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1、第6章 兽药残留研究主要内容 第1节 残留概述 第2节 残留毒理学评价 第3节 残留化学评价 第4节 各国兽药残留监控学习要点 残留的概念及发生原因。残留的安全性评价程序。最高残留限量与休药期的确定方法。残留分析方法原理与步骤第1节 残留概述1、残留危害人体健康n 急性毒性 瘦肉精中毒n 变态反应与过敏反应 青霉素过敏n 慢性、累积性、不可逆毒性 氯霉素再障贫血 硝基呋喃、己烯雌酚致癌n 耐药性：n 激素样作用：同化剂美国新闻周刊报道:仅1992年全美就有13300名患者死于抗生素耐药性细菌感染二、危 害2、残留影响国民经济发展l 养 殖 业:销毁产品 承担检测和调查费用 丢失市场 受到处罚和
2、谴责l 食 品 业:肉、蛋、奶加工生产受到影响l 国际贸易：鳗鱼事件(1989)克球粉事件(19901993)蜂蜜事件(1996)氯霉素事件(1996、2002)中国是畜禽养殖的第一大国，但仅1产品可出口3、残留影响社会稳定意大利和波多黎哥的性早熟事件Bongiovanni WH.An Epidemic of Premature Thelarche in Puerto Rico.J Pediatr 1983;103:245-246比利时二恶英事件消费者:我们还能吃什么?!中国瘦肉精事件1、残留化合物种类多/性质迥异n 人工使用的400余种，加上污染物有数千种n 这些物质结构及理化性质迥异莫能菌
3、素氯霉素己烯雌酚瘦肉精四、残留的特点2、70外源物在体内发生广泛代谢,残 留通常不是异物本身。残留化合物不下万种!4、残留通常是痕量或超痕量水平,存在于复杂的 基质中。n 多数化合物为ppb水平，氯霉素/硝基呋喃等在ppb以下，二恶英等为ppt水平n 要求分析方法高度灵敏/特异/可靠n 组织中的内/外源性物质干扰大，样品预处理难。五、影响残留的因素n 动物生理、病理、种属n 化合物结构、性质、相互作用n 饲养模式、给药方式、食品贮藏加工n 环境六、残留控制措施n 合理用药n 监 控n 立 法n 科学研究八、残留控制原理残留的毒理学评价 安全浓度（SC)残留的化学评价最高残留限量（MRL）休药期
4、（WDT）分析方法研究第2节 残留的毒理学评价 确定最大无作用剂量（NOEL）；确定安全因子（SF）；推算日许量（ADI）和安全浓度（SC）。一、目的意义(一)基础毒理学研究n 急性毒性试验n 遗传毒性试验n 90天喂养试验n 两代繁殖试验n 发育试验二、毒理学研究内容n 一年喂养试验n 慢性致癌试验n 第二种动物的致畸试验n 抗菌药肠道菌丛试验n 特殊试验（神经、免疫、激素、子宫等）(二)附加毒理学研究三、毒理学评价的程序和要求 n 第一阶段：急性毒性试验。目的：了解受试物的毒性强度和性质，为蓄积性 和亚慢性毒性试验的剂量选择提供依据。实验项目：半数致死量实验（LD50）。结果判定：LD50
5、大于10倍人体摄入量，继续研 究。否则，放弃。（一）程序1.蓄积毒性试验：LD50大于10g/kg b.w.，不进行蓄积毒性试验。蓄积系数（K）小于3为强蓄积性，应放弃。K大于或等于3为弱蓄积性。第二阶段：蓄积毒性和致突变试验。（1）目的：对受试物是否具有致癌作用的可能性进行筛选。（2）试验项目：原核细胞和真核细胞，基因突变和染色体畸变，体内和体外试验系统，体细胞和生殖细胞。Ames试验和微核试验必做。精子畸形、睾丸精原细胞染色体畸变、显性致死三者任选一项。2.致突变试验：（1）目的：观察受试物动物的毒性作用性质和靶器官，确定最大无作用剂量（NOEL）。（2）试验项目：90d喂养试验、喂养繁殖
