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1、菘蓝叶片的离体培养及植株再生（完整版）实用资料(可以直接使用，可编辑 完整版实用资料，欢迎下载）菘蓝叶片的离体培养及植株再生农学院 姓名： 学号 指导教师：摘要：为研究不同激素组合对菘蓝离体叶片的不定芽诱导及生根影响，以菘蓝叶片为外植体在不同激素组合的MS培养基上培养菘蓝离体叶片，并观察菘蓝的生长情况和统计菘蓝的丛生芽、愈伤组织诱导率、存活率和生根率等。结果表明，2，4-D和KT的激素组合不能诱导出不定芽，而NAA和6-BA的激素组合可诱导出不定芽，且以6-BA2.0mg/L +NAA0.5mg/L的激素配比为最适。2，4-D虽有利于愈伤组织的形成，但对芽的分化有强烈的抑制作用,而适当比例的N
2、AA和6-BA促进芽的分化。IBA和NAA对菘蓝的生根均有一定的促进作用。关键词：菘蓝 离体培养 激素组合 丛生芽 生根菘蓝（Isatis indigotica Fortune）是十字花科菘蓝属有重要开发前景的药用植物1。根（板蓝根）、叶（大青叶）均供药用，有清热解毒、凉血消斑、利咽止痛的功效；叶还可提取蓝色染料；种子榨油供工业用2。菘蓝是2年生草本，主根深长，肉质肥厚。茎直立，上部多分枝。复总状花序，花黄色，角果长圆形，扁平3-4。菘蓝主要分布于安徽、河北、江苏、河南、陕西、四川、山西、山东等地，主产于河北安国，江苏南通，安徽太和、怀远、界首、毫州、涡阳等地5。根据程春松等人6的综述可知菘蓝
3、在育种方面取得了较大的进展，包括单倍体育种、多倍体育种、转基因育种等。菘蓝的药用价值被广泛开发与利用，是常用的大宗中药材之一，市场需求量巨大。菘蓝不仅以根为主要原料制成饮片人市，其茎叶也是很好的药用蔬菜，其营养丰富，吃法多样，可炒，可腌，可煮汤。菘蓝一年四季均可栽培、生长，茎叶产量高，合理利用并不影响根的产量，并且还有防病、治病、保健功能，也符合人们回归自然的生活理念，其市场价较高，对其进行综合开发与利用前景十分广阔7。本实验主要研究不同激素组合对菘蓝叶片离体培养及植株再生的影响，以寻求对菘蓝叶片离体培养及植株再生的最佳激素组合，以期为菘蓝叶片的离体培养及植株再生提供参考。1. 材料与方法1.
4、1 供试材料 菘蓝幼叶（由四川农业大学农学院植物生理系提供）1.2 试验方法1.2.1 培养基设计 选用MS培养基（见表1）作为基本培养基，再按目的加入一定浓度的不同激素或其他成分，充分混匀后加入蒸馏水溶化的15g蔗糖和已溶化的琼脂2.5g，最后用蒸馏水定容至500ml，调节PH至5.8。PH调好后将培养基及时分装于培养容器中，分装时要尽量避免培养基污染瓶口。分装后，塞上棉塞或用无菌培养容器封口膜外加一层牛皮纸封口。培养基采用高温高压湿热灭菌，在高压锅内于0.1MPa（121）压力下灭菌20min。灭菌后将其烘干放于接种室备用。丛生芽诱导培养基见表2，继代增殖适用丛生芽诱导2号培养基，生根培养
5、基见表3。表1 配制500mlMS培养基各母液的吸取量母液类型大量元素微量元素微量元素铁盐有机物甘氨酸肌醇吸取量50ml5ml0.5ml5ml0.5ml1ml50mg 表2菘蓝丛生芽诱导培养基培养基序号6-BA(mgL-1) NAA(mgL-1)2,4-D(mgL-1)KT (mgL-1)12.00.10022.00.50032.01.0004560000001.02.04.00.50.50.5 表3生根培养基培养基序号IBA(mgL-1)NAA(mgL-1)活性炭（g/L）10.102200.121.2.2 材料处理 剪取板蓝根幼叶3-5片，包于纱布内，置烧杯中自来水冲洗30-60分钟。将冲
