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1、微生物标本采集技术微生物标本采集技术-临床微生物临床微生物 -环境微生物环境微生物 感染办感染办 谢少清谢少清 临床微生物标本采集技术临床微生物标本采集技术l正确的微生物标本采集和运送，是正确的微生物标本采集和运送，是准确的病原学诊断的前提准确的病原学诊断的前提基本原则1.及时采集微生物标本作病原学检查及时采集微生物标本作病原学检查2.在抗菌药物使用前采集标本在抗菌药物使用前采集标本3.采样时严格执行无菌操作采样时严格执行无菌操作4.采样后立即送检采样后立即送检5.5.棉拭子标本宜用运送培养基棉拭子标本宜用运送培养基7.标本容器须灭菌处理，但不得使用消毒剂。标本容器须灭菌处理，但不得使用消毒剂
2、。8.8.送检标本应注明来源和检验目的送检标本应注明来源和检验目的9.9.混有正常菌群的标本，不可置肉汤培养 痰标本采集痰标本采集关于咳痰标本l在抗生素应用前采集痰标本在抗生素应用前采集痰标本;l标本采集后标本采集后12h内必须立即进行实验室处理；内必须立即进行实验室处理；l咳痰标本应用最早且广泛，但也是最受争议的标本咳痰标本应用最早且广泛，但也是最受争议的标本;l采集标本过程中要有专业的医务人员指导采集标本过程中要有专业的医务人员指导;病原体种类繁多而复杂使下呼吸道感染病原诊断成为难题细菌（包括放线菌与奴卡菌，厌氧菌与分枝杆菌）细菌（包括放线菌与奴卡菌，厌氧菌与分枝杆菌）真菌（包括肺孢子菌）
3、真菌（包括肺孢子菌）病毒病毒支原体、衣原体与立克次体支原体、衣原体与立克次体原虫原虫寄生虫寄生虫2023/5/26Dr.HU Bijie10几种下呼吸道直接采集的标本l经气管穿刺吸引经气管穿刺吸引transtracheal aspiration,TTA l经胸壁针刺吸引经胸壁针刺吸引transthoracic needle aspiration,TNA l经支气管镜采样经支气管镜采样 支气管肺泡灌洗支气管肺泡灌洗bronchoalveolar lavage,BAL经支气管镜直接吸引经支气管镜直接吸引防污染样本毛刷防污染样本毛刷protective specimen brush,PSBl开胸肺活
4、检开胸肺活检open-lung biopsy，OLBl经人工气道吸引分泌物经人工气道吸引分泌物 endotracheal aspirates，ETA痰标本采集痰标本采集-吸痰吸痰吸痰：吸痰：无法咳痰或不合作者、人工气道、人工气道者，戴好无菌手套，无菌集痰器分别连接吸引器和无菌吸痰管。按吸痰法将痰吸入无菌集痰器内，加盖送检。经支气管镜直接吸引经支气管镜直接吸引:注意严格无菌操作尿标本正确采集尿标本正确采集-清洁中段尿标本清洁中段尿标本应保证尿液在膀胱内至少停留4h以上。最好留取早晨清洁中段尿标本，方法：患者睡前少饮水，清晨起床后先用肥皂水清洗会阴部，女性应用手分开大阴唇，男性应翻上包皮，仔细清洗
5、，再用清水冲洗尿道口周围；开始排尿，将前段尿排出，弃去，不要停顿，直接将中段尿约1020ml直接排入专用的无菌容器中，立即送检。容器内是无菌的，所以打开容器盖后，应拿在手中，不要随意乱放。记录留取标本的时间，保证在留取标本后1小时内送至检验科。血培养标本血培养标本 采集与运送采集与运送血培养标本采集血培养标本采集1.手清洁：无明显污染使用速干乙醇消毒液洗手手清洁：无明显污染使用速干乙醇消毒液洗手.2.血培养瓶口消毒：血培养瓶口消毒：75%乙醇消毒一遍，待干乙醇消毒一遍，待干60 s.3.静脉穿刺消毒：推荐用三步法静脉穿刺消毒：推荐用三步法(1).用用75乙醇清毒采集部位乙醇清毒采集部位(2).
