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1、放射性配体与受体结合分析实验（RBA）方法刘星华2011-5-13药理室讲座药理室讲座第一页，编辑于星期五：九点 一分。内容l实验定义与原理l实验材料与仪器l实验方法lScatchard方程与作图（饱和与竞争实验）lRBA的安全问题l实验举例第二页，编辑于星期五：九点 一分。实验定义与原理l定义l放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析（radioassay of receptors），它是应用放射性核素标记配基与特异受体相结合，研究受体的亲和力和受体的数量，以及研究受体亚型的常用方法。l原理 l放射性标记配基（激动剂或拮抗剂）和组织、细胞，或含有受体的制剂一起温育，使受体和配基充分结合，形
2、成受体-配基复合物，终止反应后，用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测定滤膜或沉淀物中的放射性，即可计算出和配基结合的受体的量。第三页，编辑于星期五：九点 一分。RBARBA的分类的分类 RBA RBA用放射性核素来标记配基，与相应的受体用放射性核素来标记配基，与相应的受体进行特异性结合反应，可对受体的性质进行定性和进行特异性结合反应，可对受体的性质进行定性和定量的分析。定量的分析。l 1 1、定性、定性RBARBA：是通过反应的量效关系的变化来判断：是通过反应的量效关系的变化来判断受体的类型，单位点或多位点结合式，及受体与配体结受体的类型，单位点或多位点结合式，及受体与配体结合的特点，反
3、应的可逆性、协作性等。合的特点，反应的可逆性、协作性等。l 2 2、定量、定量RBARBA：是在已知配体与受体反应性质：是在已知配体与受体反应性质的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或细胞中能与该放射性配体结合的细胞中能与该放射性配体结合的受体数受体数及结合的及结合的平平衡解离常数衡解离常数或或结合位点数结合位点数（最大结合容量）。（最大结合容量）。第四页，编辑于星期五：九点 一分。实验材料与仪器实验材料与仪器第五页，编辑于星期五：九点 一分。实验材料l动物组织（皮层、海马、纹状体等）l仪器（组织匀浆机、旋涡混合器、低温高速离心机、电热恒温水温箱、
4、-80冰箱、制冰机、抽虑瓶、液闪仪等）l材料（2ml/6ml分离管、10ul/200ul/1ml枪头、微纤维滤纸等）l药品（放射性配基、各种非标计化合物等）第六页，编辑于星期五：九点 一分。实验仪器l组织匀浆机lIKA，T10B S25 l漩涡混合器lWH-2第七页，编辑于星期五：九点 一分。l低温高速离心机l凯达，TGL20Ml超低温冰箱l海尔第八页，编辑于星期五：九点 一分。l数显恒温水浴锅l金燕，HH-S26Sl制冰机lGELINl型号IMS-50 automatic ice flakes第九页，编辑于星期五：九点 一分。电热恒温水温箱l循环水式多用真空泵l液闪测定计数仪lHIDEX，4
5、25-034型第十页，编辑于星期五：九点 一分。实验材料l2ml离心管l6ml一次性软试管第十一页，编辑于星期五：九点 一分。枪头1ml10ul200ul第十二页，编辑于星期五：九点 一分。lTrislPPO与POPOP第十三页，编辑于星期五：九点 一分。过滤装置l砂芯过滤装置（抽滤瓶）l1000mllWhatman GF/C玻璃微纤维滤纸 l40mm第十四页，编辑于星期五：九点 一分。放射性化合物l放射性配体l低温保存第十五页，编辑于星期五：九点 一分。实验方法流程实验方法流程第十六页，编辑于星期五：九点 一分。实验方法流程实验方法流程1 1、制备受体样品；、制备受体样品；2 2、加样、温育