6、试验、喂养致畸试验和传统致畸试验。第三阶段：亚慢性毒性试验和代谢试验。（3）结果判定：任何一项的NOEL小于或等于人可能摄入量的100倍，应予放弃；大于100倍而小于300倍，可进行慢性毒性试验；大于或等于300倍者，不必进行慢性毒性试验。（二）要求n 试验动物必须选择对化学物质的代谢方式与人相似的动物种类。n 选择的剂量要能够在其血浆和靶器官中产生与人相应的浓度。n 应选择最佳的试验组合。n 必须对受试物可能对人畜健康造成的危害及可能的有益作用之间进行综合评价。1.日许量的确定 日许量(ADI)：指人终生每日摄入某种药物或 化学物质后，对其健康不产生 可觉察有害作用的剂量。四、安全浓度的确定
7、计算方法如下：NOEL(mg/kg b.w./d)60 kg b.w.ADI=安全因子 单位：mg/kg b.w./d 或mg/60kg b.w./d 安全浓度：食品动物用药后其所有可食用组织中 与药物有关的总残留浓度。STC=ADI食耗因子（TCF）TCF：肌肉 300 g；肝脏 100 g；脂肪 50 g；肾脏 50 g；鸡蛋 100 g；牛奶 1.5 L2.安全浓度的确定(STC)第3节 残留的化学评价一、目的n 阐明药物在动物体内的总残留消除规律，存在的稳定状态，主要代谢方式、代谢程度、代谢形式及种属差异。n 确定药物在动物的残留靶组织、残留标识物、最高残留限量（MRL）及休药期标准。
8、总残留研究 代谢研究 休药期研究 分析方法研究二、研究内容（一）总残留研究1、概念：由游离化合物、游离代谢物及它们与内源性大分子的结合物几部分组成。2、研究目标:药物在动物体内的总残留消除规律，存在的稳定状态及主要代谢物。放射性标记法（“热”研究法）直接测组织法（“冷处理”法）：3、研究方法：（1）靶组织（Target tissues）指动物用药后药物及其代谢物残留时间最长的组织。（2）标示残留物Marker residue(Rm)总残留中消除最慢、残留时间最长的物质。其含量的变化与总残留的变化呈稳定的比例关系。4、几个概念：（3）容许量Tolerance(Marker Residue)指残留
9、标识物在靶组织中允许残留的量 容许量=STC X%marker residue（4）安全浓度Safe Concentration(SC)指人体允许摄入的与药物相关的残留物的总量。指具有生理活性残留物的含量，通常用残留靶组织中允许残留的残留标识物的量来反映，即动物体内总残留含量消除至安全浓度以下时残留标识物在靶组织中的含量。（5）最高残留限量(MRLs)（6）最高残留限量设定方法n 目的：（1）确证靶动物（或人体）体内的残留物与 毒理学研究的动物体内残留特征相似性。（2）寻找与靶动物（或人体）代谢特征相似 的动物模型。n 要求：选择毒理学研究最敏感的动物。（二）比较代谢研究n 内容：（1）组织与
10、排泄物中主要代谢物的定性 及定量研究。（2）药物代谢速度与程度。（3）主要的代谢途径和排泄途径。（三）休药期研究n 概念：休药期（Withdrawal time）：也称消除期（depletion period），指畜禽停止给药到许可屠宰或其产品（乳、蛋）许可上市的间隔时间。n 试验要求（1）临床最高剂量，最长期限。（2）按FDA要求需20 头动物。（3）每个采样点屠宰4 5 头动物。（4）设置4 5 个等距的采样点。1、休药期n 休药期计算方法：定义法 线性回归法 非参数法（1）定义法n 休药期=残留量低于MRL的时间+安全间隔时间。n 估算安全间隔时间的方法：（1）当所有检测样都低于MRL时