6、用用2%碘酒从穿刺点向外画圈消毒，至消毒区域直径碘酒从穿刺点向外画圈消毒，至消毒区域直径达达3cm以上，涂擦穿刺皮肤以上，涂擦穿刺皮肤2遍，待干。遍，待干。（3）75%酒精脱碘：用酒精脱碘：用75%酒精由内向外方向涂抹去碘酒精由内向外方向涂抹去碘酒液酒液,待酒精挥发干燥后采血待酒精挥发干燥后采血。o2009年美国感染性疾病学会推荐的经皮抽血局部皮肤消毒或导管接口用碘酊或酒精或酒精氯已定(0.5%),不建议使用聚维酮碘.操作注意事项操作注意事项（1）从静脉采血，不建议从动脉采血，（2）用注射器无菌穿刺取血后,勿换针头(如果行第二次穿刺,应换针头)直接注入消毒后的血培养瓶。（3）血抽到培养瓶后,轻
7、轻颠倒混匀以防血液凝固。立即立即送检送检,切勿冷藏！切勿冷藏！（4）多次采血应在不同部位的血管穿刺以排除皮肤菌丛污染的可能。除非无法作静脉穿刺取血，否则不应从留置导管内取血。（5）抽血前应将标签贴于血培养瓶颈上，标签内容包括病人基本信息、采血时间、采血部位。注意不要把标签贴在培养瓶条形码上，否则仪器无法识别。血培养次数和采血时间血培养次数和采血时间-1l采血培养采血培养应该尽量在使用抗菌尽量在使用抗菌药之前之前进行行,在在患者患者发热期期间越早越好，以越早越好，以发热高峰前高峰前1h内或内或病人寒病人寒战和和发热开始开始时采集采集为宜。宜。在在10分分钟内内于不同部位采集外周血于不同部位采集外
8、周血23 份培养份培养(有助于判有助于判断是断是污染染还是感染，提高是感染，提高检出阳性率出阳性率)l注意注意报阳性阳性时间，阳性瓶数，阳性瓶数.。l在采取血培养后的在采取血培养后的2-5天内，不需要再重复采天内，不需要再重复采取血培养，因取血培养，因为进行治行治疗后的后的2-5天血液中的天血液中的感染感染细菌不会菌不会马上消失。上消失。对可疑中心静脉导管相关血流感染（对可疑中心静脉导管相关血流感染（CR-BSI)l保留导管保留导管l外周静脉血1份，中心静脉导管血1份,不用弃去导管起始部分的血液.l拔除导管拔除导管:l2个外周静脉血、导管尖端5cm.(在进行中心静脉导管血和在进行中心静脉导管血
9、和 周围静脉血培养时应记录报阳时间周围静脉血培养时应记录报阳时间)导管尖段标本的采集导管尖段标本的采集血管内导管尖段标本的采集、送检程序用75%酒精清洁导管周围皮肤；无菌操作移动导管，剪取尖端末端5cm，直接置入无菌试管内或直接置入血平板内；立即送检（不超过15min），防止干燥。如因怀疑CRBSI移除皮下埋置式静脉输液港,将该输液港内容物及导管尖端做定量培养。如何正确运送标本l运送培养基温度运送培养基温度应适当适当l原原则：保持：保持细菌活力菌活力血培养、脑脊液标本：应及时送检，不能及时送检的标本应置温箱或室温中，切不能放入冰箱中保存(除病毒、霉菌、分支杆菌培养样本置4)痰、尿等标本：如不能
10、及时送检可置冰箱，以抑制杂菌生长，但时间不应超过6h。血培养瓶验收血培养瓶验收:(1)检查培养瓶是否有渗漏、破裂或明显污染。检查培养瓶是否有渗漏、破裂或明显污染。(2)检查瓶子上的标签与申请单是否相符。检查瓶子上的标签与申请单是否相符。(3)检查血液标本是否适量，血液是否凝固。检查血液标本是否适量，血液是否凝固。各类标本储存的环境 标本采取后应该立即送检标本采取后应该立即送检,如不能立即送检如不能立即送检,储储存的环境的要求存的环境的要求l储存存环境境标本来源本来源4冰箱冰箱-痰、尿液、痰、尿液、粪便、便、活活检组织、气管冲洗物、气管冲洗物、导尿管、心包尿管、心包积液、液、脓和和伤口分泌物等口
