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1、 分子病理技术分子病理技术一一、概论、概论二、免疫组化二、免疫组化三、原位杂交三、原位杂交四、原位四、原位PCR（在实验细胞学中讲述）（在实验细胞学中讲述）五、原位末端标记技术五、原位末端标记技术 （在细胞凋亡检测方法中讲）（在细胞凋亡检测方法中讲）六、组织芯片技术（李杨）六、组织芯片技术（李杨）七、纳米技术（原子力显微镜）七、纳米技术（原子力显微镜）复习题复习题1 1 什么是分子病理学？什么是分子病理学？常用分子病理技术有哪些？常用分子病理技术有哪些？2 2 什么是免疫组织化学？什么是免疫组织化学？试述免疫酶组织化学的方法和原理。试述免疫酶组织化学的方法和原理。一、概论一、概论一、概论一、概
2、论生物高新技术生物高新技术生物高新技术生物高新技术病理学中的应用病理学中的应用病理学中的应用病理学中的应用向二方面发展：向二方面发展：向二方面发展：向二方面发展：计算机和图像分析技术的应用计算机和图像分析技术的应用计算机和图像分析技术的应用计算机和图像分析技术的应用简单的形态描述简单的形态描述简单的形态描述简单的形态描述量化方面发展量化方面发展量化方面发展量化方面发展直接观察直接观察直接观察直接观察远程远输远程远输远程远输远程远输“间接间接间接间接”观察观察观察观察定量病理学和远程病理学定量病理学和远程病理学定量病理学和远程病理学定量病理学和远程病理学原位杂交、原位原位杂交、原位原位杂交、原位
3、原位杂交、原位PCRPCR和原位末端标记技术和原位末端标记技术和原位末端标记技术和原位末端标记技术分子病理学分子病理学分子病理学分子病理学水平水平水平水平近些年来，尤其是近些年来，尤其是近些年来，尤其是近些年来，尤其是纳米技术纳米技术纳米技术纳米技术的诞生的诞生的诞生的诞生使人们对疾病的认识达原子水平使人们对疾病的认识达原子水平使人们对疾病的认识达原子水平使人们对疾病的认识达原子水平分子病理学分子病理学从分子水平研究患病机体生命现象的科学从分子水平研究患病机体生命现象的科学从分子水平研究疾病的发生、发展与转归机从分子水平研究疾病的发生、发展与转归机制的科学制的科学分子生物学分子生物学细胞生物学
4、细胞生物学 互相渗透、交叉互相渗透、交叉经典病理学经典病理学分子病理学的形成是分子生物学技术在病理分子病理学的形成是分子生物学技术在病理学中的应用的具体体现。学中的应用的具体体现。技术手段技术手段技术手段技术手段（1 1）分子免疫学分子免疫学分子免疫学分子免疫学+病理学乃至形态科学病理学乃至形态科学病理学乃至形态科学病理学乃至形态科学-免疫组织化学免疫组织化学免疫组织化学免疫组织化学（2 2）分子生物学技术）分子生物学技术）分子生物学技术）分子生物学技术 （探针；（探针；（探针；（探针；PCRPCR；分子杂交）；分子杂交）；分子杂交）；分子杂交）+形态学科形态学科形态学科形态学科 ISHISH
5、、IS PCRIS PCR和原位末端标记技术和原位末端标记技术和原位末端标记技术和原位末端标记技术 (3)(3)生物芯片技术生物芯片技术生物芯片技术生物芯片技术组组组组织芯片技术织芯片技术织芯片技术织芯片技术 (4)(4)纳米技术纳米技术纳米技术纳米技术对疾病的认识达原子水平对疾病的认识达原子水平对疾病的认识达原子水平对疾病的认识达原子水平 研究内容研究内容-阐明疾病的病理机理阐明疾病的病理机理 （1）“大海捞针大海捞针”式探讨单个致病基因式探讨单个致病基因与疾病关系研究与疾病关系研究人类基因组计划人类基因组计划 （2）信号转导信号转导疾病关系疾病关系认清疾病发生的认清疾病发生的信号转导信号转