6、进行结合反应；、加样、温育进行结合反应；3 3、终止反应，分离结合物与游离物、终止反应，分离结合物与游离物4 4、测定结合物的放射性；、测定结合物的放射性；5 5、数据处理。、数据处理。第十七页，编辑于星期五：九点 一分。实验具体操作（D1、D2、5-HT）l1、配制各种缓冲液及试剂 l按处方配比配制各种缓冲液贮备液l配制各种非标记配体溶液l配制各种受试药物溶液l注意注意：该项操作所需试剂或仪器该项操作所需试剂或仪器l仪器：仪器：分析天平、移液枪、烧杯、量筒、容量瓶、试管、EP管等l试剂：试剂：无水乙醇、超纯水、Tris、抗血酸、优降宁、HCl、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、DMS
7、O、甲苯、PPO、POPOP、Methysergide、Butaclamol及5HT 等 第十八页，编辑于星期五：九点 一分。2、制备膜受体 l大鼠断头取脑 l分离出目标组织 l加10倍体积（V/W）冰冷的缓冲液 l用组织匀浆机匀浆3次，每次数秒钟，制成组织匀浆液 l组织匀浆液用低温高超离心机离心（12000转/分）3次，每次20分钟l弃上清液，沉淀（膜受体）放-80度超低温冰箱保存备用 l注意：该项操作所需试剂或仪器注意：该项操作所需试剂或仪器l仪器：仪器：手术器械、组织匀浆机、制冰机、超低温冰箱、低温高超离心机 l试剂：试剂：超纯水第十九页，编辑于星期五：九点 一分。3、加样加样l取出膜受
8、体，加入一定体积的冰冷的缓冲液，混匀，使成一定浓度的膜受体溶液。l取放射性配体母液，用无水乙醇稀释成实验所需浓度取放射性配体母液，用无水乙醇稀释成实验所需浓度 l按以下顺序及比例加入各种反应液。l（1）总结合管：100ul膜受体+200ul缓冲液+10 ul 放射性配体l（2）非特异管：100ul膜受体+100ul缓冲液+100ul非标记配体+10 ul 放射性配体l（3）受试物管：100ul膜受体+100ul缓冲液+100ul药物溶液+10 ul 放射性配体l注意：该项操作所需试剂或仪器注意：该项操作所需试剂或仪器l仪器：仪器：移液枪、烧杯、量筒、EP管等l试剂：试剂：超纯水、无水乙醇、放射
9、性配体母液放射性配体母液 第二十页，编辑于星期五：九点 一分。4、受体配体结合反应受体配体结合反应l以上各管在加完放射性配体后，立即放入37度的水浴锅中，孵育20分钟。20分钟后把各管放入冰中终止反应。l注意：该项操作所需试剂或仪器注意：该项操作所需试剂或仪器l仪器：仪器：恒温水浴锅，制冰机 l试剂：试剂：无 第二十一页，编辑于星期五：九点 一分。5、分离游离及结合的放射性配体、分离游离及结合的放射性配体l上述各管在反应结束后，分别倒入抽滤装置进行过滤，并用5-10ml冰冷的缓冲液冲洗滤膜2次。滤膜放入85度烘箱中烘干，随后放入测试管中，关加入一定体积的闪烁液，浸泡过夜。l注意：该项操作所需试
10、剂或仪器注意：该项操作所需试剂或仪器l仪器：仪器：抽滤器、烘箱、滤纸、移液枪、液闪杯l试剂：试剂：甲苯、PPO、POPOP第二十二页，编辑于星期五：九点 一分。6、测定结合型放射配体每分钟放射计数测定结合型放射配体每分钟放射计数l采用放射性计数仪，测定各测试管中结合型放射配体每分钟放射计数l注意：该项操作所需试剂或仪器注意：该项操作所需试剂或仪器l仪器：仪器：液闪仪l试剂：试剂：无第二十三页，编辑于星期五：九点 一分。7、数据处理l按以下公式计算各化合物对同位素配基结合的抑制率百分率：l抑制率(I%)=（总结合管cpm化合物cpm）/（总结合管cpm非特异结合管cpm）100%l化合物每次实验
11、做两复管，进行两次单独实验。第二十四页，编辑于星期五：九点 一分。8、各种指标lIC50：半数抑制浓度lKD：平衡解离常数（mol/L），物理意义为受体有一半结合配基时所需要的配基浓度。lBmax：受体最大结合容量（fmol/mg蛋白质）lnH：Hill系数第二十五页，编辑于星期五：九点 一分。Scatchard方程与作图（饱和实验）第二十六页，编辑于星期五：九点 一分。Scatchard方程与作图l简单单位点系统受体和配体结合反应（简单单位点系统受体和配体结合反应（Clark模型）条件：模型）条件：l（1）配基与受体结合反应为可逆双分子反应；）配基与受体结合反应为可逆双分子反应；l（2）所有