6、洗后的材料放入超净工作台内的无菌瓶中，打开紫外灯灭菌30min。之后用75%的酒精消毒10S，无菌水清洗3次，0.1%HgCl处理10min，再用无菌水清洗4次，备用。1.2.3 接种 将菘蓝的外植体切成1cm2的小块，接入灭菌后的培养基中（注明日期），放入培养室内培养观察。1.2.4 培养条件 温度232，光照时间14h/d，光照强度1500-2000Lx（注：第一周进行暗培养）。1.2.5 数据统计叶片接种14 d后统计菘蓝的存活数目，计算存活率，观察叶片形态变化。生根培养14d后统计生根率及不定根的数目。存活率()=存活的外植体数/总外植体数100生根率()=生根的外植体数/接种外植体数
7、1002. 结果与分析2.1 不同激素组合对菘蓝诱导培养的影响菘蓝离体叶片经过两周培养后，在添加不同的激素组合的培养上，产生了不同的效果。从表4可以看出，菘蓝叶片在添加了NAA和6-BA的培养基上（1、2、3号）都能分化出不定芽，但在添加了2，4-D和KT的培养基上（4、5、6号）都没有不定芽产生。这主要是因为2，4-D一般有利于愈伤组织的形成，但对芽的分化有强烈的抑制作用8。其中以3、6号培养基存活率最高，较1、2、4、5号培养基分别高出5.00%，5.00%，9.37%和16.67%，5号培养基存活率最低。2号培养基污染最为严重，但出芽最多，明显优于其它培养基，说明6-BA2.0mg/L+
8、NAA0.5mg/L的激素组合是诱导菘蓝叶片产生丛生芽的最适培养基。表4暗培养14天后不同培养基组合启动效果序号接种数（个）污染数（支）污染率%存活数(个)存活率%叶片形态变化真菌细菌真菌细菌14200004095.23卷曲，膨大，变厚，出芽少242214.72.34095.23卷曲，膨大，变厚，出芽多335000035100.00卷曲，膨大，变厚，出芽少43500003291.43卷曲，膨大，变厚，边缘变黄54200003685.71卷曲，膨大，变厚，边缘变黄614000014100.00略卷曲变厚2.2 菘蓝的继代增殖由表5可知，菘蓝的继代增殖培养存活率较低为72.92%，其中干枯率较大为
9、16.67%，污染率为10.42%。由于继代增殖之前，2号培养基长势甚好，而继代增殖之后，死亡率上升，说明是操作不当而引起的。表5 菘蓝继代增殖培养结果接种数（瓶）死亡数（瓶）存活率%污染干枯485872.922.3 不同激素组合对菘蓝生根诱导的影响由表6可知，添加了IBA的培养基存活率(达100%)及生根率（80%）都较高；添加了NAA的培养基存活率极低为17%，且并未诱导出生根，导致无法确定NAA对菘蓝生根诱导的影响。说明操作存在严重错误。表6不同浓度的激素配比对诱导菘蓝幼叶生根的影响培养基序号接种数/瓶存活数/瓶存活率生根数/瓶生根率（%）155100%480%26117%00%3.1
