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1、马玉超北京林业大学生物科学与技术学院北京林业大学生物科学与技术学院办公地点：生物楼办公地点：生物楼117117；电话：；电话：6233601662336016；现代微生物学实验技术实 验 内 容16S rRNA基因的基因的PCR扩增、电泳及系统发育分析扩增、电泳及系统发育分析染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 大肠杆菌大肠杆菌-半乳糖苷酶的诱导表达半乳糖苷酶的诱导表达 利用利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性分析融合蛋白的可溶性 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取16S rRNA基因的基因的PCR扩增、电泳扩增、电泳及系统发育
2、分析及系统发育分析窦窦 桂桂 铭铭实实 验验 目目 的的1.掌握PCR的原理，增强对PCR重要性的认识；2.掌握电泳技术及系统发育分析的方法，为将来课题研究奠定基础。PCRPCR（Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction）法法，又称为，又称为聚合酶链聚合酶链反应或反应或PCRPCR扩增技术扩增技术，是一种高效快速的体外，是一种高效快速的体外DNADNA聚合程序聚合程序设想设想实现实现改进与完善改进与完善72949455PCRPCR循循环环PCRPCR技术的反应原理技术的反应原理PCRPCR技术的反应原理技术的反应原理DNADNA或或R
3、NARNA模板模板5555待扩增待扩增DNADNA区域区域339494 5 5 minmin55555555退火退火5555聚合聚合3333555533循环循环25-3025-30次次变性变性7070DNADNA引物引物DNADNA聚合酶聚合酶dNTPsdNTPsMgMg2+2+（缓冲液）缓冲液）125555 目的基因目的基因变性变性加热加热55 55 引物引物退火退火55 55 底物底物延伸延伸55 55 55 加热加热变性变性55 退火退火 引物引物223030个循环：个循环：2 23030目标目标DNADNA片段达片段达101066-10-1077变性退火延伸55 552455 55 5
4、555 55 延伸延伸5555 55 55 55 一个标准的PCR过程核酸的凝胶电泳基本原理当一种分子被放置在电场中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度电泳的迁移率。迁移率的影响因素：电场长度、电泳分子的电荷数量、电泳分子与支持介质的摩擦系数等。在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态的叫做多聚阴离子。方向：负正种类：水平水平垂直垂直琼脂糖琼脂糖聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺普通普通DNARNA小分子量小分子量核酸核酸二、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖：线性多糖聚合物、从红色海藻产物琼脂中提取而来。加热凝固：网孔状的电泳介质，密度由琼脂糖的浓度决定。琼脂
5、糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNA片段的能力片段的能力琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围片段的范围:0.2-50kb凝胶浓度 线形DNA的最佳分辨范围（bp）0.5%1,00030,0000.7%80012,0001.0%50010,0001.2%4007,0001.5%2003,0002.0%502,000琼脂糖DNA分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因素的影响：核酸核酸分子量的大小分子量的大小分子状态分子状态物理物理电压电压缓冲液缓冲液温度温度电泳指示剂：溴芬兰，距边缘1cm左右停止电泳。电泳染色剂：溴化乙锭(ethidium bromide,简称EtBr)，扁平染料，嵌到DNA或
6、RNA分子的碱基之间，借助紫外灯观察。DNA Marker1.2kb800bp操操 作作 步步 骤骤成成 分分贮液浓度贮液浓度使用量使用量(20l体系体系)水水14l10GC BufferMg2+Plus2ldNTPs2.5mmol0.5l16Sp110pmol/l1 l16S p210pmol/l 1l基因组基因组DNA100g/ml1lTaq酶酶5U/l0.5l循环次数循环次数反应条件反应条件195（10min）3094；30s58；1min72；1min30s172；10min172(10min)操操 作作 步步 骤骤(1)称取琼脂糖，用适当的电泳缓冲液(常用1TAE)配成所需浓度的胶；
