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1、第一节第一节 DNA重组和基因工程重组和基因工程 基因工程亦称遗传工程，即利用基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把重组技术的方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体（目的基因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。原有的遗传性
2、状。一、一、DNA重组的技术路线重组的技术路线二、基因工程的应用与前景二、基因工程的应用与前景三、三、DNA体外重组常用的酶体外重组常用的酶原位杂交法筛选原位杂交法筛选DNA重组体图解重组体图解复印至硝酸复印至硝酸纤维素膜上纤维素膜上用用NaOH菌体裂菌体裂解解DNA变性变性杂交杂交放射自显影放射自显影32P-cDNA与放射性与放射性cDNA杂杂交的菌落的斑点交的菌落的斑点细菌菌落细菌菌落单链单链DNA结结合到膜上合到膜上Southern印迹法印迹法DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割琼脂糖电泳琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记与放射性标记DNA探
3、针杂交探针杂交放射自显影放射自显影带有带有DNA片片段的凝胶段的凝胶凝胶凝胶滤膜滤膜用缓冲液用缓冲液转移转移DNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜Southern和和Western印迹法印迹法DNA frangmentElectrophoresisTransfer of DNA by blotting32P-labled DNA probeAutoradiographyAgarrose gelAutoradiogramNitrocellulose sheetAutoradiogramPolymer sheetSDS-Polyacrylamide gelTransfer proteinAdd
4、radiolabled spesfic antibody , Wash to remove unboud antibodyProtein band detected by specific antibodyAutoradiographyDNA重组技术的应用重组技术的应用 (1) 开辟生物学研究的新纪元开辟生物学研究的新纪元 反向生物学（反向生物学（invese biology）的诞生）的诞生（2）促进生物技术产业的兴起）促进生物技术产业的兴起 基因药物基因药物 基因诊断和治疗基因诊断和治疗 转基因动植物转基因动植物胰岛素原的人工合成胰岛素原的人工合成胰脏胰脏(A)n胰岛素原胰岛素原mRNAcD
5、NA重组质粒重组质粒转化细菌转化细菌mRNA反转录酶反转录酶胰岛素原基因胰岛素原基因与质粒与质粒连接连接感染感染E.coli胰岛素原胰岛素原Ti质质粒粒为为载载体体的的植植物物基基因因工工程程I 二元载体系统二元载体系统II 共整合载体共整合载体III T-DNA的转移与整合的转移与整合Ti辅助质粒辅助质粒Ti辅助辅助DNA给体质粒给体质粒Ti辅助辅助DNA给体质粒给体质粒 pBR型质粒型质粒（给体质粒）（给体质粒）宿主特宿主特异性异性外源基因外源基因宿主特宿主特异性异性整合整合带有外源基因带有外源基因的的Ti质粒质粒植物植物DNATi质粒转移并质粒转移并插入植物插入植物DNA第二节第二节 蛋
6、白质工程简介蛋白质工程简介 蛋白质蛋白质技术和核酸技术的相互增强技术和核酸技术的相互增强 在广泛利用自然界存在的各种蛋白质的过程中发现。这些蛋在广泛利用自然界存在的各种蛋白质的过程中发现。这些蛋白质只是适应生物自身的需要，而对于它们的产业化开发往往白质只是适应生物自身的需要，而对于它们的产业化开发往往并不合意，需要加以改造。并不合意，需要加以改造。1983年美国基因公司的年美国基因公司的Ulmer首先提首先提出蛋白质工程这个名词，它是指按照特定的需要，对蛋白质进出蛋白质工程这个名词，它是指按照特定的需要，对蛋白质进行分子设计和改造的工程。自此之后，蛋白质工程迅速发展，行分子设计和改造的工程。自