11、分泌物等l室温（室温（25）-血液培养、血液培养、脑脊液、泌尿生殖脊液、泌尿生殖道、眼、耳、鼻、喉、血管道、眼、耳、鼻、喉、血管导管尖、体液管尖、体液、厌氧菌培养氧菌培养标本本2023/5/26Dr.HU Bijie28皮肤组织标本（损伤、脓肿、烧伤、渗出液）l标本的选择更大程度上依赖于感染的程度和性质而不是可疑的病标本的选择更大程度上依赖于感染的程度和性质而不是可疑的病原体。原体。l对大多数开放伤口，采集前应先去除表面菌群。对大多数开放伤口，采集前应先去除表面菌群。l除非有渗出物，干燥、结痂伤口一般不做培养。除非有渗出物，干燥、结痂伤口一般不做培养。l闭合脓肿应取渗出物和脓肿壁标本。闭合脓肿
12、应取渗出物和脓肿壁标本。l开放脓肿处理同开放伤口。开放脓肿处理同开放伤口。l烧伤伤口应在广泛清洗和清创术后采集培养。建议取活检标本，烧伤伤口应在广泛清洗和清创术后采集培养。建议取活检标本，伤口表面定量培养不一定有意义。伤口表面定量培养不一定有意义。l代表性的标本应采自病灶活动区域或基底部有而不仅仅是脓液。代表性的标本应采自病灶活动区域或基底部有而不仅仅是脓液。29方法l未破裂脓肿：未破裂脓肿：不能用拭子。消毒覆于脓肿表面的皮肤，用注射器不能用拭子。消毒覆于脓肿表面的皮肤，用注射器将脓肿内容物吸出。然后切开脓肿、引流，取部分脓肿壁送检。将脓肿内容物吸出。然后切开脓肿、引流，取部分脓肿壁送检。送检
13、时，标本都置于厌氧培养基中。送检时，标本都置于厌氧培养基中。l开放病灶和脓肿：开放病灶和脓肿：用无菌盐水擦去表面渗出物，用拭子深入溃疡用无菌盐水擦去表面渗出物，用拭子深入溃疡基底部或边缘部，采集两个拭子，分别做培养和革兰染色，也可基底部或边缘部，采集两个拭子，分别做培养和革兰染色，也可对渗出物做需氧培养。开放病灶不能做厌氧培养。对渗出物做需氧培养。开放病灶不能做厌氧培养。l烧伤伤口：烧伤伤口：清创，出现渗出液后以拭子用力采集，仅作需氧培养。清创，出现渗出液后以拭子用力采集，仅作需氧培养。也可送检活检组织标本。也可送检活检组织标本。l脓疱或水疱：脓疱或水疱：酒精消毒使之干燥，对于患儿用酒精消毒使
14、之干燥，对于患儿用2323号针头挑破脓疱，号针头挑破脓疱，拭子采集脓疱液和基底部标本。拭子采集脓疱液和基底部标本。粪便标本采集粪便标本采集自然排便后，取有脓血、粘液、组织碎片部分自然排便后，取有脓血、粘液、组织碎片部分 粪便粪便13g。液体粪便则取絮状物，一般取液体粪便则取絮状物，一般取13ml，直接装入粪便容，直接装入粪便容器或保存液或运送培养基中送检。器或保存液或运送培养基中送检。直肠拭子法直肠拭子法 将肛门周围洗净，然后用一根浸过无菌生理盐水的棉拭子，插入肛门约mm-2cm处，轻轻旋转，使之与直肠黏膜表面接触，然后取出置于无菌试管中立刻送至微生物室本法只适用于排便困难患者或婴幼儿，本法只
15、适用于排便困难患者或婴幼儿，不推荐使用拭子做常规性病原菌培养。不推荐使用拭子做常规性病原菌培养。环境环境采样有关采样有关采样l采样方法：采样是决定结果的第一要素！l采样时间：查问题时以提高检出率为原则。l培养基：质量问题影响检出率！关注！l检测条件：注意实验室污染。l培养条件：注意培养温度、培养时间。l结果报告：不能零报，报方法最小检出单位。l应该让懂院感知识的检验人员来采样会更好！l阳性检出率越高说明检测水平越高美国的理念美国的理念l1970年以前，美国的医院定期对空气和环境表面（如，地面、墙壁、台面）进行培养。到了 1970年，CDC 和美国医院协会（AHA）主张停止对环境的常规培养，因为