6、导机制机制最终阐明其机制最终阐明其机制寻求干预和防治疾病寻求干预和防治疾病 病理学发展以方法为先导病理学发展以方法为先导 人类科学进步的历史和学科的发展人类科学进步的历史和学科的发展以研究方法与工具创新为先导以研究方法与工具创新为先导 一项新技术的创立，随之带来一批新的一项新技术的创立，随之带来一批新的研究成果研究成果 在病理学领域中在病理学领域中系统解剖系统解剖LMEM免疫组化技术免疫组化技术器官病理学器官病理学细胞病理学细胞病理学免疫病理学免疫病理学原位杂交和原位原位杂交和原位PCR技术技术的兴起，又将病的兴起，又将病理学这门有着悠久历史的学科推进到理学这门有着悠久历史的学科推进到分子分子
7、病理学病理学水平水平 21世纪是生命科学的世纪世纪是生命科学的世纪分子生物学是生命科学的带头学科分子生物学是生命科学的带头学科随着生物高新技术在病理学中应用的不断随着生物高新技术在病理学中应用的不断增多，增多，分子病理学将在此研究领域中占有分子病理学将在此研究领域中占有越来越重要的位置越来越重要的位置 免疫组织化学技术免疫组织化学技术一、概论：一、概论：概念概念二、二、方法和原理方法和原理三、免疫组织化学方法基本步骤三、免疫组织化学方法基本步骤四、免疫组化染色的一般注意事项四、免疫组化染色的一般注意事项一、概论一、概论一、概论一、概论1.1.概念：概念：概念：概念：1 1）免疫组织化学）免疫组
8、织化学）免疫组织化学）免疫组织化学（immunohistochemistryimmunohistochemistry）是组织学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗是组织学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗是组织学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗是组织学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织原位的显原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织原位的显原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织原位的显原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织原位的显示；是免疫学与组织化学相互渗透、相互交叉而产生的示；是免疫学与组织化学相互渗透、相互交叉而产生的示；是免疫学与组织
9、化学相互渗透、相互交叉而产生的示；是免疫学与组织化学相互渗透、相互交叉而产生的一门学科。一门学科。一门学科。一门学科。2 2）免疫组化技术免疫组化技术免疫组化技术免疫组化技术 是在组织细胞是在组织细胞是在组织细胞是在组织细胞原位原位原位原位检测检测检测检测抗原（或抗体）抗原（或抗体）抗原（或抗体）抗原（或抗体）的一种方法，的一种方法，的一种方法，的一种方法，也是在也是在也是在也是在蛋白蛋白蛋白蛋白水平原位检测基因表达的一种方法。水平原位检测基因表达的一种方法。水平原位检测基因表达的一种方法。水平原位检测基因表达的一种方法。2.2.历史历史 1914年年，Coons等人首次用等人首次用荧光素荧光
10、素标记标记抗体检测肺炎双球菌的成功，开创了免疫抗体检测肺炎双球菌的成功，开创了免疫组化的新时代组化的新时代 Sternberger改进并建立了改进并建立了辣根过氧化物辣根过氧化物酶酶抗过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）技术。技术。80年代以后年代以后，ABC、APAAP、LSAB法法等，使免疫组化技术的应用更加广泛，成等，使免疫组化技术的应用更加广泛，成为当今生物医学中形态、功能、代谢等综为当今生物医学中形态、功能、代谢等综合研究的一种有力工具。合研究的一种有力工具。近些年来近些年来，由于，由于原位杂交技术、流式原位杂交技术、流式细胞仪及图像分析细胞仪及图像分析等技术的兴起和应用，等技术的兴起和