7、此之后，蛋白质工程迅速发展，生物工程的重要组成部分。生物工程的重要组成部分。 蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础，通过蛋白质一级蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础，通过蛋白质一级结构、晶体结构和溶液构象的研究，积累成千上万蛋白质一级结构、晶体结构和溶液构象的研究，积累成千上万蛋白质一级结构和高级结构的数据资料结构和高级结构的数据资料，然后按照蛋白质形成的规律，经，然后按照蛋白质形成的规律，经周密的分子设计，改造蛋白质或构建新的蛋白质。周密的分子设计，改造蛋白质或构建新的蛋白质。 研究得多，取得成果最显著的是生物技术药（激素、细胞研究得多，取得成果最显著的是生物技术药（激素、细胞因子、酶、酶
8、的激活剂、受体和配体、细胞毒素和杀菌肽以因子、酶、酶的激活剂、受体和配体、细胞毒素和杀菌肽以及抗体等）和工业用酶的蛋白质工程。及抗体等）和工业用酶的蛋白质工程。生物酶工程示意图生物酶工程示意图酶的蛋白质结构功能酶的蛋白质结构功能新酶分子蓝图新酶分子蓝图 选择性修饰方案选择性修饰方案突变酶突变酶 新酶新酶克隆酶克隆酶产品产品效用效用发发展展酶基因酶基因遗传设计遗传设计遗传修饰遗传修饰DNA重组重组技术技术DNA重组重组技术技术蛋白质技术和核酸技术的相互增强蛋白质技术和核酸技术的相互增强插入表达载体插入表达载体转化寄主细胞转化寄主细胞推导出推导出AA顺序顺序制备合成肽制备合成肽制备对所编码蛋白制备
9、对所编码蛋白专一的抗体专一的抗体基因或基因或cDNA蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质测定出测定出AA顺序顺序合成合成cDNA探针探针制备专一的抗体制备专一的抗体沉淀核糖体沉淀核糖体分离分离mRNA用用Southern印迹法印迹法筛选筛选DNA文库文库基因或基因或cDNA第三节第三节 核酸研究技术简介核酸研究技术简介一、一、DNA序列测定序列测定二、基因文库与二、基因文库与cDNA文库文库三、聚合酶链式反应（三、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）DNA测序的基本战略测序的基本战略 设法产生带标记的不同长度的成套设法产生带标记的不同长度的成套DNA片段，各带有标
10、记的片段起点相同、终点不片段，各带有标记的片段起点相同、终点不同，使待测的同，使待测的DNA链中的相应每个核苷酸处链中的相应每个核苷酸处都有断裂或终止。通过都有断裂或终止。通过PAGE电泳，能够将相电泳，能够将相差一个核苷酸的差一个核苷酸的DNA片段分开，放射自显影片段分开，放射自显影后，根据长短排列，根据特定末端碱基的后，根据长短排列，根据特定末端碱基的DNA片段就可读出待测片段就可读出待测DNA的碱基序列。的碱基序列。 酶法酶法 化学法化学法 测序技术进展测序技术进展酶酶法法序序列列分分析析的的原原理理 酶酶反反应应电电泳泳方方向向模板模板CCGGTAGCAACT3 5 GG5 3 引物引
11、物dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGTTGGGCCATCGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTA C G TAGTTGCTACC3 5 TCAACGATGG5 3 读出模板读出模板互补序列互补序列读出模板读出模板序列序列GGCCATCGTTGAGGCCATCGTGGCCATCGTTGGGCCATCGTTGGCCATCGGGCCATCGGCCAGGCCATGGCCG
12、GCDNA的的Sanger测序法测序法(酶法酶法) 读出模板读出模板互补序列互补序列dNTP 凝胶电泳凝胶电泳 较大片段较大片段 较小片段较小片段ddGTPddATPddCTP ddTTP 反应混合物反应混合物Klenow酶酶 未知序列的单链未知序列的单链DNA 读出待测读出待测序列序列CTGACTTCGACAAAGAA5 3 放射性标记的引物放射性标记的引物TGTTA C T GddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3 5 CTGACTTCGACAA5 3 DNA的测序仪示意图的测序仪示意图computer analysis凝胶中凝胶中DNA移动方向移动方向样品槽样品槽激光器激光
