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1、第三章第三章 酶学酶学 主主要要内内容容：介介绍绍酶酶的的概概念念、作作用用特特点点和和分分类类、命命名名，讨讨论论酶酶的的结结构构特特征征和和催催化化功功能能以以及及酶酶专专一一性性及及高高效效催催化化的的策策略略，进进而而讨讨论论影影响响酶酶作作用用的的主主要要因因素素。对对酶酶工工程程和酶的应用作一般介绍。和酶的应用作一般介绍。思考思考目目 录录第一节第一节 酶的概念及作用特点酶的概念及作用特点第二节第二节 酶的命名和分类酶的命名和分类第三节第三节 酶催化作用的结构基础和酶催化作用的结构基础和 高效催化的策略高效催化的策略第四节第四节 酶促反应的动力学酶促反应的动力学第五节第五节 重要的
2、酶类及酶活性的调控重要的酶类及酶活性的调控第六节第六节 酶工程简介酶工程简介第一节第一节 酶的概念及作用特点酶的概念及作用特点一、酶及生物催化剂概念的发展、酶及生物催化剂概念的发展 极高的催化效率极高的催化效率 高度的专一性高度的专一性 易失活易失活 活性可调控活性可调控 有些酶需辅助因子有些酶需辅助因子四、四、酶专一性类型酶专一性类型 二、二、酶作用的特点酶作用的特点三、三、酶的化学本质酶的化学本质酶及生物催化剂概念的发展酶及生物催化剂概念的发展克隆酶、遗传修饰酶克隆酶、遗传修饰酶蛋白质工程新酶蛋白质工程新酶生物催化剂生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：蛋白质类：Enzyme(天然
3、酶、生物工程酶天然酶、生物工程酶)核酸类：核酸类：Ribozyme;Deoxyribozyme模拟生物催化剂模拟生物催化剂 酶专一性类型酶专一性类型1 结构专一性结构专一性 概概念念：酶酶对对所所催催化化的的分分子子（底底物物，Substrate）化化学结构的特殊要求和选择学结构的特殊要求和选择 类别类别：绝对专一性绝对专一性和相对专一性和相对专一性2 立体异构专一性立体异构专一性 概概念念：酶酶除除了了对对底底物物分分子子的的化化学学结结构构有有要要求求外外，对其立体异构也有一定的要求对其立体异构也有一定的要求 类别类别：旋光异构专一性旋光异构专一性和和几何异构专一性几何异构专一性绝对专一性
4、和相对专一性绝对专一性和相对专一性 绝对专一性绝对专一性 有的酶对底物的化学结构要求非常严格，有的酶对底物的化学结构要求非常严格，只作用于一种底物，不作用于其它任何物质。只作用于一种底物，不作用于其它任何物质。相对专一性相对专一性 有的酶对底物的化学结构要求比上述有的酶对底物的化学结构要求比上述绝对专一性略低一些，它们能作用于一类化合物或一种绝对专一性略低一些，它们能作用于一类化合物或一种化学键。化学键。1）键专一性键专一性 有的酶只作用于一定的键，而对键有的酶只作用于一定的键，而对键 两端的基团并无严格要求。两端的基团并无严格要求。2）基团专一性基团专一性 另一些酶，除要求作用于一定的键另一
5、些酶，除要求作用于一定的键以外，对键两端的基团还有一定要求，往往是对其中一以外，对键两端的基团还有一定要求，往往是对其中一个基团要求严格，对另一个基团则要求不严格个基团要求严格，对另一个基团则要求不严格。消化道内几种蛋白酶的专一性消化道内几种蛋白酶的专一性（芳香）（芳香）（硷性）（硷性）（丙）（丙）胰凝乳胰凝乳蛋白酶蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶弹性蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶羧肽酶胰蛋白酶胰蛋白酶氨肽酶氨肽酶羧肽酶羧肽酶消化道蛋白酶作用的专一性消化道蛋白酶作用的专一性据酶分子据酶分子组成分类组成分类单纯蛋白质酶类单纯蛋白质酶类结合结合蛋白质酶类蛋白质酶类酶蛋白质酶蛋白质辅助因子辅助因子金属离子金属离子金属