12、受体都是等效和独立的，同一受体的不同）所有受体都是等效和独立的，同一受体的不同分子对配基的亲和力都相等，而且不受邻近受体分子分子对配基的亲和力都相等，而且不受邻近受体分子结合配基与否的影响；结合配基与否的影响；l（3）配体本身不代谢，也不与其它位置结合；）配体本身不代谢，也不与其它位置结合；l（4）生物效应的强度与浓度近似于总配基浓度。）生物效应的强度与浓度近似于总配基浓度。第二十七页，编辑于星期五：九点 一分。饱和曲线l固定的受体数量，固定数量的非标和不同浓固定的受体数量，固定数量的非标和不同浓度体积的放射性配体度体积的放射性配体第二十八页，编辑于星期五：九点 一分。饱和曲线饱和曲线(sat
13、uration curve)1）饱和曲线）饱和曲线 受体数量一定受体数量一定，当配体（一般是不同浓度体积的放射性当配体（一般是不同浓度体积的放射性配体与固定数量的非标）的浓度从零开始上升时，形成的复配体与固定数量的非标）的浓度从零开始上升时，形成的复合物也逐渐增多。合物也逐渐增多。但由于受体数量有限，又是可逆反应，因此但由于受体数量有限，又是可逆反应，因此RL（受体配体复合物）的增加不是直线上升，而是一条上升先（受体配体复合物）的增加不是直线上升，而是一条上升先快后慢的曲线，最后绝大部分受体与配体结合时，快后慢的曲线，最后绝大部分受体与配体结合时，RL的增加就的增加就非常缓慢，渐趋水平，即受体
14、已经饱和了，此即饱和曲线非常缓慢，渐趋水平，即受体已经饱和了，此即饱和曲线。#饱和曲线的作用？饱和曲线的作用？Scatchard作图，求得作图，求得KD与与Bmax第二十九页，编辑于星期五：九点 一分。2 2）曲线的高度取决于）曲线的高度取决于RTRT。在曲线起始段，曲线上升的快慢。在曲线起始段，曲线上升的快慢即曲线的斜率取决于配基与受体的亲和力，所以，即曲线的斜率取决于配基与受体的亲和力，所以，KDKD越小越小(亲亲和力越大和力越大)，饱和曲线上升越快，饱和曲线上升越快，KDKD越大越大(亲和力越小亲和力越小)，饱和，饱和曲线上升越慢。曲线上升越慢。（即：亲和力越大，受体与配件结合速度越快，
15、时间越短）k1,v1k1,v1 R+L R+L RL RL k2,v2 k2,v2 KDK2/K1=RL/RL第三十页，编辑于星期五：九点 一分。饱和曲线的形状和饱和曲线的形状和KD有关（如图有关（如图1）。图图1 KD对饱和曲线的影响对饱和曲线的影响 第三十一页，编辑于星期五：九点 一分。饱和曲线曲线的高度取决于饱和曲线曲线的高度取决于RT（如图（如图2）。）。图图2 RT对饱和曲线影响对饱和曲线影响第三十二页，编辑于星期五：九点 一分。质量作用定律质量作用定律(Mass action law)(Mass action law)：受体和配基的结合反应服从可逆反应的质量受体和配基的结合反应服从
16、可逆反应的质量作用定律，可用下式表示作用定律，可用下式表示:k1,v1 k1,v1 R+L R+L RL RL （1 1）k2,v2 k2,v2 上式中，上式中，RR和和L L 为游离受体和游离配基的浓度，为游离受体和游离配基的浓度，RLRL为复合物浓度，为复合物浓度，v1v1和和v2v2为结合速率和解离速率，为结合速率和解离速率，k1k1和和k2k2为结合速率常数为结合速率常数(association rate (association rate constant)constant)和解离速率常数和解离速率常数(dissociation rate constant)(dissociation
17、 rate constant)。数学表达数学表达第三十三页，编辑于星期五：九点 一分。l根据质量作用定律：v1=k1 R L；v2=k2 RLl当反应达到平衡后，v1 =v2,即:k1 RL=k2 RL,则l平衡解离常数（KD）的数学表达式为：KDK2/K1=RL/RL （2）第三十四页，编辑于星期五：九点 一分。Scatchard作图作图l设LT为配体的初始浓度，RT为受体的初始浓度（即受体总量），则有：L=LT RL R=RT RLl由式（由式（2）整理可得）整理可得：KD RT-RLL RL l将上式整理可得将上式整理可得：RL=RT 1_ RL （Scatchard 方程）方程）L K
