研研究表明究表明粒子就就是电子粒子就就是电子、l射线得穿透本领较强射线得穿透本领较强,很容易穿透黑很容易穿透黑纸纸,还能穿透几厘米厚得铝板还能穿透几厘米厚得铝板、射线射线l 中中间间不不发发生生偏偏转转得得那那束束射射线线叫叫做做射射线线,研研究究表表明明,射射线线得得实实质质就就是是一一种种波波长长极极短短得电磁波得电磁波,它不带电它不带电,就是中性得就是中性得、l射线得穿透本领极强射线得穿透本领极强,一般薄金属板一般薄金属板都挡不住它都挡不住它,它能穿透几十厘米厚得水泥墙它能穿透几十厘米厚得水泥墙与
23、几厘米厚得铅板与几厘米厚得铅板、射线l在某种核反应中,一个中子变成一个电子与一个质子、这就就是原子核内没有电子,又会放出电子,这就就是产生射线得原因、l射线就是一种带负电荷得、高速运行、从核素放射性衰变中释放出得粒子。人类受到来源于人造或自然界(氚,C14等)射线得照射,射线比射线更具有穿透力,但在穿过同样距离,其引起得损伤更小。一些射线能穿透皮肤,引起放射性伤害。但就是它一旦进入体内引起得危害更大。粒子能被体外衣服消减、阻挡或一张几毫米厚得铝箔完全阻挡。放射防护措施外照防护措施l时间防护:尽量减少受照射时间。l距离防护:距离越远,辐射能量越低。l屏蔽防护:射线注意防止内照射;射线可用铝、有机
24、玻璃、塑料等原子序数较低得物质;射线可用铅、铁、混凝土等高原子序数物质。内照射防护措施l围封隔离防扩散:“三区配置”法,即清洁区、中间区、活性区;通风良好、独立得下水处理系统;遵守SOP。l除污保洁防污染l个人防护侵入:穿戴适当得个人保护衣具,如工作服、口罩、鞋、帽等。不准在工作场所进食、吸烟。工作结束后进行卫生清洗,并作污染检测。放射性“三废”处理l基本方法:放置衰变、浓缩储存、稀释排放l固体:一般用放置法(半衰期短)、焚化法(废气得处理)、埋藏法(不可燃/焚化残渣)l液体:一般用放置法(半衰期短)、稀释法(量少浓度低)、浓集法(富集掩埋)l气体:大气排放(低浓度/气溶胶)、过滤器或液体吸收
25、(高浓度)表面放射性污染得处理l皮肤:轻度,大量清水与肥皂清洗;严重,10%EDTA或6、5%高锰酸钾浸泡清洗l工作场所表面:轻度,大量清水或洗涤剂清洗;严重,挖去再填充或覆盖油漆/塑料板l工作服:轻度,肥皂水;严重,0、02mol/L盐酸、1%草酸洗涤或废物处理l仪器及设备:玻璃与陶瓷,3%盐酸/10%枸橼酸浸泡1h后冲洗再用洗液浸泡15min后再清洗;金属,用肥皂、枸橼酸钠、EDTA或其它有机溶剂或超声清洗例子:M胆碱受体配体结合实验试剂l放射配体:3H-QNB(比活度:22ci/mmol)l非标:阿托品l0、32mol/L蔗糖溶液l0、05mol/L TrisHCl缓冲液pH7、5。l生
26、理盐水l甲苯闪烁液 PPO2,5-Diphenyloxazole【2,5-二甲基恶唑】2、5g加POPOP1,4-Bis(5-phenyloxazol-2-yl)benzene【1,4-双(5-苯基恶唑基-2)苯】0、05g,溶于500ml甲苯中。受体组织得制备l中枢:大鼠断头取脑,去小脑;20倍0、32mol/L蔗糖制成匀浆;离心,上清液Tris缓冲液悬浮;Lowry法测蛋白。l外周肠平滑肌:豚鼠取回肠,生理盐水或Tris缓冲液清洗/保存。受体配体结合l一、饱与曲线:每个反应管中加入200ul固定浓度得膜蛋白(0、2mg/ml)与50ul不同浓度得3HQNB(0、1、0、25、0、5、1、0
27、1、2、15、3、0、4、26、5、48nmol/L),在非特异结合管中另加入终浓度为10-6mol/L得阿托品,补充Tris缓冲液至总体积1ml,其中之一得操作如下孵育与测量l水温37孵育30min,5ml冰冷得Tris缓冲液终止反应;抽虑冲洗游离得3HQNB。l滤片80、30min烘干后置于甲苯闪烁液中,液闪仪测量放射量。下图为测量结果之一计算:1、特异性结合=BS=BT-BNS2、特异结合特异结合(B)fmol/mg蛋白蛋白:特异结合(B)fmol/mg蛋白得物理意义:1mg蛋白特异结合得放射性配体得物质得量。(1)求放射性配体得物质得量。其核心就就是将SB得DPM转化为化学量物质得量,
28、3HQNB得比活度为22ci/mmol,并且不随稀释而改变,且上述SB为384dpm。分两步:第一步:将DPM值转化为放射性强度1mci=2、22109dpm,则1dpm=1/2、2210-9mci,而384dpm=384/2、2210-9mci第二步:将放射性强度转化为物质得量3HQNB得比活度为22ci/mmol,则384dpm=(384/2、2210-9mci)/(22ci/mmol)=7、8610-12mmol=7、8610-15mmol=7、86fmol(2)膜蛋白得质量。200ul1mg/ml=0、2mg故:特异结合(B)fmol/mg为7、86fmol/0、2mg=39、3fmo
29、l/mg39 fmol/mg特异结合量特异结合量B/游离量游离量Ffmol/mg蛋白蛋白nmol/L:(1)特异结合量B已得:39 fmol/mg(2)游离量F,即为结合实验时游离得放射性配体 因为点膜得出,总得放射量为4884dpm,而特异性结合量为384dpm,则游离量为:4884-384=4500(dpm)同上可得,4500dpm=92、1nmol,因为反应液体积为1ml,故浓度为0、0921nmol/l0、1nmol/l故:特异结合量B/游离量Ffmo l/mg蛋白nmol/L为(39fmol/mg)/(0、1nmol/L)=390 fmol/mg蛋白nmol/L作图求值(按Scatchard方程式B/F=-B/KD+Bmax/KD,以B为横坐标,相应得B/F为纵坐标,直线回归求斜率-1/KD)与截距(Bmax/KD)Hill作图lHill作图基本同简单得双分子作图,根据公式