10、结论由该实验可知，在添加了2，4-D和KT的培养基上不能诱导出不定芽，而在添加了NAA和6-BA的培养基上可诱导出不定芽，且以6-BA2.0mg/L +NAA0.5mg/L的激素组合为最适。说明2，4-D和KT的激素组合不能诱导出不定芽，而NAA和6-BA的激素组合可诱导出不定芽。添加了IBA的培养基虽然生根率较高，但由于添加了NAA的培养基多数死亡，无法比较IBA与NAA对菘蓝生根诱导的影响。3.2讨论2，4-D和KT的激素组合不能诱导出不定芽，而NAA和6-BA的激素组合可诱导出不定芽，这与彭丽萍和胡冬南等人的研究基本一致9-10。这主要是因为2，4-D一般有利于愈伤组织的形成，但对芽的分
11、化有强烈的抑制作用,而适当比例的NAA和6-BA促进芽的分化。虽然本次试验未能探讨出IBA与NAA对菘蓝生根诱导的影响，但通过多数前人（胡冬南、戴云新11、张晓旭12等）的研究可以发出现：IBA和NAA均为生长素类物质，对菘蓝的生根均有一定的促进作用，IBA对植物发根有很好的效应，NAA诱导形成不定根，但高浓度抑制生根，且IBA对菘蓝生根的促进作用不如NAA，影响生根的因素主要取决于生长素的种类、浓度及其组合。参考文献：1 崔树玉.薛原.杨建莉.板蓝根研究进展J.中草药,2001,32(7):670671.2 周太炎.中国植物志第三十三卷M.科学出版社.1987.10：65.3 宋延杰.药用植
12、物实用种植技术M.金盾出版社.2003.1：271.4 郭巧生.药用植物栽培学M.高等教育出版社.2004.8:284.5 吕晔，陈宝儿.丹参 太子参 半夏 北沙参 板蓝根 贝母 元胡 白芷 玄参 麦冬 薏苡M.江苏科学技术出版社.2001.10：122.6 程春松，彭代银，黄和平等.菘蓝育种研究现状及现代生物技术的应用J.安徽中医学院学报,2021.31(4).7 太光聪，李友，朱继富.菘蓝的药用价值及开发利用J.现代农业科技,2021(9):134-136.8 陈秋芳，黄群策，秦广雍.菘蓝叶片离体培养与试管无性系的建立J.河南农业科学.2007.（12）:98-100.9 彭丽萍，张远兵，
13、汪露润.安徽科技学院学报，2007，21（4）：14-17. 10 胡冬南，柯国庆，王恒芬等.安徽农业科学，2021，37（17）：78687869.）11 戴云新，张健，李敏等NAA和IBA对非洲菊组培苗生根的影响J安徽农业科学2021，37（19）：8845-8847.12 张晓旭 激素对菘蓝器官分化及愈伤组织诱导的影响J.现代中药研究与实践. 2021,128(5): 13-15.简报第卷第期卑月讲学屯矗一氧化氮对盐胁迫下小麦叶片氧化损伤的保护效应阮海华沈文飚叶茂炳徐朗莱南京农业大学理学院南京联系：）姗日摘要从叶绿素、和质膜相对透性个方面的受化证实了和的一氧化氪（，）供体硝普铀（，）分别
14、对和胁迫下的小麦（叶片氧化损伤有明显的缓解燕应能够显著诱导盐胁迫下小麦叶片和活力的上升，延缇；一和的积累，同时促进抗氧化物质脯氧酸的含量上升，从而减轻盐胁迫下小麦叶片的氧化损伤关键词小麦盐胁迫一氧化氮氧化损伤保护我国有盐荒地和。盐渍化耕地约占可耕地面积的盐害是目前制约作物产量的主要逆境因素之一，因此提高植物的耐盐性是植物抗逆研究的重要课题已知盐逆境胁迫条件下植物细胞叶绿体和线粒体电子传递中泄露的电子增加活性氧（，）大量产生，并导致细胞内的氧化损伤，引起叶绿素降解、膜结构损伤、蛋白质变性、核酸断裂，甚至细胞死、【！一氧化氮（，）是生物体中一种重要的氧化还原信号分子和毒性分子，也是一种活性氮（”，