18、D KD 变形：RL为受体与配基特异结合的量，换成B表示，L为自由配基的量，换成F表示，RT为受体总量，也即受体最大结合量，换成Bmax表示，则上式方程变为 B/F=Bmax/KD-B/KD（RT 为受体总量，等于为受体总量，等于R和和RL之和，也是最大结合量之和，也是最大结合量Bmax）以复合物浓度以复合物浓度RL为横坐标，以复合物浓度和游离配体的浓度比值为横坐标，以复合物浓度和游离配体的浓度比值RL/L为纵坐标作图，即为纵坐标作图，即为为Scatchard作图。作图。第三十五页，编辑于星期五：九点 一分。图图3 简单单位点系统简单单位点系统RBA的的Scatchard作图作图简单单位点系统
19、简单单位点系统Scatchard作图为一条直线，斜率为作图为一条直线，斜率为-（1/KD），），横轴截距为横轴截距为RT，纵轴截距为，纵轴截距为RT/KD（见图（见图3）。）。由此求得KD与Bmax第三十六页，编辑于星期五：九点 一分。Hill方程与作图l当一个受体分子可以结合一个以上的配基时，配基受体结合反应不是简单的双分子反应，而是 k1,v1k1,v1 R+nL R+nL nRL nRL，根据质量作用定律推导出，根据质量作用定律推导出HillHill方程：方程：k2,v2 k2,v2经过变形得其中n为hill系数，以结合分数B/Bmax对游离配基L作图，得Hill作图（如右）。（3）第三
20、十七页，编辑于星期五：九点 一分。l将（3）式两边取对数 第三十八页，编辑于星期五：九点 一分。非特异性结合非特异性结合(non-specific binding，NSB)NSB 在在RBA系统中，放射性配体除与受体特异性结合外，还可与系统中，放射性配体除与受体特异性结合外，还可与其他成分（如非特异蛋白、反应容器、分离材料等）结合。其他成分（如非特异蛋白、反应容器、分离材料等）结合。NSB的特点的特点 亲和力小而结合容量大，不易被饱和，随反应系统内配亲和力小而结合容量大，不易被饱和，随反应系统内配体浓度增加而线性增大，而且这种结合与生物效应无关（见体浓度增加而线性增大，而且这种结合与生物效应无
21、关（见图图4）。）。第三十九页，编辑于星期五：九点 一分。图图4 饱和曲线实验中饱和曲线实验中TB、SB和和NSB的关系的关系在在RBA的数据处理时，测得的总结合的放射性的数据处理时，测得的总结合的放射性(total binding，TB)，必须减去必须减去NSB，才能得到特异性结合，才能得到特异性结合(specific binding，SB)的数据。的数据。第四十页，编辑于星期五：九点 一分。竞争曲线l固定的放射性配基浓度，一定量的受体和不同浓度的未标记化合物第四十一页，编辑于星期五：九点 一分。数学表达l此实验用于测定非标计药物与放射性配基竞争结合同一受体的能力。通常用IC50和Ki来表示
22、。第四十二页，编辑于星期五：九点 一分。闪烁液l包括溶剂、闪烁剂和添加剂l溶剂：溶解闪烁剂和放射性样品，吸收和传递射线能量。l闪烁剂：第一闪烁剂（吸收受激溶剂能量，退激发光）、第二闪烁剂（波长转移，匹配光电倍增管光谱；提高淬灭耐受）l添加剂：助溶剂、抗淬灭剂第四十三页，编辑于星期五：九点 一分。各受体的非标与同位素受体非标放射性配基受体组织5-HT1A 5-HT(serotonin)3H-8-OH-DPAT大鼠纹状体/皮层5-HT2AMethysergide3H-Ketanserin大鼠纹状体/皮层D2Butaclamol3H-Spiperone大鼠纹状体1Prazosin3H-prazosi
23、n大鼠皮层2Rauwolscine3H-Rauwolscine大鼠皮层M阿托品3H-QNB（毕兹）大鼠脑去小脑/回肠心得舒3H-DHA鸭红细胞/大鼠脑第四十四页，编辑于星期五：九点 一分。RBA的安全问题的安全问题第四十五页，编辑于星期五：九点 一分。射线射线第四十六页，编辑于星期五：九点 一分。放射型物质发出的射线有三种：放射型物质发出的射线有三种：天然放射现象第四十七页，编辑于星期五：九点 一分。三种射线三种射线l射线射线l射线射线 l射线射线 第四十八页，编辑于星期五：九点 一分。射线射线l根根据据射射线线的的偏偏转转方方向向和和磁磁场场方方向向的的关关系系可可以以确确定定，偏偏转转较较