16、医院感染发生率与空气或环境表面中总的微生物污染水平不相关，且环境表面或空气中微生物含量的允许水平也没有有意义的标准。1970-1975 年，美国有 25%的医院减少了这种常规的环境培养工作一个已经持续的趋势。什么情况下要求进行环境什么情况下要求进行环境采样l四种状况下要求进行环境采样采样一是一是当环境中的宿主或媒介物被认为在疾病传播中有流行病学意义时，提供疾病或感染暴发的依据。第二种情况是在研究过程中进行适当的环境采样采样。第三种情况是为了监测潜在的危险环境条件，确认有害的化学或生物因素的存在，并验证危险因素的成功消除。第四种情况是为了质量保证（QA）而采样采样，以评估改变感染控制措施取得的效
17、果或是确保设施或系统按照规范和预期结果执行。物体表面采样物体表面采样 物体表面细菌总数的检测是评价l被污染程度l消毒效果 主要依据物体表面采样物体表面采样-涂抹法涂抹法l涂抹法：将5 cm5 cm的标准灭菌规格板，放在被检测物品表面，用浸有无菌生理盐水的棉拭子在规格板内来回均匀涂抹整个方格，并随之转动棉拭子，剪去手接触部分后，将棉拭子放入盛有10 ml生理盐水的试管中，充分振摇1min，作适量稀释后，接种于普通营养琼脂平板上进行计数，然后根据平板上菌落数得出物品表面每平方厘米的细菌数物体表面采样物体表面采样-斑贴法斑贴法l斑贴法:按无菌操作方法将5 cm5 cm的无菌滤纸用灭菌生理盐水浸湿，均
18、匀贴附于物体表面，1 min取下放人盛有25 ml灭菌生理盐水试管中，充分振摇1 min，作适量稀释后，接种于普通营养琼脂平板上作菌落计数，同样得出物品表面每平方厘米的细菌数。l压印法压印法压印法 在检验时，只需在现场打开皿盖，将略突出于培养皿口平面的培养基轻轻往被检物品表面一按，盖上皿盖，在培养箱内培养一定时间后计菌落数。此数值即为10cm2被检物品表面上的细菌数，无需任何换算即可同消毒标准和公共场所卫生标准加以比较。十分快捷、方便，甚至没有无菌室和专门检验人员也可顺利完成操作。是目前最理想的用于公共场所物品表面细菌污染程度监测的方法。不规则物品如何采样?消毒物品表面的监测：l1 1、采样时
19、间：消毒处理后、采样时间：消毒处理后4 4小时内进行采样。小时内进行采样。l2 2采样面积：被采面积采样面积：被采面积100100cmcm2 2 ，取全部表，取全部表l 面；面；100 100 cmcm2 2，取，取100100cmcm2 2 。l3 3、采样方法：、采样方法：l 用用5CM*5CM5CM*5CM的标准灭菌规格板放在被检消毒物品表面，用含相的标准灭菌规格板放在被检消毒物品表面，用含相应中和剂无菌洗脱液（应中和剂无菌洗脱液（5ML5ML）的棉试子在规格板内横竖往返均匀）的棉试子在规格板内横竖往返均匀涂擦各涂擦各5 5次并随之转动采样棉拭子，剪去手接触部位，将棉拭子次并随之转动采样
20、棉拭子，剪去手接触部位，将棉拭子投入无菌洗脱液中，立即送检。投入无菌洗脱液中，立即送检。l 小型物体表面的结果计算用小型物体表面的结果计算用cfu/cfu/件表示。件表示。1 1、采样时间、采样时间:在接触病人和从事医疗活动前进行采在接触病人和从事医疗活动前进行采样或消毒后立即采样。样或消毒后立即采样。2 2、采样面积及方法（、采样面积及方法（棉拭方法）棉拭方法）被检人五指并拢，用含相应中和剂无菌洗脱液被检人五指并拢，用含相应中和剂无菌洗脱液（5ML5ML）的棉试子在双手指屈面从指根到指端往返涂）的棉试子在双手指屈面从指根到指端往返涂擦擦2 2次，并随之转动采样棉拭子，剪去手接触部位，次，并随