11、，取该时间点的10 30 作为安全间隔时间值。（2）通过组织消除半衰期t1/2计算，一般安全间隔时间为1-3倍的t1/2。2、弃奶期n 在ADI的分配中必须考虑到牛奶部分。n 必须有奶中的容许量（最高残留限量）和残留标识物规定。n 当奶中残留物消除至容许量附近时必须重复采样。n 样品至少设三个重复。n 每个动物的消除规律应单独计算。n 计算方法采用线性回归法，3、弃蛋期n 注意：消除实验中，必须在接近蛋黄形成期用药12天。4、食品安全要求1毒理学评价中对药物的安全性保守估计。2计算安全浓度时对食物消耗量保守估计。3充分监测所有与药物相关的残留物。4动物与人体比较代谢研究评估准确。5靶组织、残留
12、标识物及容许量设置合理。6休药期与弃奶期计算方法合理。1残留分析的特点（1）待测物质浓度低，属痕量测定，被测物 浓度波动大。（2）生物样品基质复杂，干扰物质多。（3）分析方法以仪器分析方法为主。（四）分析方法（1）分离：提取 净化 分离（分辨）（2）检测：直接对痕量残留物质进行定性或定量。如紫外/可见、红外、荧光、核磁共振、质谱等波谱学性质。2分析原理3程序样品采集与制备 提取 净化 浓缩 衍生化 分辨 检测分离样品前处理测定（1）样品前处理：样品采集和贮存，去蛋白，抽提和净化（固液萃取、膜萃取、液液萃取、固相萃取、组织固相萃取、超临界流体萃取、免疫亲和色谱）。（2）衍生：荧光衍生（氨基、羟基
13、、巯基、羧基或羰基），紫外可见光衍生（氨基、羧基、羟基、巯基），酶衍生，光化学衍生。液相色谱，气相色谱，薄层色谱，超临界流体色谱（用于极性或大分子化合物），毛细管电泳（离子），多维分离（联合不同色谱柱）。（4）检测：微生物方法，免疫方法，物理化学方法（紫外可见检测器、荧光检测器、电化学检测器、极谱检测器、气相的特定检测器、质谱检测器）。（3）分离：液相色谱、毛细管电泳二级管阵列，气相色谱质谱，薄层色谱质谱，液相色谱质谱，气相色谱红外光谱，液相色谱红外光谱。（5）确认：（6）复核：多个实验室。4建立方法的步骤检测限与定量限 文献调研 建立测定方法 样品前处理方法 标准曲线 稳定性试验 方法性能评
14、价 准确度精密度线性范围 选择性（1）文献调研 n 待测物理化性质：如极性、溶解性、酸碱性、稳定性、熔点、蒸汽压及波谱学性质等；n 体内过程：包括代谢产物、组织分布、排泄途径和特征药动学性质，如生物利用度、半衰期、分布容积、蛋白结合率。n 药理毒理学特征：如残留毒性、最高残留限量和休药期等。n 首先建立测定方法和线性范围，为后续的各种工作提供分析手段，最后根据干扰和使用情况逐步确立测定条件和建立标准曲线。n HPLC是首选的测定方法。（2）建立测定方法 n 纯水作为样品基质预试，了解液液萃取（LLE）或固相萃取（SPE）条件、试剂干扰和回收率情况。n 空白样品和标准添加样品进行研究。（3）建立
15、样品前处理方法（4）标准曲线 n 配制系列浓度（57个），每个浓度重复测定35次。n 标准曲线的浓度梯度须涵盖样品可能的浓度范围，不得进行外推计算。n 包括标准溶液和样品在贮存条件下的稳定性试验，如室温、冷冻、反复冻融条件下的稳定性。（5）稳定性试验 标准添加法。通常需设定至少3个浓度，每批每个浓度水平5次重复，进行5次单独试验，经统计处理后得到各效能指标。（6）方法性能评价 n 概念：指测定值与真实值的接近程度，表示分析结果的正确性。n 表示方法：添加回收率（recovery）n 计算方法：标准曲线法和单点校准法。a.准确度（accuracy）X=(A-b)/a(W/V)/Cs 100%X：
16、试样中待测物的回收率；A：试样的峰高或峰面积；a:标准曲线斜率；b:标准曲线截距W：试样的重量（g）；V：试样提取液浓缩吹干后残余物溶解的总体积（mL）。Cs：已知标准添加浓度；n标准曲线法计算公式：n 单点校准法计算公式：X=A V/AsW 100%X：试样中待测物的回收率；A：试样的峰高或峰面积；As：标准工作液的峰高或峰面积；W：试样的重量（g）；V：试样提取液浓缩吹干后残余物溶解的总体积（mL）。回收率要求：n 概念：指用某种方法重复测定同一均质样品所得测定值得彼此接近程度，表示分析结果得重复性。n 表示方法：相对标准偏差（RSD），又称变异系数（CV），计算公式：RSDSD/X.10