11、应用，使免疫组化使免疫组化引向基因水平和定量引向基因水平和定量检测检测形成免疫组化新的分支形成免疫组化新的分支 杂交免疫组化和定量免疫组化。杂交免疫组化和定量免疫组化。90年代初年代初,原位原位PCR技术技术的诞生的诞生免疫组化主要是用来原位免疫组化主要是用来原位PCR结果的化学结果的化学放大和显示，标志着免疫组化技术又进入放大和显示，标志着免疫组化技术又进入了一个新的发展阶段。了一个新的发展阶段。二、二、方法和原理方法和原理1.按标记物按标记物种类种类分分:免疫免疫荧光荧光法法免疫免疫酶酶法法免疫免疫铁蛋白铁蛋白法法免疫免疫金金法及放射免疫自显影法法及放射免疫自显影法2.按标记物标记的按标记
12、物标记的部位部位分分直按法（一步法）直按法（一步法）间接法（二步法）间接法（二步法）桥联法（多步法）桥联法（多步法）目前应用最为广泛的为目前应用最为广泛的为免疫酶法免疫酶法根据根据三抗、酶三抗、酶的不同又分为的不同又分为PAP法、法、APAAP法、法、BA法法ABC法、法、LSAB法和法和SP法法等。等。3.免疫荧光法免疫荧光法 已知的已知的抗体或抗原抗体或抗原分子标记上荧光素分子标记上荧光素与其相对应的与其相对应的抗原或抗体抗原或抗体起反应起反应形成的免疫复合物上带有一定量的荧光素形成的免疫复合物上带有一定量的荧光素荧光显微镜下荧光显微镜下荧光的抗原抗体结合部位荧光的抗原抗体结合部位检测出抗
13、原或抗体检测出抗原或抗体直接法免疫荧光原理示意图直接法免疫荧光原理示意图间接法免疫荧光原理示意图间接法免疫荧光原理示意图4.4.免疫酶组织化学免疫酶组织化学 60606060年代初，年代初，年代初，年代初，HRPHRP-抗体分子上，开创了酶标记抗体抗体分子上，开创了酶标记抗体抗体分子上，开创了酶标记抗体抗体分子上，开创了酶标记抗体的新技术，现已广泛应用。目前应用最广泛的酶是的新技术，现已广泛应用。目前应用最广泛的酶是的新技术，现已广泛应用。目前应用最广泛的酶是的新技术，现已广泛应用。目前应用最广泛的酶是HRPHRP，其次是其次是其次是其次是APAP。（1 1）PAPPAP法法法法AgAb1Ab
14、2AgAb1Ab2PAPPAPDAB DAB 其灵敏度是免疫荧光法的其灵敏度是免疫荧光法的其灵敏度是免疫荧光法的其灵敏度是免疫荧光法的100-1000100-1000倍倍倍倍（2 2）ABCABC法法法法:Ag Ab1 Bio-Ab2:Ag Ab1 Bio-Ab2ABCABCDAB DAB（3)APAAP3)APAAP法法法法:AgAb1Ab2 AgAb1Ab2APAAPAPAAPFRFR（4 4）LSABLSAB或或或或SPSP法法法法:AgAb1Bio-Ab2 AgAb1Bio-Ab2HRP-SAHRP-SA DAB DAB （AP-SAAP-SA）（FR/NBTFR/NBT）直接法免疫酶
15、组织化学原理示意图直接法免疫酶组织化学原理示意图间接法免疫酶组织化学原理示意图间接法免疫酶组织化学原理示意图AgAgAgAgAb1Ab1Ab2Ab2Ab1Ab1Bio-Ab2Bio-Ab2LSABLSABABCABCPAPPAPAPAAPAPAAPHRP-DABHRP-DABAP-AP-坚固红坚固红坚固红坚固红NBTNBT多步法免疫酶组织化学原理示意图多步法免疫酶组织化学原理示意图三、免疫组织化学方法基本步骤三、免疫组织化学方法基本步骤 1.试剂配制试剂配制（1）柠檬酸盐缓冲液）柠檬酸盐缓冲液（2）TBS(Tris 缓冲生理盐水缓冲生理盐水)（3）1M Tris-HCl 缓冲液缓冲液(pH 7
16、.4)（4）显色液显色液:（5）Mayer苏木精复染液苏木精复染液2.染色步骤染色步骤（1）石蜡切片脱蜡至蒸馏水；）石蜡切片脱蜡至蒸馏水；（2）消化暴露抗原：）消化暴露抗原：（3）去除内源性酶）去除内源性酶（4）滴加适当稀释的一抗；）滴加适当稀释的一抗；（5）滴加适当稀释的生物素化的二抗；）滴加适当稀释的生物素化的二抗；（6）滴加）滴加ABC复合物等三抗复合物等三抗；（7）滴加底物显色；滴加底物显色；（8）苏木素复染核，脱水透明封片。）苏木素复染核，脱水透明封片。以上以上(1)-(5)之间均用缓冲液洗。之间均用缓冲液洗。3.结果判定结果判定HRP-DAB:阳性呈棕黄或棕黑色阳性呈棕黄或棕黑色A
