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1、第十六章 基因工程和蛋白质工程简介第一节 DNA 重组与基因工程第二节 蛋白质工程简介第三节 核酸研究技术简介返回第一节 DNA 重组和基因工程 基因工程亦称遗传工程，即利用DNA 重组技术的方法，把DNA 作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体DNA 重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因DNA 在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。一、DNA 重组的技术路线二、基因工程的应用与前景三、DNA 体外重组常用的酶DNA 重组的 技术路线Foreign DNA to be inse
2、rtedPlansmid vectorJoiningRecombinant DNA molecule Introduction into host cells by transformation of viral infection Host chromatemeSlection for cells coteining a recombinant DNA moleculeCloning+1、目的基因的制备2、载体的构建3、目的基因与载体的重组4、重组 体导入宿主细胞进行扩增5、克隆基因的鉴定Ti 质粒结构植物冠瘿瘤pBR322 质粒的结构以 噬菌体为载体进行DNA 克隆DNA用限制性内切酶除去
3、中间一段与外源DNA 连接重组载体的体外包装带有外源DNA 的 噬菌体太小不能被包装头部前体多联体DNAA 蛋白COSCOS COS成熟的颗粒在宿主细胞内进行DNA 的装配过程 噬菌体感染大肠杆菌的途径DNA 重组体的筛选 载体特征的直接筛选 菌落的原位杂交 免疫学方法pBR322 质粒结构 如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活 如果外源DNA 插入，四环素抗性基因失活原位杂交法筛选DNA 重组体图解复印至硝酸纤维素膜上用NaOH 菌体裂解DNA 变性杂交放射自显影32P-cDNA与放射性cDNA 杂交的菌落的斑点细菌菌落单链DNA 结合到膜上Southern印迹法DNA 分子限制片段限
4、制性酶切割琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记DNA 探针杂交放射自显影带有DNA 片段的凝胶凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜Southern 和Western 印迹法DNA frangmentElectrophoresisTransfer of DNA by blotting32P-labled DNA probeAutoradiographyAgarrose gelAutoradiogramNitrocellulose sheetAutoradiogramPolymer sheetSDS-Polyacrylamide gelTransfer proteinAdd rad
5、iolabled spesfic antibody,Wash to remove unboud antibodyProtein band detected by specific antibodyAutoradiographyDNA 重组技术的应用(1)开辟生物学研究的新纪元 反向生物学（invese biology）的诞生（2）促进生物技术产业的兴起 基因药物 基因诊断和治疗 转基因动植物胰岛素原的人工合成胰脏(A)n胰岛素原mRNAcDNA重组质粒转化细菌mRNA反转录酶胰岛素原基因与质粒连接感染E.coli胰岛素原Ti质粒为载体的植物基因工程I 二元载体系统II 共整合载体III T-D
6、NA 的转移与整合Ti 辅助质粒Ti 辅助DNA给体质粒Ti 辅助DNA给体质粒 pBR 型质粒（给体质粒）宿主特异性外源基因宿主特异性整合带有外源基因的Ti 质粒植物DNATi 质粒转移并插入植物DNA第二节 蛋白质工程简介 蛋白质技术和核酸技术的相互增强 在广泛利用自然界存在的各种蛋白质的过程中发现。这些蛋白质只是适应生物自身的需要，而对于它们的产业化开发往往并不合意，需要加以改造。1983年美国基因公司的Ulmer 首先提出蛋白质工程这个名词，它是指按照特定的需要，对蛋白质进行分子设计和改造的工程。自此之后，蛋白质工程迅速发展，生物工程的重要组成部分。蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础