21、之转动采样棉拭子，剪去手接触部位，将棉拭子投入无菌洗脱液中，立即送检。每只手面将棉拭子投入无菌洗脱液中，立即送检。每只手面积按照积按照30CM30CM2 2计算。计算。手消毒效果监测手消毒效果监测三、洗脱法该法较其它两种方法采菌量多，但操作较复杂。取灭菌生理盐水200ml300ml，倒入适当的灭菌容器内，将待检查的手浸入生理盐水中，反复冲洗1min2min。然后将冲洗后的水用细菌过滤器过滤，过滤完毕，将滤膜贴于普通琼脂培养基上，37培养24h，计算菌落数。皮肤粘膜采样方法皮肤粘膜采样方法 用5cm5crn灭菌现格板，放在被检皮肤处；用没有含相应中和剂的无菌洗脱液的棉拭子1支，在规格板内横竖往返
22、均匀涂擦各5次，并随之转动棉拭子，剪去手接触部位后，将棉拭子投人10ml含相应中和剂的无菌洗脱液的试管内，立即送检。不规则的粘膜皮肤处可用棉拭子直接涂擦采样。指压法指压法取一块普通血琼脂平板，把待检查手的十个手指的指腹部分别按压在平板表面。然后把平板放入37温箱内培养48h，计算菌落数。l卫生手标准：卫生手标准：10CFU/CM2;l消毒手标准：消毒手标准：5CFU/CM2空气微生物监测空气微生物监测l空气污染的监测得到足够重视l空气微生物研究的范围在不断扩大l空气微生物的诊断在不断提高l控制空气微生物的方法不断更新l对空气微生物采样方法认识不断提高空气微生物采样方法空气微生物采样方法一、沉降
23、法 二、浮游菌测定法*：将普通营养琼脂平板放在室内各采样点处，采：将普通营养琼脂平板放在室内各采样点处，采样时将平板盖打开样时将平板盖打开,扣放于平板旁，扣放于平板旁，暴露暴露 5 5minmin，盖，盖好立即送检。好立即送检。*检测方法：将采样平板置检测方法：将采样平板置37 37 培养培养4848h h，计数并，计数并鉴定细菌。鉴定细菌。结果计算：结果计算：细菌总数细菌总数=50000N/=50000N/（A*TA*T）沉降平皿法沉降平皿法采样方法采样方法空气消毒效果监测：采样时间：采样时间：在消毒处理后、操作前进行采样在消毒处理后、操作前进行采样 采样方法采样方法采样高度采样高度：距地面
24、距地面1.51.5m m（80-150cm80-150cm）。）。布点方法布点方法：l 室内面积室内面积3030m m2 2,设内、中、外对角线三点设内、中、外对角线三点;l 室内面室内面 积积3030m m2 2,设设4 4角及中央角及中央5 5点，均距墙壁点，均距墙壁1 1m m 平板沉降法缺点平板沉降法缺点1、平板沉降法属重心沉降，此法只能采集10m左右的粒子，而且不能作精确定量。因为就单个细菌而言，最大只有几个m，小到1 m以下，所以它只能采集到附着于各种尘埃和气溶胶表面的细菌，难以采集到悬浮的细菌，而经空气感染更多的是由于悬浮于空气中的细菌所致。l缺点2、采样时受周围气流、粒经大小和
25、粒经沉降速度等因素影响，不能准确的反应空气细菌的分布水平。3、奥梅良斯基公式规定：假如100cm2的平皿在空气中暴露5min即相当于10 l空气中的细菌数，此值是一假定值，无法定量，所以公式中的矫正数也是很不准确的。l洁净部空气采样洁净部空气采样l（一）采样方法：（一）采样方法：l1 1、当送风口、当送风口集中布置集中布置时，应对手术区和周时，应对手术区和周l 边边 区分别检测；区分别检测；l2 2、当送风口、当送风口分散布置分散布置时，按全室统一布点时，按全室统一布点l 方方 法检测（按室内面积大小布点）；法检测（按室内面积大小布点）；l3 3、沉降法采样时，用直径、沉降法采样时，用直径9c