17、P-Fast red:玫瑰红色玫瑰红色AP-NBT,BCIP:紫蓝色紫蓝色HRP-DAB:HRP-DAB:棕黄或棕黑色棕黄或棕黑色棕黄或棕黑色棕黄或棕黑色AP-Fast red:AP-Fast red:玫瑰红色玫瑰红色玫瑰红色玫瑰红色4.对照实验对照实验（1）空白对照：一抗由）空白对照：一抗由 TBS 或其他无关抗体取代。或其他无关抗体取代。（2）阴性对照：二抗和）阴性对照：二抗和/或三抗一抗或三抗一抗 由由 TBS或其他无关抗体取代。或其他无关抗体取代。（3）阳性对照：用含已知靶抗原的切片）阳性对照：用含已知靶抗原的切片 作阳性对照。作阳性对照。四、免疫组化染色的一般注意事项四、免疫组化染色
18、的一般注意事项1.内源酶的灭活及内源生物素的处理内源酶的灭活及内源生物素的处理 HRP3的的H2O2水溶液水溶液 含丰富血细胞的标本中，与含丰富血细胞的标本中，与H2O2产生产生强烈的反应，出现冒泡而破坏组织结构和强烈的反应，出现冒泡而破坏组织结构和细胞形态。细胞形态。可以用可以用3的的H2O2甲醇液甲醇液内源性生物素的去除：内源性生物素的去除：目的：目的：正常细胞也含有正常细胞也含有生物素生物素，尤以肝、，尤以肝、脾、肾组织含量为多。在应用亲和素试剂的脾、肾组织含量为多。在应用亲和素试剂的染色中，内源性生物素易结合后继抗体，形染色中，内源性生物素易结合后继抗体，形成亲和素成亲和素(或链亲合素
19、或链亲合素)-生物素复合物，导生物素复合物，导致假阳性发生。致假阳性发生。方法：方法：在采用生物素方法染色前，对标本在采用生物素方法染色前，对标本进行进行亲和素处理亲和素处理，使其结合位点饱和。，使其结合位点饱和。2.消除非特异性消除非特异性背景着色背景着色 常见于常见于蛋白质蛋白质(抗体抗体)吸附到组织切片中吸附到组织切片中高度荷电的高度荷电的胶原及结缔组织胶原及结缔组织成分上。成分上。方法：在滴加一抗前在标本上加一种方法：在滴加一抗前在标本上加一种无无关的蛋白质溶液关的蛋白质溶液，以封闭荷电点不给一抗，以封闭荷电点不给一抗留有吸附的余地，以保证一抗不会吸附到留有吸附的余地，以保证一抗不会吸
20、附到胶原纤维及结缔组织成分上。胶原纤维及结缔组织成分上。最常用的无关蛋白质溶液是产生二抗的最常用的无关蛋白质溶液是产生二抗的同种动物的同种动物的非免疫血清非免疫血清。3.缓冲液的选择缓冲液的选择 目的：保证免疫组织化学染色的最佳条件，目的：保证免疫组织化学染色的最佳条件，即合适的离子浓度和即合适的离子浓度和pH值。值。但不同的酶促反应要求不同的但不同的酶促反应要求不同的pH值和不同值和不同的离子。的离子。HRP免疫组织化学染色需近免疫组织化学染色需近中性环境中性环境，pH7.4-7.6较为合适较为合适。AP-需选需选碱性碱性缓冲液，缓冲液，pH8.2较为合适。较为合适。4.抗原修复抗原修复目的
21、目的 石蜡切片石蜡切片,甲醛甲醛固定，使抗原性物质或由固定，使抗原性物质或由于形成醛键、羧甲键等原因而被于形成醛键、羧甲键等原因而被封闭封闭了部了部分抗原决定簇；或由于分抗原决定簇；或由于蛋白之间发交联蛋白之间发交联而而使抗原决定簇隐蔽使抗原决定簇隐蔽.在染色时，有些抗原需要先进行抗原修在染色时，有些抗原需要先进行抗原修复或暴露。复或暴露。方法方法（1）化学方法化学方法：酶：酶-抗原决定蔟暴露抗原决定蔟暴露 胰蛋白酶、胃蛋白酶、尿素、皂素等胰蛋白酶、胃蛋白酶、尿素、皂素等（2）物理物理/化学方法化学方法：主要有：主要有 单纯加热方法单纯加热方法：柠檬酸盐缓冲液：柠檬酸盐缓冲液 高压加热方法高压
22、加热方法：微波方法微波方法：利用热效应和微波的直接：利用热效应和微波的直接作用，打开蛋白之间的交联键，将已被封作用，打开蛋白之间的交联键，将已被封闭的抗原决定簇暴露和修复。闭的抗原决定簇暴露和修复。5.一抗的选用、稀释度及孵育时间一抗的选用、稀释度及孵育时间一抗是免疫组织化学染色中最重要的试剂一抗是免疫组织化学染色中最重要的试剂一抗是免疫组织化学染色中最重要的试剂一抗是免疫组织化学染色中最重要的试剂抗体工作抗体工作抗体工作抗体工作稀释度稀释度稀释度稀释度取决于：取决于：取决于：取决于：特异性抗体的浓度，即滴度；特异性抗体的浓度，即滴度；特异性抗体的浓度，即滴度；特异性抗体的浓度，即滴度；抗体的