17、0b精密度（precision）n 重复性（repeatability）:指在短期内相同的试验条件下对同一样品测定测定结果间的精密度。批（日）内RSD（within-run precision）批（日）间RSD（between-run precision）。n 两层含义:n 重现性(reproducibility):指不同实验条件下使用相同分析方法对同一样品各个独立测定值间的变异程度。精密度要求：n 检测限（limit of detection,LOD）指分析方法能够从样品的背景信号中检测出待测物存在时所需的最低浓度，是反映分析方法灵敏度的效能指标。n 一般要求残留分析方法的LOD0.1MRL
18、。C.检测限与定量限n 定量限（limit of quantitation,LOQ）：指分析方法能够对样品中待测物进行定量测定的最低浓度。LOQ反映了方法在低浓度端分析结果的可靠性，一般要求CV20，回收率70。n 通常要求残留分析方法的LOQ0.2MRL。n 待测物浓度与仪器的响应信号呈线性关系并能满足定量要求的浓度范围，用浓度最小值和最大值或两者之比表示。n 采用直线回归的方法计算和描述。一般要求相关系数r0.9990。d 线性范围（linear range）e.选择性（selectivity）n 指样品基质中有其他成分共存时该分析方法对待测物的分辨能力。（a）内源性物质的干扰。（b）代谢
19、产物干扰。（c）其他药物的干扰。n 遵循原则：（1）样品应包括实际样品；（2）普通方法至少有3个实验室参加。（3）影响较大的方法，如拟向国内或国际上推 荐使用的方法，至少需8个实验室参加。f复核试验 G.报告 n 概述:待测物相关分析方法的发展现状及存在的问题。n 操作方法:稳定性试验方法，提取方法，净化方法，测定方法。n 方法评价:标准曲线，回收率，变异系数，检测限，定量限，选择性。n 应用:n 附件:标准品、空白样品、添加样品和实测样品的色谱图，参考文献。5方法分类n 按分离或检测原理可分为：（1）理化分析法。包括波谱法、色谱法及其联用技术。（2）免疫分析法。放射免疫测定法、酶联免疫测定法
20、、荧光免疫测定法等.（3）生物测定法。如微生物测定法、放射受体测定法等。按残留分析目的和用途可分为：（1）筛选方法(screening methods)。半定量和一定的定性能力，灵敏度高、过程简单、分析速度快。（2）常规方法(routine methods)。准确的定量分析能力。（3）确证方法（confirmatory methods）。高的灵敏度，准确的定性分析和定量分析能力。重点在于定性功能。（1）单组分残留分析法。（2）多组分残留分析法。按被测组分数目可分为：第4 节 各国兽药残留监控一、美 国（一）食品安全管理机构：（1）食品安全监察署（FSIS）（2）食品药物管理局（FDA）（3）动
21、植物检验署（APHIS）（4）环境保护局（EPA）（5）地方和州政府食品安全机构。n 负责对国内肉类、禽类和蛋类产品的检验；n 负责各有关残留监控机构的协调工作；负责相关的检测活动的计划和执行，进行国家残留检测计划；n 负责向FDA 报告药物、农药和其他污染物在肉、禽和蛋类产品中的残留污染情况。FSIS：FDA：n 主要负责批准可使用的兽药和食品添加剂，建立动物源性食品中的兽药的允许最大残留限量，并负责制定休药期。EPA：n 主要负责批准可使用的农药，建立在动物源性食品中的农药残留允许的最大残留限量。APHIS：n 防止植物和动物的有害生物和疾病。地方和州政府食品安全机构：n 主要管理其辖区内