24、小小的的一一束束由由带带正正电电荷荷的的粒粒子子组组成成，我我们们把把它它叫叫做做射射线线，射射线线由由带带正正电电的的粒粒子子组组成成.科科学学家家们们研研究究发发现现每每个个粒粒子子带带的的正正电电荷荷是是电电子子电电荷荷的的2倍倍，粒粒子子质质量量大大约约等等于于氦氦原原子子的的质质量量.进进一一步步研研究究表表明明粒粒子就是氦原子核子就是氦原子核.l由由于于粒粒子子的的质质量量较较大大，所所以以射射线线的的穿穿透透本本领最小，我们用一张厚纸就能把它挡住领最小，我们用一张厚纸就能把它挡住.第四十九页，编辑于星期五：九点 一分。射线射线l与与射射线线偏偏转转方方向向相相反反的的那那束束射射
25、线线带带负负电电荷荷，我我们们把把它它叫叫做做射射线线.研研究究发发现现射射线线由由带带负负电电的的粒粒子子（粒粒子子）组组成成.进进一一步步研研究表明究表明粒子就是电子粒子就是电子.l射线的穿透本领较强，很容易穿透黑射线的穿透本领较强，很容易穿透黑纸，还能穿透几厘米厚的铝板纸，还能穿透几厘米厚的铝板.第五十页，编辑于星期五：九点 一分。射线射线l 中中间间不不发发生生偏偏转转的的那那束束射射线线叫叫做做射射线线，研研究究表表明明，射射线线的的实实质质是是一一种种波波长长极极短短的的电磁波电磁波，它不带电，是中性的，它不带电，是中性的.l射线的穿透本领极强，一般薄金属板射线的穿透本领极强，一般
26、薄金属板都挡不住它，它能穿透几十厘米厚的水泥都挡不住它，它能穿透几十厘米厚的水泥墙和几厘米厚的铅板墙和几厘米厚的铅板.第五十一页，编辑于星期五：九点 一分。射线l在某种核反应中，一个中子变成一个电子和一个质子.这就是原子核内没有电子，又会放出电子，这就是产生射线的原因.l射线是一种带负电荷的、高速运行、从核素放射性衰变中释放出的粒子。人类受到来源于人造或自然界(氚，C14等)射线的照射，射线比射线更具有穿透力，但在穿过同样距离，其引起的损伤更小。一些射线能穿透皮肤，引起放射性伤害。但是它一旦进入体内引起的危害更大。粒子能被体外衣服消减、阻挡或一张几毫米厚的铝箔完全阻挡。第五十二页，编辑于星期五
27、：九点 一分。放射防护措施第五十三页，编辑于星期五：九点 一分。外照防护措施l时间防护：尽量减少受照射时间。l距离防护：距离越远，辐射能量越低。l屏蔽防护：射线注意防止内照射；射线可用铝、有机玻璃、塑料等原子序数较低的物质；射线可用铅、铁、混凝土等高原子序数物质。第五十四页，编辑于星期五：九点 一分。内照射防护措施l围封隔离防扩散：“三区配置”法，即清洁区、中间区、活性区；通风良好、独立的下水处理系统；遵守SOP。l除污保洁防污染l个人防护侵入：穿戴适当的个人保护衣具，如工作服、口罩、鞋、帽等。不准在工作场所进食、吸烟。工作结束后进行卫生清洗，并作污染检测。第五十五页，编辑于星期五：九点 一分
28、。放射性“三废”处理l基本方法：放置衰变、浓缩储存、稀释排放l固体：一般用放置法（半衰期短）、焚化法（废气的处理）、埋藏法（不可燃/焚化残渣）l液体：一般用放置法（半衰期短）、稀释法（量少浓度低）、浓集法（富集掩埋）l气体：大气排放（低浓度/气溶胶）、过滤器或液体吸收（高浓度）第五十六页，编辑于星期五：九点 一分。表面放射性污染的处理l皮肤：轻度，大量清水和肥皂清洗；严重，10%EDTA或6.5%高锰酸钾浸泡清洗l工作场所表面：轻度，大量清水或洗涤剂清洗；严重，挖去再填充或覆盖油漆/塑料板l工作服：轻度，肥皂水；严重，0.02mol/L盐酸、1%草酸洗涤或废物处理l仪器及设备：玻璃与陶瓷，3%
29、盐酸/10%枸橼酸浸泡1h后冲洗再用洗液浸泡15min后再清洗；金属，用肥皂、枸橼酸钠、EDTA或其它有机溶剂或超声清洗第五十七页，编辑于星期五：九点 一分。例子：M胆碱受体配体结合实验第五十八页，编辑于星期五：九点 一分。试剂l放射配体：3H-QNB（比活度：22ci/mmol）l非标：阿托品l0.32mol/L蔗糖溶液l0.05mol/L TrisHCl缓冲液pH7.5。l生理盐水l甲苯闪烁液 PPO2,5-Diphenyloxazole【2,5-二甲基恶唑】2.5g加POPOP1,4-Bis(5-phenyloxazol-2-yl)benzene【1,4-双（5-苯基恶唑基-2）苯】0.