15、）在植物体内主要通过一氧化氮合酶（）和硝酸还原酶（，）催化台成以动物为材料的研究表明，对生物体的作用具有双重性一方面，低浓度能迅速清除超氧阴离子（）和脂质自由基（），阻断包括脂质过氧化在内的参与的各种伤害效应，而且能诱导抗氧化酶基因的表达，从而具有保护作用”“；另一方面，高浓度与：相互作用生成大量的过氧亚硝酸阴离子（一），后者质子化再形成具有强氧化性的过氧亚硝酸（），破坏生物大分子的结构与功能，最终具有生物毒性等人【提出对植物体也同样具有双重性，且与植物细胞的生理条件和浓度有关，并进一步证实了外源能缓解马铃薯因喷施敌草快（）和百草枯（）两种除草剂而引起的介导的氧化伤害“最近等人”还发现能够通过
16、诱导小麦的气孔关闭来提高其抗旱性本文报道了外源对盐胁迫下小麦叶片氧化损伤的保护作用，并初步研究了相关机理材料与方法（）材料培养与处理小麦（）品种为扬麦种子经消毒，浸种，催芽挑选露白一致的种子用溶液进行水培，自然光照，至小麦幼苗长至两叶一心期进行处理处理方式如下：溶液：含的溶液：含】及的溶液：含的溶液；含的溶液：含及的溶液；含的溶液每个处理设个重复，每天更换次处理液在处理后的第，天时取叶片进行相关测定（）测定方法叶绿素、和质膜相对透性的测定分别参照等人、许长成等人和刘宁等人”的方法和活力测定：叶片按：（质量体积比）加入酶提取液（的磷酸缓冲液含的），冰浴研磨匀浆，冷冻离心（，），上清液即为粗酶液活
17、力测定参照等人”的方法并加以改进，的反应体系中吉磷酸缓冲液（）和的，最后加入适量的酶液启动反应，反应开始后迅速测定“。值的变化活性测定按照等人【的光化还原法，以抑制氮蓝四唑（）光化还原的酶量为一个酶活力单位（）含量的测定：参照刘俊等人【“的丙万方数据褂掌丘扛第卷第期年，简酮莘取浊测定活力的测定：叶片按：（质量体积比）的比例加人酶提取液（的硼酸缓冲液，含的亚硫酸氢钠），冰浴研瞎匀浆冷冻离心【。）活力测定咀！等人“的方法稍加政进，反应体系以愈创木酚（平口过氧化氢（为底物，适量酶液启动反应测定吸光值的升：一产生速率测定：参照王爱国等人“的方法叶片加磷酸缓冲液研磨匀浆，冷冻离，（）上清液加入羟胺，气保
18、温后再加入对氨基苯磺酸和一萘酚，屯保温，正丁醇萃取，测定光吸收脯氨酸及蛋白质含量测定参照张殿忠等人“和【的方法结果与分析对盐胁迫下小麦叶片氧化损伤的保护作用叶绿素含量的变化如图（）所示结果表明，在正常生长条件下的小麦叶片叶绿素含量变化不大，熬圈对盐胁迫下小麦叶片叶绿素）和（）含量变化的影响。见材料与方法）和的供体也没自明显影响叶绿索的含量在盐逆境条件下随着不同浓度处理时间的延长，小志叶片叶绿素含量均表现逐渐下降：而处理能够明显延缓盐胁迫下叶绿素的降解，例如和的供体处理时分别将对应盐胁迫处理下的叶绿索含量提高了和与对照相比含量随盐胁迫强度的升高和处理时间的延长而上升，其中在胁迫第天时处理的小麦叶
19、片含量比处理增加了同时和处理对含量变化的影响不大但明显分别缓解了盐胁迫下小麦片的积累（图），表明可以减轻由于盐胁迫而造成的膜脂过氧化作用质膜相对透性的变化（图）基本上也与的结果相一致正常生长条件和不同浓度处理对质膜相对透性的影响也不大而盐胁迫明显提高了质膜相对透性，例如和处理第天时使小麦叶片质膜相对透性从升到和，到第天时，质膜相对透性又增加到和：而相应的和处理！和时，则分别将质膜相对透性降低至和以及和说明处理后使小麦叶片细胞膜的离子渗漏减少，进一步证明了对细胞膜结构的保护作用图对盐胁迫下小麦叶片质膜相对透性变化的影响一吣材料与方法）对盐胁迫下小麦叶片活性氧清除能力的调节；一产生速率的测定结果表
