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1、 兽药残留分析技术兽药残留分析技术陈陈 品品华中农业大学动物医学院华中农业大学动物医学院第一节第一节 概述概述一、基本概念一、基本概念指给畜禽等动物用药后蓄积或贮存在动物细胞、组织和器官内的药物或化学物质的原形、代谢产物和杂质。1.兽药残留（兽药残留（veterinary drug residue)2.总残留物（总残留物（total residue)指食品动物用药后，动物产品的任何食用部分中某种药物残留的总和，或指动物组织中可被提取的原型药物及任何具有毒理学意义的代谢产物的总称。3.标示残留物（标示残留物（marker residue)4.靶组织靶组织(target tissue）指总残留物中
2、，在动物体内消除缓慢、残留量高、残留期长、性质稳定、有灵敏方法检测的组分。指残留量高、残留物最后消除的组织。二、二、兽药残留的原因残留的原因不正确用药不遵守休药期宰前用药物掩饰临床症状，以逃避检查以未经批准的药物作饲料添加剂药物标签指示用法不当加工贮存过程中污染接触环境中污染的药物三、三、兽药残留种残留种类-兴奋剂 克伦特罗 沙丁胺醇 来克多巴胺抗菌药 硝基咪唑类、1.1.违禁药物违禁药物 甲状腺抑制剂 丙硫氧嘧啶 甲巯咪唑激素 己烯雌酚、睾酮、群勃龙、雌二醇、孕酮等镇静剂 氯丙嗪、安定、利血平皮质激素类 地塞米松、氢化可的松呋喃类、氯霉素2.2.毒性较大、休药期较长的药物毒性较大、休药期较长
3、的药物呋喃唑酮 阿维菌素类 磺胺类 磺胺二甲嘧啶 磺胺喹恶啉 喹恶啉类 卡巴氧 喹乙醇 乙酰甲喹二氨嘧啶类 TMP四环素类 金霉素 土霉素苯并咪唑类 阿苯达唑 氟苯咪唑 左咪唑 氯羟吡啶 双甲咪 二嗪农等工业污染物 如重金属 环境污染物 如二恶英3.3.其他其他四、四、兽药残留的危害残留的危害过敏反应毒性作用激素样作用耐药性环境污染1.1.过敏反应过敏反应 经经常常食食用用含含低低剂剂量量抗抗菌菌药药物物的的食食品品能能使使易易感感个个体体出出现现过过敏敏反反应应，如如青青霉霉素素、四四环环素素、磺磺胺胺类药物及某些氨基糖苷类抗生素等。胺胺类药物及某些氨基糖苷类抗生素等。这这些些药药物物具具有
4、有抗抗原原性性，刺刺激激机机体体内内抗抗体体的的形形成成，造造成成过过敏敏反反应应，严严重重者者可可引引起起休休克克、喉喉头水肿、呼吸困难等严重症状。头水肿、呼吸困难等严重症状。呋呋喃喃类类引引起起人人体体的的不不良良反反应应主主要要是是胃胃肠肠反反应应和和过过敏敏反反应应，表表现现在在以以周周围围神神经经炎炎、药药热热、嗜嗜酸酸性性白白细细胞胞增多为特征的过敏反应。增多为特征的过敏反应。磺磺胺胺类类药药物物的的过过敏敏反反应应表表现现为为皮皮炎炎、白白细细胞胞减减少少、溶溶血血性性贫贫血血和和药药热热。抗抗菌菌药药物物残残留留所所致致变变态态反反应比起食物引起的其他不良反应所占的比例小。应比
5、起食物引起的其他不良反应所占的比例小。青青霉霉素素药药物物引引起起的的变变态态反反应应，轻轻者者表表现现为为接接触触性性皮皮炎炎和和皮皮肤肤反反应应，严严重重者者表表现现为为致致死死性性过过敏敏性性休休克。克。2.2.毒性作用毒性作用急性中毒 如-兴奋剂慢性中毒 磺胺类 肾损害氯霉素 再生障碍性贫血四环素 骨骼和牙齿发育苯并咪唑类 致畸、致癌、致突变二恶英 肺、肝肿瘤 3.3.耐药性耐药性动物在经常反复接触某一种抗菌药物后，其体内的敏感菌株将受到选择性的抑制，细菌产生耐药性，使耐药菌株大量繁殖。人体经常食用含药物残留的动物性食品，动物体内的耐药菌株可传播给人体，当人体发生疾病时，就给临床上感染
6、性疾病的治疗带来一定的困难，延误正常的治疗。已发现长期食用低剂量的抗生素能导致金黄色葡萄菌耐药菌株的出现，也能引起大肠杆菌耐药菌株的产生。在正常条件下，人体肠道内的菌群与人体能相互适应，如某些菌群能抑制其他菌群的过度繁殖，某些菌群能合成B族维生素和维生素K以供机体使用。过多应用药物会使这种平衡发生紊乱，造成一些非致病菌死亡，使菌群的平衡失调，从而导致长期的腹泻或引起维生素缺乏等反应。4.4.激素样作用激素样作用-兴奋剂（瘦肉精）引起中毒。长期食用含低剂量激素动物性食品，肿瘤发生率上升。同化激素用于促进动物生长，提高饲料利用率，目前多数国家已禁用。5.5.环境污染环境污染动物用药后，药物随粪、尿