30、05g，溶于500ml甲苯中。第五十九页，编辑于星期五：九点 一分。受体组织的制备l中枢：大鼠断头取脑，去小脑；20倍0.32mol/L蔗糖制成匀浆；离心，上清液Tris缓冲液悬浮；Lowry法测蛋白。l外周肠平滑肌：豚鼠取回肠，生理盐水或Tris缓冲液清洗/保存。第六十页，编辑于星期五：九点 一分。受体配体结合l一、饱和曲线：每个反应管中加入200ul固定浓度的膜蛋白（0.2mg/ml）和50ul不同浓度的3HQNB(0.1、0.25、0.5、1.01、2.15、3.0、4.26、5.48nmol/L),在非特异结合管中另加入终浓度为10-6mol/L的阿托品，补充Tris缓冲液至总体积1m
31、l，其中之一的操作如下第六十一页，编辑于星期五：九点 一分。孵育与测量l水温37孵育30min，5ml冰冷的Tris缓冲液终止反应；抽虑冲洗游离的3HQNB。l滤片80、30min烘干后置于甲苯闪烁液中，液闪仪测量放射量。第六十二页，编辑于星期五：九点 一分。下图为测量结果之一计算：1、特异性结合=BS=BT-BNS2、特异结合（特异结合（B）fmol/mg蛋白蛋白：特异结合（B）fmol/mg蛋白的物理意义：1mg蛋白特异结合的放射性配体的物质的量。（1）求放射性配体的物质的量。其核心就是将SB的DPM转化为化学量物质的量，3HQNB的比活度为22ci/mmol,并且不随稀释而改变,且上述S
32、B为384dpm。分两步：第一步：将DPM值转化为放射性强度1mci=2.22109dpm，则1dpm=1/2.2210-9mci,而384dpm=384/2.2210-9mci第二步：将放射性强度转化为物质的量3HQNB的比活度为22ci/mmol，则384dpm=（384/2.2210-9mci）/(22ci/mmol)=7.8610-12mmol=7.8610-15mmol=7.86fmol（2）膜蛋白的质量。200ul1mg/ml=0.2mg故：特异结合（B）fmol/mg为7.86fmol/0.2mg=39.3fmol/mg39 fmol/mg特异结合量特异结合量B/游离量游离量Ff
33、mol/mg蛋白蛋白nmol/L：（1）特异结合量B已得：39 fmol/mg（2）游离量F，即为结合实验时游离的放射性配体 因为点膜得出，总的放射量为4884dpm，而特异性结合量为384dpm，则游离量为：4884-384=4500（dpm）同上可得，4500dpm=92.1nmol，因为反应液体积为1ml，故浓度为0.0921nmol/l0.1nmol/l故：特异结合量B/游离量Ffmo l/mg蛋白nmol/L为(39fmol/mg)/(0.1nmol/L)=390 fmol/mg蛋白nmol/L第六十三页，编辑于星期五：九点 一分。作图求值（按Scatchard方程式B/F=-B/KD+Bmax/KD，以B为横坐标，相应的B/F为纵坐标，直线回归求斜率-1/KD）和截距（Bmax/KD）第六十四页，编辑于星期五：九点 一分。Hill作图lHill作图基本同简单的双分子作图，根据公式第六十五页，编辑于星期五：九点 一分。二、竞争曲线l固定3HQNB浓度，加不同浓度未标记化合物和一定量膜蛋白，例如根据反应结果做出竞争曲线，用直线回归求得IC50、Ki 值等第六十六页，编辑于星期五：九点 一分。谢谢第六十七页，编辑于星期五：九点 一分。