20、明，正常爿长条件的小麦叶片的；一产生速率变化很小，不同浓度处理则略为降低了：的产生相反，盐胁迫处理明莲掣蛔矗掣型蜓如如”万方数据简报第卷第期年月讲学屯扛显提高了：一的产生速率，并在处理的第天达到最大而和则显著降低了盐胁迫处理下：的产生，例如处理时的：一产生速率分别降低了和：以后随着处理时间的延长，处理株：产生速率仍低于相对应的盐胁迫处理（图）图（的结果表明，和胁迫下小麦叶片的变化是不同的胁迫使小麦叶片活力上升，而则导致活力的迅速下降经处理后均明显提高了两种盐胁迫下的活力，其中在处理第天时和分别将的活力提高了和另一方面，和也能够略为提高正常生长条件下小麦叶片的的活力，例如处理时活力分别增加了和：
21、含量的测定结果见图（）在正常生长条件下，和对小麦叶片的影响相对较小而不同盐浓度处理舌：的含量随着胁图对盐胁迫下小麦叶片：产生速率（）和活力（）变化的影响见材料与方法迫时间和强度的增加而增加，处理则明湿缓解丁！的累积其中胁迫处理时含量从处理开始的升到；而用】处理则将！的含量下降到；同样处理将胁迫下的！含量降低了弘盱托蜀只姆天数王打图对盐胁迫下小麦叶片含量，活力（）和活力（）变化的影响见村料与力；圭（卧擅。酊廛。酋，曩擅一矗：霜单如”如”；万方数据讲学屯盘第卷第期年月简报图的结果还表明，正常生长条件下的小麦叶片町和活力均有一定程度的上升】和分别处理内活力呈下降趋势以后又开始恢复：而不同浓度的对小麦
22、叶片活力的影响则相对不大另一方面，在小麦盐胁迫过程中，和活力的变化也是不同的活力在两种盐浓度胁迫条件下均随时间的延长呈下降趋势，处理则明显提高了的活力（图（），例如处理胁迫下的小麦叶片时，将其活力提高了：而处理使浓度下的活力从卜升到】帅。叫圈）的结果则表明从处理开始到第天时两种盐浓度的活力均略为下降，以后又有所上升，而处理对其也无明显影响上述结果表明，处理明显提高盐胁迫下：的清除能力主要是通过对活力的调节来实现的对盐胁迫下小麦叶片脯氨酸含量的影响脯氨酸是一种重要的渗透调节物和抗氧化物质，其含量的变化如表所示结果发现正常生长条件的小麦叶片脯氨酸含量基本上呈平稳状态另一方面，小麦叶片的脯氨酸含量在
23、盐胁迫下的累积，随胁迫强度的增加和处理时间的延长而加剧，而能够起进一步的促进作用例如和处理分别将和胁迫时的脯氨酸含量提高了和；而在正常的生长条件下，和略为提高脯氮酸含量，分别为和讨论是一种重要的供体，等人”证明的约能产生的我们从叶绿素、和质膜相对透性个方面的变化，证实了外琢低浓度对小麦盐胁迫具有明显的缓解作用例如和的处理明显缓解了盐胁迫下小麦叶片的叶绿素降解，降低了，含量累积及质膜相对透性的上升（图和）蒋明义等人”“已经证实渗透胁迫下叶绿素的降解主要与活性氧的氧化损伤有关水分胁迫下活性氧的大量产生还会加剧的积累而质膜相对透性的增加则与脂质过氧化作用呈显著正相关”因此推测低浓度对小麦叶片盐胁迫氧
24、化损伤的缓解作用可能与其对活性氧代谢的影响有关我们发现在正常生长条件下略为降低：的产生速率，而盐胁迫下则明显降低了小麦叶片的：的生成，诱导话力的上升，而且：含量的变化也基本与活力的变化相对应（图述结果同以动物为材料的研究也是基本相一致的”等人推测可通过直接与血红素铁结合形成铁离子一亚硝酰基复合物来可逆抑制烟草叶片的活力；我们也发现在正常生长条件下，处理后小麦叶片活力先呈下降趋势，以后又开始恢复上述研究结果的差异可能与不同植物材料和分布于不同部位的同工酶对敏感性差异有关，也不排除作为信号分子诱导小麦叶片中某些同工酶基因在一定条件下表达的可能性进一步的研究还表明，盐胁迫下明显延缓小麦叶片：的累积主