7、排到环境中，对土壤微生物和昆虫、水体均造成影响；在土壤中检测到金霉素；在土壤中残留的药物，可通过生物富集和生物放大作用影响人和其他动物；五、最高残留限量和休五、最高残留限量和休药期期1.食食品品动动物物（food-producing animal)：指各种人工养殖供人食用的动物。2.可可食食组组织织（edible tissue)：指全部可食用的动物组织，包括肌肉和脏器等。3.最高残留限量（最高残留限量（maximum residue limit，MRLs)：指指食食品品动动物物用用药药后后，允允许许存存在在于于食食物物表表面面或或内内部部的的残残留留药药物物或或化化学学物物质质的的最最高高量量
8、或或浓浓度度。一一般般以以鲜重计，用鲜重计，用mg/kgmg/kg、g/kgg/kg或或mg/kgmg/kg、g/Lg/L。兽药最高残留限量（兽药最高残留限量（MRL）的确定）的确定最大无毒性作用剂量是根据最敏感实验动物（一般为大鼠、兔、狗）的毒理学试验，对动物不产生任何毒性的最大剂量。实际是一种从实验动物外推到人的安全性数据。具体来讲，就是根据兽药的三性（急性、亚慢性慢性）和三致（致突变、致畸胎、致癌）试验结果得来。（1）最最大大无无毒毒性性作作用用剂剂量量（No observed effect level，NOEL）的确定）的确定（2）每每日日允允许许摄摄入入量量（Acceptable D
9、aily Intake，ADI）的确定）的确定每日允许摄入量是指可以被一个人安全地消费而不产生任何作用的量。ADI=NOEL/安全因子，其中安全因子，如果NOEL是根据急性试验得到的，安全因子为1000；如果NOEL是根据慢性试验得到的，安全因子则为100。（3 3）最高残留限量（）最高残留限量（Maximum Residue LimitMaximum Residue Limit，MRLMRL）的确定的确定根据ADI，计算出各种组织中的最高残留限量。其中，组织消费量如下（按其中，组织消费量如下（按WTO推荐）：推荐）：肌肉 300g脂肪 50g肝脏 100g肾脏 50g蛋 100g奶 4.休药
10、期（休药期（withdrawal time)指食品动物从停止给药到许可屠宰或其产品许指食品动物从停止给药到许可屠宰或其产品许可上市的间隔时间。可上市的间隔时间。（1 1）影响药物残留消除和休药期的因素）影响药物残留消除和休药期的因素药物的剂型与剂量给药途径合并用药和重复用药动物年龄、性别、品种、个体差异胃肠道环境及机能状态（2 2）休药期估算方法）休药期估算方法估算休药期的程序确定靶组织确定被测残留物研究组织残留消除规律数据统计处理根据动物实验估算根据动物实验估算按实际给药剂量和途径给药后停药在MRLs附近设置至少4个采样点，采取靶组织样品对样品进行残留分析绘制残留消除半对数曲线图，用直线回归
11、法对数据进行统计处理将MRLs作为统计量估计时间的99%置信区间，取上限时间作为休药期根据组织药动学参数估算根据组织药动学参数估算六、六、监控和防范控和防范兽药残留的措施残留的措施加强药物生产和使用管理，完善法规严格规定药物的休药期和允许残留量对药物进行安全性毒理学评价加强兽药残留分析方法的技术研究第二节第二节 残留分析残留分析1.1.筛选方法（方法（SCREENING METHODSCREENING METHOD）指在一定浓度内，用于快速检测大量样品的方法。如微物法、免疫化学法。一、一、残留分析中的常用术语残留分析中的常用术语v筛选方法的要求:必须限定方法的特异性允许出现假阳性，最低限度控制
12、假阴性检测限和定量限必须适合检测目的方法快速简便2.2.常常规方法（方法（ROUTINE MEITHODROUTINE MEITHOD）指可以基本确定样品中某种残留物存在和确定其浓度的方法。v要求具有准确的定量分析能力不一定具有准确的定性分析能力v方法 HPLCGC3.3.确确证方法方法指用于测定并确证筛选方法和常规方法检测为阳性结果的样品中是否存在药物残留及残留量。v确证方法的要求特异性高、定量分析能力强 精密度、准确度达到规定检测限和定量限适合检测目的v常用方法 GC-MS、LC-MS、GC-IR、LC-IR4.4.参比方法参比方法 （REFERENCE METHODREFERENCE M