7、10TAE 缓冲液配制：0.4M Tris-乙酸；0.02M EDTA，pH8.0(2)置微波炉中加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解；(3)按照每20ml胶加入1l Goldview/20ml；(4)凝胶溶液冷却至50左右，倒入电泳胶盘，避免出现气泡，室温放置，至胶凝固；(5)小心拔出梳子，将胶盘放到有1TAE 缓冲液的水平电泳槽中；(6)样品中加入1/5 体积的6loading buffer，混匀，用移液器小心加到点样孔中，以稳定电压(4-5V/cm)电泳；6加样指示剂配方:0.25%溴酚蓝;40%(W/V)蔗糖水溶液；(7)取出凝胶，紫外灯下观察电泳结果，如有必要，拍照记录。琼脂糖凝胶电泳：Ri
8、bosomal RNA Sequences核糖体RNA序列与进化（1）具有重要且恒定的生理功能；（2）普遍存在于原核生物和真核生物中，而且在系统发育上具有适当的保守性；（3）分子量大小适中，在细胞中含量大(约占细胞中RNA的90%)（4）高度保守、中度保守和高度变化的序列区域，适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。小核糖体亚单位RNA（16S rRNA，18S rRNA）16S rRNA的系统发育分析1 AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG GACGAACGCT GGCGGCGTGC TTAACACATG CAAGTCGAGC61 GGTAAGGCTC CTTCGGGAGT ACA
9、CGAGCGG CGAACGGGTG AGTAACACGT GAGTAATCTG121 CCCTCCACTT TGGGATAAGC CTCGGAAACG AGGTCTAATA CCGAATACGA CCACTTCCTG181 CATGGGATGG TGGTGGAAAG TTTTTTCGGT GGGGGATGTG CTCGCGGCCT ATCAGCTTGT241 TGGTGGGGTA ATGGCCTACC AAGGCTTCGA CGGGTAGCCG GCCTGAGAGG GTGACCGGCC301 ACACTGGGAC TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAG
10、TGGGG AATATTGGAC361 AATGGGCGGA AGCCTGATCC AGCAACGCCG CGTGAGGGAT GACGGCCTTC GGGTTGTAAA421 CCTCTTTCAG CGGGGACGAA GCGCAAGTGA CGGTACCCGC AGAAGAAGCA CCGGCCAACT481 ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGTAGGG TGCGAGCGTT GTCCGGAATT ATTGGGCGTA541 AAGGGCTCGT AGGCGGTTTG TCGCGTCGGG AGTGAAAACA CCGGGCTTAA CTCGGTGCTT601 GCTT
11、TCGATA CGGGCAGACT AGAGGTATTC AGGGGAGAAC GGAATTCCTG GTGTAGCGGT661 GAAATGCGCA GATATCAGGA GGAACACCGG TGGCGAAGGC GGTTCTCTGG GAATATCCTG721 ACGCTGAGGA GCGAAAGTGT GGGGAGCGAA CAGGATTAGA TACCCTGGTA GTCCACACCG781 TAAACGTTGG GCGCTAGGTG TGGGATCCAT TCCACGGGTT CCGTGCCGCA GCTAACGCAT841 TAAGCGCCCC GCCTGGGGAG TACGGC
12、CGCA AGGCTAAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGGC901 CCGCACAAGC GGCGGAGCAT GCGGATTAAT TCGATGCAAC GCGAAGAACC TTACCTGGGT961 TTGACATACA CCGGAAAGCT GCAGAGATGT AGCCCCTTTT AGTCGGTGTA CAGGTGGTGC1021 ATGGCTGTCG TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC1081 TCGTCCTATG TTGCCAGCAA GCCTTCGGGT GTTGGGGACT CATAGG
13、AGAC TGCCGGGGTC1141 AACTCGGAGG AAGGTGGGGA TGACGTCAAG TCATCATGCC CCTTATGTCC AGGGCTTCAC1201 GCATGCTACA ATGGCCGGTA CAAAGGGCTG CGATCCCGTG AGGGGGAGCG AATCCCAAAA1261 AGCCGGTCTC AGTTCGGATT GGGGTCTGCA ACTCGACCCC ATGAAGTCGG AGTCGCTAGT1321 AATCGCAGAT CAGCAACGCT GCGGTGAATA CGTTCCCGGG CCTTGTACAC ACCGCCCGTC1381 ACGTCACGAA AGTCGGCAAC ACCCGAAGCC GGTGGCCTAA CCCTTGTGGA GGGAGCCGTC1441 GAAGGTGGGG CTGGCGTTTG GGACGAAGTC GTAACAAGGT AGCCGTA16S rRNA的系统发育分析NCBI Blast：MEGA 软件构建系统发育树FASTA格式文件找到刚才保存的文件实 验 结 果1.电泳图片（表明样品名称和Marker 分子量，目的片段大小）2.构件一个系统发育树