7、，通过蛋白质一级结构、晶体结构和溶液构象的研究，积累成千上万蛋白质一级结构和高级结构的数据资料，然后按照蛋白质形成的规律，经周密的分子设计，改造蛋白质或构建新的蛋白质。研究得多，取得成果最显著的是生物技术药（激素、细胞因子、酶、酶的激活剂、受体和配体、细胞毒素和杀菌肽以及抗体等）和工业用酶的蛋白质工程。生物酶工程示意图酶的蛋白质结构功能 新酶分子蓝图选择性修饰方案突变酶 新酶克隆酶产品效用发展酶基因遗传设计遗传修饰DNA 重组技术DNA 重组技术蛋白质技术和核酸技术的相互增强插入表达载体转化寄主细胞推导出AA 顺序制备合成肽制备对所编码蛋白专一的抗体基因或cDNA蛋白质蛋白质测定出AA 顺序合
8、成cDNA探针制备专一的抗体沉淀核糖体分离mRNA用Southern 印迹法筛选DNA 文库基因或cDNA第三节 核酸研究技术简介一、DNA 序列测定二、基因文库与cDNA 文库三、聚 合 酶 链 式 反 应（polymerase chain reaction,PCR）DNA 测序的基本战略 设 法 产 生 带 标 记 的 不 同 长 度 的 成 套DNA片 段，各 带 有 标 记 的 片 段 起 点 相 同、终 点 不同，使 待 测 的DNA 链 中 的 相 应 每 个 核 苷 酸 处都 有 断 裂 或 终 止。通 过PAGE 电 泳，能 够 将 相差 一 个 核 苷 酸 的DNA 片 段
9、分 开，放 射 自 显 影后，根 据 长 短 排 列，根 据 特 定 末 端 碱 基 的DNA 片段就可读出待测DNA 的碱基序列。酶法 化学法 测序技术进展酶法序列分析的原理 酶反应电泳方向模板CCGGTAGCAACT3 5GG5 3 引物dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGTTGGGCCATCGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTA C G TAGTTGCTAC
10、C35TCAACGATGG53读出模板互补序列读出模板序列GGCCATCGTTGAGGCCATCGTGGCCATCGTTGGGCCATCGTTGGCCATCGGGCCATCGGCCAGGCCATGGCCGGCDNA 的Sanger测序法(酶法)读出模板互补序列dNTP 凝胶电泳 较大片段 较小片段ddGTP ddATP ddCTP ddTTP 反应混合物Klenow 酶 未知序列的单链DNA 读出待测序列CTGACTTCGACAAAGAA53 放射性标记的引物TGTTA C T GddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT35CTGACTTCGACAA53DNA 的测序仪示意图comp
11、uter analysis凝胶中DNA 移动方向样品槽激光器输入光学系统成象透镜聚焦透镜高灵敏度相机旋光镜/棱镜组件DNA 的化学测序示意图 反应试剂G 反应：硫酸二甲酯G+A 反应：甲酸T+C 反应：肼C 反应：NaCl+肼测序技术进展同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳多色荧光标记毛细管电泳 单色荧光标记平板电泳同位素标记平板电泳A C G TA C G T测序图谱T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C T引物标记法测序(Dye Primer)一个样本，4 个反应。4 个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜色的荧光。+AmpliTaq FS enzymedCTP
12、,dATP,dGTP,dTTPddATP(terminator)+AmpliTaq FS enzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddCTP+AmpliTaq FS enzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddGTP+AmpliTaq FS enzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddTTP 反应结束后，将4 管反应液混合，经乙醇沉淀后上样终止法测序(Dye Terminator)一个样本，1 个反应。反应中包含分别带4 色荧光标记的ddNTP(终止子)unlabeled primertemplate DNA+AmpliTaq FSdATP,dCTP,dGTP,d