6、有机物金属有机物小分子有机物小分子有机物据酶蛋白据酶蛋白特征分类特征分类单体酶单体酶寡聚酶寡聚酶多酶复合体多酶复合体酶的化学本质及类别酶的化学本质及类别第二节第二节 酶的命名和分类（略讲）酶的命名和分类（略讲）一、一、命名命名：习惯命名；系统命名习惯命名；系统命名二、二、国际系统分类法及编号国际系统分类法及编号 *国国际际生生物物化化学学会会酶酶学学委委员员会会（Enzyme Commsion）将将酶酶分分成成六六大大类类：1.氧氧还还原原酶酶类类，2.移移换换酶酶类类，3.水水解解酶酶类类，4.裂裂合合酶类酶类，5.异构酶类异构酶类，6.合成酶类合成酶类 *每一种酶有一个编号每一种酶有一个编
7、号,如乙醇脱氢酶如乙醇脱氢酶 EC 1.1.1.27 大类大类 亚类亚类 亚亚类亚亚类 序号序号第三节第三节 酶催化作用的结构基础和酶催化作用的结构基础和 高效催化的策略高效催化的策略一、一、酶催化的中间产物理论酶催化的中间产物理论二、二、酶的活性中心酶的活性中心三、三、酶作用专一性机理酶作用专一性机理四、四、酶高效催化有关的策略酶高效催化有关的策略酶催化的中间产物理论酶催化的中间产物理论E+SP+EES能能量量水水平平反应过程反应过程 G E1 E2 酶（酶（E）与底物（与底物（S）结合生成不稳定的中间结合生成不稳定的中间物（物（ES），），再分解成产再分解成产物（物（P）并释放出酶，使并释
8、放出酶，使反应沿一个低活化能的反应沿一个低活化能的途径进行，降低反应所途径进行，降低反应所需活化能，所以能加快需活化能，所以能加快反应速度。反应速度。二、酶的活性中心二、酶的活性中心1、酶的活性中心和必需基团、酶的活性中心和必需基团 酶酶分分子子中中直直接接与与底底物物结结合合，并并和和酶酶催催化化作作用用直直接接有有关关的的区区域域叫叫酶酶的的活活性性中中心心（active center）或或活活性性部部位位（active site），参参与与构构成成酶酶的的活活性性中中心心和和维维持持酶酶的的特特定定构构象象所所必必需需的的基基团团为为酶分子的必需基团。酶分子的必需基团。实例；胰凝乳蛋白酶
9、（实例；胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）羧肽酶（羧肽酶（ribonuclease）2、酶的活性的研究、酶的活性的研究 活酶的专一性研究活酶的专一性研究 酶分子的化学修饰：差示标记法，亲和标记法酶分子的化学修饰：差示标记法，亲和标记法 X-射线衍射法射线衍射法AspHisSer胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶的的活活性性中中心心活性中心重要基团活性中心重要基团:His57,Asp102,Ser195为为Tyr 248为为Arg 145为为Glu 270为底物为底物ZnZn羧肽酶活性中心示意图羧肽酶活性中心示意图差差示示标标记记法法图图解解RRRRR*A.非差非差示标记示标记B.差示差示标记标记R
10、RR*R(底物底物)亲和标记法亲和标记法 根根据据酶酶与与底底物物特特异异结结合合的的性性质质，设设计计或或合合成成一一种种含含有有反反应应基基团团的的底底物物类类似似物物作作为为活活性性部部位位基基团团的的标标记记试试剂剂。这这种种试试剂剂象象底底物物一一样样进进入入活活性性部部位位，接接近近结结合合位位点点，并并以以其其活活泼泼的的化化学学基基团团与与活活性性部部位位的的某一基团共价结合，而指示出酶活性部位的特征某一基团共价结合，而指示出酶活性部位的特征。+X-Y 三、酶作用专一性机理三、酶作用专一性机理 锁锁钥钥学学说说(lock and key th0ery)：将将酶酶的的活活性性中中
11、心心比比喻喻作作锁锁孔孔，底底物物分分子子象象钥钥匙匙，底底物物能能专专一一性性地地插插入入到酶的活性中心。到酶的活性中心。诱诱导导契契合合学学说说(induced-fit hypothesis)：酶酶的的活活性性中中心心在在结结构构上上具具柔柔性性，底底物物接接近近活活性性中中心心时时，可可诱诱导导酶酶蛋蛋白白构构象象发发生生变变化化，这这样样就就使使使使酶酶活活性性中中心心有有关关基基团团正正确确排排列列和和定定向向，使使之之与与底底物物成成互互补补形形状状有有机机的的结结合而催化反应进行。合而催化反应进行。酶专一性的酶专一性的“锁钥学说锁钥学说”酶专一性的酶专一性的“诱导契合学说诱导契合