23、纯度；抗体的纯度；抗体的纯度；抗体的纯度；孵育时间孵育时间孵育时间孵育时间：特异性：特异性：特异性：特异性染色较强且无背景染色较强且无背景染色较强且无背景染色较强且无背景着色，是较理着色，是较理着色，是较理着色，是较理想的稀释度。加长孵育时间可有效地降低所用抗体想的稀释度。加长孵育时间可有效地降低所用抗体想的稀释度。加长孵育时间可有效地降低所用抗体想的稀释度。加长孵育时间可有效地降低所用抗体的浓度，有利于提高染色质量，节省抗体的浓度，有利于提高染色质量，节省抗体的浓度，有利于提高染色质量，节省抗体的浓度，有利于提高染色质量，节省抗体 室温过夜是较好的方法，但也可用室温过夜是较好的方法，但也可用
24、室温过夜是较好的方法，但也可用室温过夜是较好的方法，但也可用371371小时或小时或小时或小时或44过夜的方法。过夜的方法。过夜的方法。过夜的方法。6.选择适宜的检测方法选择适宜的检测方法 血涂片，骨髓涂片血涂片，骨髓涂片 内源性内源性HRP丰富丰富 APAAP或碱磷酶标记的方法或碱磷酶标记的方法 肝、肾等组织肝、肾等组织内源性生物素丰富内源性生物素丰富 PAP方法方法 一般的免疫组化一般的免疫组化ABC和和SP7.显色中的一些问题显色中的一些问题 显色的停止点：显色的停止点：目的物达最深染色而背目的物达最深染色而背景无着色。显色时间过短，着色过浅；显景无着色。显色时间过短，着色过浅；显色时间
25、过长，背景着色又过深，都将影响色时间过长，背景着色又过深，都将影响结果的判断，均应避免。结果的判断，均应避免。通常显色结果以阳性对照得出最佳结果通常显色结果以阳性对照得出最佳结果的时间为标准。的时间为标准。纳米技术纳米技术物质基础：原子力显微镜物质基础：原子力显微镜纳米技术、信息技术和生物技术纳米技术、信息技术和生物技术-21世纪社会发展的三大支柱世纪社会发展的三大支柱 我国我国启动启动 01.6.29,科技部和中科院科技部和中科院“沈阳材料科学沈阳材料科学 国家（联合）实验室国家（联合）实验室”。这一装备先进。这一装备先进 的实验室将的实验室将主攻纳米级材料主攻纳米级材料 01.7（3-5)
26、,国际纳米材料项目论坛会议国际纳米材料项目论坛会议上，上，科技部将斥资科技部将斥资10亿亿支持国家纳米技术，支持国家纳米技术，资金在资金在5年内全部到位年内全部到位 纳米技术纳米技术-在在10-7-10-9m范围内，对物范围内，对物质内原子、分子的运动和变化进行研究、质内原子、分子的运动和变化进行研究、操纵和加工的技术。操纵和加工的技术。纳米纳米（nm）也即也即10-9 m。纳米技术的纳米技术的诞生，使人们认识事物的本质和变化规律诞生，使人们认识事物的本质和变化规律达原子水平。达原子水平。纳米技术最早在纳米技术最早在材料科学材料科学中应用中应用目前已取得了较大进展。目前已取得了较大进展。科学家
27、预言，纳米技术将引起下一次工业科学家预言，纳米技术将引起下一次工业革命。并发现，可用纳米管元件来代替硅革命。并发现，可用纳米管元件来代替硅芯片制造计算机。芯片制造计算机。近些年来，纳米技术在生物医学领域内应近些年来，纳米技术在生物医学领域内应用亦越来越广泛用亦越来越广泛主要应用在主要应用在生物化学、药物学生物化学、药物学等领域。等领域。预计预计21世纪将是纳米技术的世纪世纪将是纳米技术的世纪纳米技术在生物医学上的应用纳米技术在生物医学上的应用（1）基因基因的微电子诊断的微电子诊断（2）药物药物基因组学基因组学（3）生物大分子生物大分子结构与功能结构与功能（4）疾病疾病的早期诊断的早期诊断（5）单分子单分子结构结构与功能分析与功能分析（6）新型医学防护）新型医学防护材料材料（7）新型组织修复）新型组织修复装置装置（8）新型）新型药物药物研制研制