13、器输入光学系统输入光学系统成象透镜成象透镜聚焦透镜聚焦透镜高灵敏度相机高灵敏度相机旋光镜旋光镜/棱镜组件棱镜组件DNA的化学测序示意图的化学测序示意图 反应试剂反应试剂G反应：硫酸二甲酯反应：硫酸二甲酯G+A反应：甲酸反应：甲酸T+C反应：肼反应：肼C反应：反应：NaCl+肼肼测序技术进展测序技术进展同位素标记到荧光标记同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳平板电泳到毛细管电泳多色荧光标记多色荧光标记毛细管电泳毛细管电泳 单色荧光标记单色荧光标记平板电泳平板电泳同位素标记同位素标记平板电泳平板电泳A C G TA C GT测序图谱测序图谱T A TTG CAT TG TC TGCATTG
14、T C T一个样本，一个样本，4个反应。个反应。4个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜色的荧光。个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜色的荧光。+AmpliTaq FS enzymedCTP, dATP, dGTP, dTTPddATP (terminator)+AmpliTaq FS enzymedCTP, dATP, dGTP, dTTPddCTP+AmpliTaq FS enzymedCTP, dATP, dGTP, dTTPddGTP+AmpliTaq FS enzymedCTP, dATP, dGTP, dTTPddTTP 反应结束后反应结束后，将，将4管反应液管反应液混合，经
15、乙醇沉混合，经乙醇沉淀后上样淀后上样一个样本，一个样本，1个反应。反应中包含分别带个反应。反应中包含分别带4色荧光标记的色荧光标记的ddNTP(终止子终止子)unlabeled primertemplate DNA+AmpliTaq FSdATP, dCTP, dGTP, dTTPddCTPddATPddGTPddTTP三基因文库与三基因文库与cDNA文库文库1基因文库（基因文库（genomic library） cDNA文库（文库（complemental DNA library）2 . 文库的构建文库的构建 基因文库基因文库 基因文库是指整套由基因组基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克
16、隆载体获得的片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和。应用分子克隆之总和。应用DNA重组技术，可以将各种生物体全部重组技术，可以将各种生物体全部基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中，以基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中，以备需要时应用。好象将文献资料贮存于图书馆一样，所以称其备需要时应用。好象将文献资料贮存于图书馆一样，所以称其为为genomic library。 基因文库中应包含多少基因文库中应包含多少DNA克隆才能使任意所需要的基克隆才能使任意所需要的基因以极高的概率存在于该文库中？其计算公式如下：因以极高的概率存在于该文库中？其计算公式如下： N=ln(1-p)
17、/ln(1-f) N 基因文库所包含克隆的数目；基因文库所包含克隆的数目； p 任意所需基因存在于基因文库中的概率，要求大于任意所需基因存在于基因文库中的概率，要求大于99%； f 克隆的克隆的DNA片段大小（片段大小（bp）占基因组大小）占基因组大小(bp)的分数。的分数。cDNA文库文库 真核细胞基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外真核细胞基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经RNA转录后加工过程才使转录后加工过程才使编码序列拼接在一起。真核生物基因不能在原核生物中表达，只有将加编码序列拼
18、接在一起。真核生物基因不能在原核生物中表达，只有将加工成熟的工成熟的mRNA反转录成反转录成cDNA （complemental DNA）接上原核生物表）接上原核生物表达控制元件，才能在原核生物中表达。再有，真核生物的基因通常只有达控制元件，才能在原核生物中表达。再有，真核生物的基因通常只有一小部分进行表达，由于一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，对基因表达和有关的不稳定性，对基因表达和有关mRNA都通常通过对其都通常通过对其cDNA来进行研究的。将细胞全部来进行研究的。将细胞全部mRNA反转录成反转录成cDNA并被克隆的总和称为并被克隆的总和称为cDNA文库。文库。 RNA病毒的基因组