12、学说”四、酶高效催化的策略四、酶高效催化的策略 1、邻近与定向效应邻近与定向效应 2、诱导契合与底物扭曲变形诱导契合与底物扭曲变形 3、共价催化共价催化 4、酸硷催化酸硷催化 5、微环境影响、微环境影响实例实例:lysozyme chymotrypsin carboxypeptidase RNase酶分子中可作为亲核基团和酸硷催化的功能基团酶分子中可作为亲核基团和酸硷催化的功能基团ZnZnGlu270Tyr248Arg145底物底物 羧羧肽肽酶酶结结合合底底物物前前后后构构象象变变化化差差示示标标记记法法图图解解RRRRR*A.非差非差示标记示标记B.差示差示标记标记RRR*R(底物底物)溶菌
13、酶催化的反应溶菌酶催化的反应NAG:N-乙酰氨基葡萄糖乙酰氨基葡萄糖NAM:N-乙酰氨基葡萄糖乳酸乙酰氨基葡萄糖乳酸 溶菌酶溶菌酶-底物复合物底物复合物ABCDEF酶切位点酶切位点溶菌酶活性中心与底物结合示意图溶菌酶活性中心与底物结合示意图AsP52Glu35（极性区）（极性区）（非极性区）（非极性区）溶菌酶底物溶菌酶底物D环变形模型环变形模型 溶菌酶催化反应机理溶菌酶催化反应机理C1+非极性区非极性区极性区极性区HO-E环环HH2O（广义酸碱催化）（广义酸碱催化）羧肽酶活性中心羧肽酶活性中心Zn2+的中心作用的中心作用羧肽酶活性中心必需基团与羧肽酶活性中心必需基团与底物间的结合底物间的结合Z
14、nZn羧羧肽肽酶酶结结合合底底物物前前后后构构象象变变化化羧肽酶活性中心的共价催化机理羧肽酶活性中心的共价催化机理 145羧肽酶活性中心的共价催化机理羧肽酶活性中心的共价催化机理 145 RNase-底物复合物底物复合物RNase活性中心的酸硷催化机理活性中心的酸硷催化机理核糖核酸链受核糖核酸链受Rnase水解的位点水解的位点Py为嘧啶，为嘧啶，B为嘌呤为嘌呤胰凝乳蛋白酶分子胰凝乳蛋白酶分子中催化三联体构象中催化三联体构象His57Asp102Ser195Asp102His57Ser195His57102AspSer195A.酶分子中的电荷中继网酶分子中的电荷中继网B.加上底物后，从加上底物后
15、，从Ser转移一个质子给转移一个质子给His，带正电荷的咪唑基通过带负电荷的带正电荷的咪唑基通过带负电荷的Asp静电静电相互作用被稳定相互作用被稳定Ser195102AspHis57底物底物胰凝乳蛋白酶反应的详细机制胰凝乳蛋白酶反应的详细机制（1）结合底物结合底物His57 质子供体质子供体形成共价形成共价ES复合物复合物C-N键断裂键断裂底物底物胰凝乳蛋白酶反应的详细机制胰凝乳蛋白酶反应的详细机制（2）氨基产物释放氨基产物释放四面体中间物四面体中间物的瓦解的瓦解水亲核攻击水亲核攻击羧基产物释放羧基产物释放H2OR-NH2第四节第四节 酶促反应的动力学酶促反应的动力学二、影响酶作用的因素二、影
16、响酶作用的因素 1、酶浓度、酶浓度 2、底物浓度、底物浓度 3、pH 4、温度温度 5、激活剂、激活剂 6、抑制剂、抑制剂一、酶的活力与测定一、酶的活力与测定酶促反应速度的测定与酶的活力单位酶促反应速度的测定与酶的活力单位1、酶促反应速度的测定、酶促反应速度的测定 初速度的概念初速度的概念2、酶活力、酶活力3、酶活力的表示方法酶活力的表示方法4、酶活力测定方法酶活力测定方法：终点法终点法 动力学法动力学法 检测酶含量及存在，很难直接用酶的检测酶含量及存在，很难直接用酶的“量量”（质量、体积、（质量、体积、浓浓度度）来来表表示示，而而常常用用酶酶催催化化某某一一特特定定反反应应的的能能力力来来表