13、TTPddCTPddATPddGTPddTTP 测序反应结束后，采用乙醇沉淀法进 测序反应结束后，采用乙醇沉淀法进行纯化，除去过量的 行纯化，除去过量的ddNTP ddNTP 后上样。后上样。三基因文库与cDNA 文库1基因文库（genomic library）cDNA 文库（complemental DNA library）2.文库的构建 基因文库 基因文库是指整套由基因组DNA 片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和。应用DNA 重组技术，可以将各种生物体全部基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中，以备需要时应用。好象将文献资料贮存于图书馆一样，所以称其为genomic libr
14、ary。基因文库中应包含多少DNA 克隆才能使任意所需要的基因以极高的概率存在于该文库中？其计算公式如下：N=ln(1-p)/ln(1-f)N 基因文库所包含克隆的数目；p 任意所需基因存在于基因文库中的概率，要求大于99%；f 克隆的DNA 片段大小（bp）占基因组大小(bp)的分数。cDNA 文库 真核细胞基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经RNA 转录后加工过程才使编码序列拼接在一起。真核生物基因不能在原核生物中表达，只有将加工成熟的mRNA 反转录成cDNA（complemental DNA）接上原核生物表达控制元件，才能在原核生物中
15、表达。再有，真核生物的基因通常只有一小部分进行表达，由于mRNA 的不稳定性，对基因表达和有关mRNA都通常通过对其cDNA 来进行研究的。将细胞全部mRNA 反转录成cDNA并被克隆的总和称为cDNA 文库。RNA 病毒的基因组是RNA，也必须将RNA 先转录成cDNA，再建立文库。为使低丰度的mRNA 的cDNA 克隆存在的概率大于99%，cDNA 文库应含的克隆数的计算公式如下：N=ln(1-p)/ln(1-1/n)N cDNA 文库所包含克隆的数目；p 低丰度cDNA 存在于基因文库中的概率，要求其大于99%；1/n 每一种低丰度的mRNA 占总 mRNA 的分数。基因文库和cDNA
16、文库的建立组织可克隆之DNA载体DNAcDNAmRNA部分或完全酶解DNADNA 长度分级甲基化，双链接头DNADNA 与载体连接引入大肠杆菌鉴定文库的滴度和特性扩增后供长期储存筛选出所需要的克隆噬菌体为载体的基因文库的构建四、聚合酶链式反应（PCR）1985年Mullis 发明PCR（polymerase chain reaction）快速扩增DNA 的方法。该法模仿体内DNA 的复制过程，首先使DNA 变性，两条链解开，然后使引物模板退火，二者碱基配对，DNA 聚合酶随即以4种dNTP 为底物，在引物的引导下合成与模板互补的DNA 新链。重复此过程，DNA 以指数方式扩增。扩增的公式为:Y
17、=(1+X)n 式中 y一产量;X-扩增效率;n 一循环次数。（2）PCR 的应用（1）PCR 的原理 PCR 技术原理示意图靶序列变性和引物复姓循环1循环2循环3变性和引物复姓链延伸Tag 酶链延伸PCR 技术的发展与应用 用于合成特异探针；用于DNA 的测序；将逆转录与PCR 相偶联（RT-PCR）；用于基因定位诱变；末知序列的PCR 扩增；基因组序列的比较研究；用于临床诊断。DNA 芯片(DNA chip)技术是采用寡核苷酸原位合成或显微打印手段，将数以万计的DNA 探针片段有序地固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，反应结果通过检测杂交信号的方法（同位素
18、法、化学荧光法、化学发光法或酶标法）显示，再用精密的扫描仪或CCD 摄象技术记录，通过计算机软件分析，综合成可读的IC总信息，来实现对生物样品的快速、并行、高效地检测或诊断。芯片分析实际上也是传感器分析的组合。芯片阵列中的每一个单元微点都是一个传感器的探头，所以传感器技术的精髓往往都被用于芯片的发展。阵列检测可以大大提高检测效率，减少工作量，增加可比性，所以芯片技术也是传感器技术的发展。DNA 芯片技术简介DV A 芯片工作示意图emissionLaser 1 Laser 2computer analysisDNA clones testreverse transcriptionLabel with fluor dyesPCR amplification purficationhybridize target to microarrayrobotic printingreference