25、要与其可以提高的活力有关（网）已经知道：一与，及形成复合物或与直接形成复合物和而这些的钝化形式可以抑制的活力因此延缓盐胁迫下小麦叶片：一的积累对于维持较高的活力也是有利的（图）是导致叶绿素降解和脂质过氧化的主要因素，而：和，可以通过和反应导致的产生，推测通过延缓盐胁迫下小麦叶片和：的积累来降低的生成表对盐胁迫下小麦叶片晡氨酸（腱“）积累的影响”表中数值为浓重复的平均值万方数据简报第卷第期年月讲譬血矗从向缓解小麦叶片盐胁迫的氧化损伤；此外，对植物细胞铁离子水平的调节也会影响反应盐胁迫下植物体内大量积累的脯氨酸除作为渗透调节物质外还包括在清除、提高抗氧化能力、稳定大分子结构、降低细胞酸性以及解除氨
26、毒等方面起重要作用宗会等人报道了晡氨酸参与缓解稻苗干旱、盐胁迫的过程与“信号系统有关，而信号转导途径也涉及了。信使系统口我们的实验结果还表明，对小麦盐聃迫氧化损伤所具有的缓解作用也可能与其对脯氨酸的调节有关（表）由于是植物体内正常代谢的副产物，如果能从调节体内和等合成酶的活性人手适当提高内源的水平，对于有救缓解盐胁迫的氧化伤害将更具有实践意义参考文献王宝山邹琦胁迫对高粱根、叶鞘和叶片液泡膜酶和焦磷酸酶括性的髟响植物生理学报，（）：，：，）：】，：（）：】一，；（）：（）：？，（，、：【，（）许最成，赵世杰邹琦植物膜脂过氧化水平硫代巴比妥酸铡定方法中的十扰因素植物理学通讯刘宁高乇蘼良彩霞渗透胁迫
27、下多北黑釜草叶勺吐辑化物酶恬性和脯氨酸台量【砭质膜相对透生的变化植物理学通讯、（】：】，、：刘俊吕波豫朗莱一种改进的铡定叶片中？禽量的方往生物化学与生物物岬研究进展，（：）、（）：王爱国，罗广华植物的超氧物自由基与羟特厦直的定量关系植物生理学通讯（张殿忠饪沛洪赵会贤测定小麦叶片游离晡氡酸的方法植物生理半通讯（】、，（）：】、）。蒋明义，扬文英徐汀渗透轿迫下水稻幼旧中叶绿素降解的插性氧损伤作用植物学报，蒋明殳水丹胁迫下植物体内物学报，】佃（）：，的产生与细胞的皇【化损伤植羹明丁忠诫，贺于义等盐胁迫下太壶和小麦叶叶脂质过氧化伤害与趋微结构变化的黑系植物学，、，、一【，：（）宗会刘蛾娥，郭振等十牛、
28、盐胁迫。【、手对韬苗脯氨酸累积的影响作物学报（？、，。、：（收稿收修改稿万方数据 一氧化氮对盐胁迫下小麦叶片氧化损伤的保护效应 阮海华， 沈文飚， 叶茂炳， 徐朗莱作者单位：南京农业大学理学院,刊名：科学通报英文刊名： CHINESE SCIENCE BULLETIN年，卷(期：2001,46(23被引用次数：144次参考文献(28条1. 王宝山;邹琦 NaCl胁迫对高粱根、叶鞘和叶片液泡膜ATP酶和焦磷酸酶活性的影响期刊论文-植物生理学报2000(032. Scandalios J G Oxygen stress and superoxide dismutases 1993(013. Wendehenne D;Pugin A;Klessig D F Nitric oxide: comparative synthesis and signaling in animal andplant cells 2001(044. Yamasaki H;Shaniohi S Y;Takahashi S An alternative pathway for nitric oxide production in plant:new feature of an old enzym