26、m9cm的培养皿的培养皿,在空在空气中暴露气中暴露30min30min，37 37 培养培养2424h h，培养皿中的，培养皿中的菌落数（菌落数（cfucfu）代表空气中沉降下来的细菌数，）代表空气中沉降下来的细菌数，个个/皿皿。l（二）采样高度：（二）采样高度：l1 1、采样点可布置在地面上或不高于地面、采样点可布置在地面上或不高于地面l 0.8m0.8m 的任意高度上；的任意高度上；l2 2、在手术区检测时应无手术台；、在手术区检测时应无手术台；l3 3、当手术台已固定时，检测高度应在台面、当手术台已固定时，检测高度应在台面l 之上之上0.25m0.25m；三十万级：面积30m2布放4点，
27、面积30m2布放2点（避开送风口正下方）。撞击式空气微生物采样法撞击式空气微生物采样法 采样器分别置于室内对角和中央共3个点。设置采样时间为每点2min，空气流量为28.5lmin，细菌培养方法同沉降法。FA-1型多级撞击式空气微生物采样器型多级撞击式空气微生物采样器l整个仪器是由采样器以及抽气泵、流量计、玻璃平皿所组成。l采样器是6层有微小孔眼的铝合金圆盘。圆盘下放琼脂平皿，每圆盘间有密封胶圈，在通过三个弹簧卡子把圆盘牢固地联在一起。每个圆盘上有400个成环行排列、逐层减小、尺寸精确的小孔，标准采样流量为1立方呎（28.3L/min）。浮游菌测定法优点浮游菌测定法优点1、能够采集浮游在空气中
28、的微生物粒子，这种粒子可随人们呼吸运动进入呼吸道内，因而具有卫生学意义。2、采样效率高，采样量准确，采样时不受粒经大小、沉降速度和气流影响，能准确的表示出空气中细菌的实际含量。使用中消毒液的监测:采样量及方法采样量及方法：在无菌条件下，用无菌吸管吸：在无菌条件下，用无菌吸管吸取取0.5mL0.5mL被检样液，加入被检样液，加入4.5mL4.5mL含相应中和剂的含相应中和剂的稀释液中混匀，对于醇类与酚类消毒剂，稀释稀释液中混匀，对于醇类与酚类消毒剂，稀释液用普通营养肉汤即可；液用普通营养肉汤即可；在无菌条件下，用无菌吸管吸取1ml被检样液，加入9ml稀释液中混均。l醇类与酚类消毒剂，稀释液用普通
29、营养肉汤即可；l含氯消毒剂、含碘消毒剂、过氧化物消毒剂，需在肉汤中加入01硫代硫酸钠；l洗必泰、季铵盐类消毒剂，需在肉汤中加3（W/V）吐温80和0.3%卵磷脂；l醛类消毒剂，需在肉汤中加入0.3甘氨酸；l含有表面活性剂的各种复方消毒剂，需在肉汤中加入3（W/V）吐温80，以中和被检药液的残效作用医疗器械灭菌效果的监测:一般采用无菌试验法，但因其操作繁锁，监测一般采用无菌试验法，但因其操作繁锁，监测周期较长以及受抽样量大等因素的限制，故一周期较长以及受抽样量大等因素的限制，故一般情况下可采用般情况下可采用常规监测法评价医疗器械灭菌常规监测法评价医疗器械灭菌效果。效果。l1 1采样时间：灭菌后，
30、效期内采样时间：灭菌后，效期内l2 2采样方法：采样方法：l*小件物品：直接放入小件物品：直接放入5ML5ML无菌洗脱液内，立无菌洗脱液内，立即送检。即送检。*对手术钳、镊子等大的医疗器械在无菌操作下取对手术钳、镊子等大的医疗器械在无菌操作下取2 2份以上用沾有无菌洗脱液的棉拭子反复涂擦采样，份以上用沾有无菌洗脱液的棉拭子反复涂擦采样，并将棉拭子投入并将棉拭子投入5 5mLmL无菌洗脱液中；无菌洗脱液中；*对一些特殊医疗用品，可用浸有无菌洗脱液采样对一些特殊医疗用品，可用浸有无菌洗脱液采样液的棉拭子在被检物体表面涂擦采样，被采表面液的棉拭子在被检物体表面涂擦采样，被采表面100100cmcm2 2，取全部表面，被采表面，取全部表面，被采表面100100cmcm2 2，取，取100100cmcm2 2；采样后马上送检。；采样后马上送检。