13、ETHOD）指以被某国家或国际机构验证和接受的法定性确证方法，可用于验证有关方法的精确度和精密度。5.5.标准分析物（准分析物（STANDARD ANALYTESTANDARD ANALYTE）指在分析中用作参比的高纯度已知物质，一般用于制作标准曲线或测定添加回收率。6.6.特异性（特异性（SPECIFICITY SPECIFICITY）指样品基质中其他组分共存时该分析方法对待测物的分辨能力，有时称选择性。7.7.准确度（准确度（ACCURACYACCURACY）指测定值与其真实值的接近程度，反应分析结果的正确性。通常用添加回收率（recovery）表示。添加浓度m（mg/kg）回收率（）m0
14、.1 80110m0.01 70110001m0.001 60120m0.001 50120不同添加浓度的回收率原则要求如下：不同添加浓度的回收率原则要求如下：8.8.精密度（精密度（PRECISIONPRECISION）指在限定条件下，用某种测定方法重复测定同一均质样品所得测定值的彼此接近程度。反应分析结果的重复性和重现性。通常用变异系数（CV）或相对标准差（RSD）表示。不同待测物浓度的精密度要求不同待测物浓度的精密度要求9.9.重复性重复性重复性（重复性（repeatabilityrepeatability）：）：指在短期内相同条件下，测得的同一样品各个相互独立分析结果的符合程度。相相同
15、同条条件件：同一实验室、同一操作者、同一批号试剂、同一样品、同一仪器、同样分析方法表示方法：表示方法：日内变异系数或批内变异系数日间变异系数或批间变异系数10.10.重重现性性重现性（重现性（reproducibilityreproducibility）：）：指在不同试验条件下，测得同一样品各个相互独立的分析结果的符合程度。不同条件：不同实验室、不同操作者、不同仪器、同一样品、相同的分析方法。11.11.检测限与定量限限与定量限检检测测限限（limit limit of of detectiondetection，LODLOD）：指某种分析方法能够从样品的背景信号中检出待测物存在的最低浓度。反
16、应分析方法的灵敏度，一般为空白测定平均值加2倍或3倍标准差（信/噪3）。定定量量限限（limit limit of of quantitationquantitation）：指某种分析方法能够对样品待测物进行定量测定的最低浓度。具有精密度和准确度要求，反应方法在低浓度端分析结果的可靠性，为空白测定平均值加10倍标准差。二、残留分析的原理二、残留分析的原理兽药残留的特点残留水平低，大多在1mg/kg样品基质复杂，残留物不易分离纯化v基基本本原原理理：用物理或化学的方法将待测残留组分从样品中提取、分离、纯化，溶于适当溶剂，利用其光学或波谱特性，进行定性定量检测。三、残留分析方法的分三、残留分析方法
17、的分类1.1.按分离或检测原理分：按分离或检测原理分：v理化分析法 波谱法、色谱法及联用技术 HPLC、GC、TLC、-、LC-MSv免疫分析法 放射免疫 酶联免疫、荧光免疫v生物测定法 微生物法 放射受体测定法筛选方法 常规方法确证方法参比方法3.3.按被测组分分按被测组分分单组分多组分2.2.按残留分析目的和用途分按残留分析目的和用途分四、残留分析方法的建立四、残留分析方法的建立查阅文献、设计分析方法建立基本测定方法 包括确定测定方法、线性范围建立样品处理方法绘制标准曲线 外标法 内标法确定检测限和定量限测定样品回收率和变异系数稳定性分析 温度 放置时间（一）残留检测方法标准结构（一）残留检测方法标准结构（二）样品提取及分析技术路线（二）样品提取及分析技术路线（三）分析方法评价及其标准（三）分析方法评价及其标准检测限与定量限添加回收率变异系数线性范围特异性与参比方法进行相关性比较实验室协同研究（四）分析结果判定（四）分析结果判定阳性结果MRL为0 残留量分析方法的检测限确定MRL 残留量 MRL筛选方法和常规方法需用确证方法确证阴性结果MRL为0 未能检出确定MRL 残留量 MRL筛选方法和常规方法可以肯定（五）分析方法报告（五）分析方法报告概述 依据、现状、问题样品制备与保存测定方法方法评价附录 标准品、空白样品、添加标准品样品、实测样品的色谱图、标准曲线图参考文献