22、的所有食品，与FDA和其他联邦机构合作实施鱼、海产品、牛奶及其他国内生产的食品的安全标准；n 检验餐馆、杂货店、其他食品零售商店、牛奶厂及牛奶加工厂、谷堆及辖区范围的食品加工厂；n 禁止州内不安全食品的销售和配送。n 联邦食品药物及化妆品法(FFDCA)n 联邦肉类检验法（FMIA）n 禽类制品检验法（PPIA）n 蛋类制品检验法（EPIA）。（二）法律法规（一）管理机构 1996年前，农业与农产品部、卫生部、工业部及渔业与海洋部。1997年，农业部下属的加拿大食品监察署（CFIA）与卫生部。二、加拿大n 卫生部：负责制定所有国内出售的食品的安全与营养质量标准以及食品安全的相关政策，并通过应用
23、加拿大卫生部的食品安全评估程序进行最后检查，评估CFIA的执行情况。n CFIA：负责实施卫生部制定的有关法规和标准，并对法规和标准的执行情况进行监督；负责安排具体活动项目的检查，如对所有联邦登记了的屠宰场和加工公司的检查，对政府工作人员执行情况的检查以及对出口产品要满足国外贸易要求标准的检查。n 肉类检查法(MIA)主要对肉和家禽，规定了如何制定合法登记的生产单位生产安全、符合道德标准的肉类制品所应达到的标准和要求，以及为防止欺诈在省级和国际市场上出售时的标识的标准和要求。（二）法律法规n 鱼类检查法(FIA)主要对鱼和海产食品，规定了有关鱼类产品和海洋植物的捕捞、运输和加工的标准和要求，包
24、括了省级贸易和外贸进出口的鱼类产品和海洋植物。n 加拿大农产品法(CAPA)对蛋、乳制品、蜜、鲜果、蔬菜和加工产品，就如何监督在联邦登记注册的企业生产农业产品(例如奶品、枫叶产品、加工品)规定了基本原则，并制定了促进省级贸易和外贸进出口食品的安全和质量的标准。n 食品药物法(FDA)：负责有关食品、药物、化妆品和医疗器械的卫生安全和防止商业欺诈(食品检验署只负责其中的食品)。n 消费者保护和标识法(CPLA)应用于所有食品，防止包装食品和某些非食用产品在包装、标识、销售、进口和广告方面的商业欺诈(食品检验署只负责食品部分)。三、中国（一）管理机构n 农业部兽医局n 中国兽医药品监察所n 省级兽
25、医药品监察所n 全国兽药残留专家委员会农业部兽医局n 负责动物卫生有关工作，组织动物及动物产品检验检疫、兽药残留监控、动物及动物产品卫生质量安全监督管理工作；n 研究拟定动物医疗、动物实验的技术标准并组织实施。n 组织拟定动物卫生标准，负责制定、发布兽药国家标准、兽药残留限量标准和残留检测标准，并组织实施。中国兽医药品监察所n 负责兽药质量检验和兽药残留检验最终技术仲裁；n 承担兽药残留标准的制、修订工作；n 承担兽药残留监控工作；n 开展兽药残留检测工作；n 承担国家兽药残留基准实验室和省级残留试验室的技术指导工作。全国兽药残留专家委员会n 主持兽药残留相关标准的制定与评估。如MRL、休药期
26、与检测方法标准等。（二）食品安全管理进程n 1994年，农业部发布34种兽药的最高残留限量标准。n 1997年，修订最高残留限量标准。n 1999年，再次修订最高残留限量标准，并将药物的品种扩大到109种。n 2002年，第三次修订最高残留限量标准，兽药品种增加到240多种。n 1994年发布饲料药物添加剂允许使用目录，规定了94种物质可以用作饲料药物添加剂。n 1997年规定了30种饲料药物添加剂的适用动物、适用阶段、使用剂量、停药期和配伍禁忌。n 2000年版中国兽药典首次规定了20多种兽药的休药期。n 2001年，重新规定了饲料药物添加剂使用规定。n 2003年，制定400余种兽药制剂的休药期标准。思考题n 残留的概念与特点。n 残留的毒理学评价程序与要求。n 残留化学评价研究的主要内容及要求。n 最高残留限量和休药期确定方法。n 残留分析方法建立的基本步骤。n 试述新药原料药研究的主要内容。n 试述新药主要药效学研究的基本要求与注意事项。小 测 验