19、是病毒的基因组是RNA，也必须将，也必须将RNA先转录成先转录成cDNA，再建立文库。，再建立文库。 为使低丰度的为使低丰度的mRNA的的cDNA克隆存在的概率大于克隆存在的概率大于99%，cDNA文库文库应含的克隆数的计算公式如下：应含的克隆数的计算公式如下： N=ln(1-p)/ln(1-1/n) N cDNA文库所包含克隆的数目；文库所包含克隆的数目； p 低丰度低丰度cDNA存在于基因文库中的概率，要求其大于存在于基因文库中的概率，要求其大于99%； 1/n 每一种低丰度的每一种低丰度的mRNA占总占总 mRNA的分数。的分数。基因文库和基因文库和cDNA文库的建立文库的建立组织组织可
20、克隆之可克隆之DNA载体载体DNAcDNAmRNA部分或完全部分或完全酶解酶解DNADNA长度分级长度分级甲基化，双链甲基化，双链接头接头DNADNA与载体连接与载体连接引入大肠杆菌引入大肠杆菌鉴定文库的滴度和特性鉴定文库的滴度和特性扩增后供扩增后供长期储存长期储存筛选出所需筛选出所需要的克隆要的克隆噬噬菌菌体体为为载载体体的的基基因因文文库库的的构构建建四、聚合酶链式反应（四、聚合酶链式反应（PCR） 1985年年Mullis发明发明PCR（ polymerase chain reaction）快速扩增快速扩增DNA的方法。该法模仿体内的方法。该法模仿体内DNA的复制过程，首先使的复制过程，
21、首先使DNA变性，两变性，两条链解开，然后使引物模板退火，二者碱基配对，条链解开，然后使引物模板退火，二者碱基配对，DNA聚合酶随即以聚合酶随即以4种种dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补的为底物，在引物的引导下合成与模板互补的DNA新链。重复新链。重复此过程，此过程，DNA以指数方式扩增。扩增的公式为以指数方式扩增。扩增的公式为: Y=(1+X)n 式中式中 y一产量一产量; X-扩增效率扩增效率; n一循环次数。一循环次数。（2） PCR的应用的应用 （1）PCR的原理的原理 PCR技术原理示意图技术原理示意图靶序列靶序列变性和引变性和引物复姓物复姓循环循环1循环循环2循环循环3变
22、性和引变性和引物复姓物复姓链延伸链延伸Tag酶酶链延伸链延伸PCR技术的发展与应用技术的发展与应用 用于合成特异探针；用于合成特异探针； 用于用于DNA的测序；的测序； 将逆转录与将逆转录与PCR相偶联相偶联 （RT-PCR）；）； 用于基因定位诱变；用于基因定位诱变； 末知序列的末知序列的PCR扩增；扩增； 基因组序列的比较研究；基因组序列的比较研究； 用于临床诊断。用于临床诊断。 DNA芯片芯片(DNA chip)技术是采用寡核苷酸原位合成或显微打印手技术是采用寡核苷酸原位合成或显微打印手段，将数以万计的段，将数以万计的DNA探针片段有序地固化于支持物表面上，产生二探针片段有序地固化于支持
23、物表面上，产生二维维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，反应结果通过检测杂探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，反应结果通过检测杂交信号的方法（同位素法、化学荧光法、化学发光法或酶标法）显示，交信号的方法（同位素法、化学荧光法、化学发光法或酶标法）显示，再用精密的扫描仪或再用精密的扫描仪或CCD摄象技术记录，通过计算机软件分析，综合摄象技术记录，通过计算机软件分析，综合成可读的成可读的IC总信息，来实现对生物样品的快速、并行、高效地检测或诊总信息，来实现对生物样品的快速、并行、高效地检测或诊断。断。 芯片分析实际上也是传感器分析的组合。芯片阵列中的每一个单元芯片分析实际上也是传感器分析的组
24、合。芯片阵列中的每一个单元微点都是一个传感器的探头，所以传感器技术的精髓往往都被用于芯片微点都是一个传感器的探头，所以传感器技术的精髓往往都被用于芯片的发展。阵列检测可以大大提高检测效率，减少工作量，增加可比性，的发展。阵列检测可以大大提高检测效率，减少工作量，增加可比性，所以芯片技术也是传感器技术的发展。所以芯片技术也是传感器技术的发展。DNA芯片技术简介芯片技术简介DVA芯片工作示意图芯片工作示意图emissionLaser 1Laser 2computer analysisDNA clonestestreverse transcriptionLabel with fluor dyesPCR amplification purficationhybridize target to microarrayrobotic printingreference