17、表示示酶酶量量，即用酶的活力表示。即用酶的活力表示。酶催化一定化学反应的能力称酶活力，酶活力通常以最适条酶催化一定化学反应的能力称酶活力，酶活力通常以最适条件下酶所催化的化学反应的速度来确定。件下酶所催化的化学反应的速度来确定。酶促反应初速度的概念酶促反应初速度的概念斜率斜率=P/t=V（初速度初速度）Pt酶活力测定方法酶活力测定方法 终终点点法法:酶酶反反应应进进行行到到一一定定时时间间后后终终止止其其反反应应，再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。动动力力学学法法:连连续续测测定定反反应应过过程程中中产产物物底底物物或或辅辅酶的变化量，直接
18、测定出酶反应的初速度。酶的变化量，直接测定出酶反应的初速度。酶活力的表示方法酶活力的表示方法活力单位活力单位（active unit）习惯单位（习惯单位（U）:底物底物(或产物或产物)变化量变化量/单位时间单位时间 国际单位（国际单位（IU）:1moL变化量变化量/分钟分钟 Katal（Kat）：）：1moL变化量变化量/秒秒比活力比活力=总活力单位总活力单位总蛋白总蛋白mg数数=U(或或IU)mg蛋白蛋白量度酶催化能力大小量度酶催化能力大小转换系数转换系数（Kcat）底物（底物（moL）/秒秒每个酶分子每个酶分子量度酶纯度量度酶纯度比活力比活力（specific activity）量度转换效
19、率量度转换效率2、底物浓度对酶反应速度的影响、底物浓度对酶反应速度的影响 酶反应速度与底物浓度的关系曲线酶反应速度与底物浓度的关系曲线 （MichaelisMenten曲线）曲线）米氏方程的提出及推导米氏方程的提出及推导 米氏常数的意义米氏常数的意义 米氏常数的测定米氏常数的测定单分子酶促反应的米氏方程及单分子酶促反应的米氏方程及Km推导推导原则原则：从酶被底物饱和的现象出发，按照从酶被底物饱和的现象出发，按照 “稳态平稳态平 衡衡”假说的设想进行推导。假说的设想进行推导。米氏方程米氏方程:米氏常数米氏常数:酶反应速度与底物浓度的关系曲线酶反应速度与底物浓度的关系曲线米米氏氏方方程程的的推推导
20、导令令：将将（4）代入代入（3），则，则：ES生成速度生成速度：，ES分解速度分解速度：即即：则则：(1)经整理得经整理得：由于酶促反应速度由由于酶促反应速度由ES决定，即决定，即，所以所以(2)将将（2）代入代入（1）得得：(3)当酶反应体系处于当酶反应体系处于恒态恒态时时：当当Et=ES时时，(4)所以所以 米氏常数的意义米氏常数的意义*当当v=Vmax/2时，时，Km=S（Km的单位为浓度单位）的单位为浓度单位）*是是酶酶在在一一定定条条件件下下的的特特征征物物理理常常数数，通通过过测测定定Km的的数值，可鉴别酶。数值，可鉴别酶。*可可近近似似表表示示酶酶和和底底物物亲亲合合力力，Km愈
21、愈小小，E对对S的的亲亲合合力愈大，力愈大，Km愈大，愈大，E对对S的亲合力愈小的亲合力愈小。在在已已知知Km的的情情况况下下，应应用用米米氏氏方方程程可可计计算算任任意意s时时的的v，或任何或任何v下的下的s。（。（用用Km的倍数表示）的倍数表示）练练习习题题：已已知知某某酶酶的的Km值值为为0.05mol.L-1，要要使使此此酶酶所所催催化化的的反反应速度达到最大反应速度的应速度达到最大反应速度的80时底物的浓度应为多少？时底物的浓度应为多少？米氏常数的测定米氏常数的测定 基基本本原原则则：将将米米氏氏方方程程变变化化成成相相当当于于y=ax+b的直线方程，再用作图法求出的直线方程，再用作
22、图法求出Km。例：例：双倒数作图法双倒数作图法（Lineweaver-Burk法）法）米氏方程的双倒数形式：米氏方程的双倒数形式：1 KmKm 1 1 =.+v Vmax S Vmax 酶动力学的双倒数图线酶动力学的双倒数图线3、pH对酶反应速度的影响对酶反应速度的影响 过酸过硷过酸过硷导致酶蛋白变性导致酶蛋白变性 影响底物分子解离状态影响底物分子解离状态 影响酶分子解离状态影响酶分子解离状态 影响酶的活性中心构象影响酶的活性中心构象pH最适最适 pHv4、温度与酶反应速度的关系、温度与酶反应速度的关系 在达到最适温度以前，反在达到最适温度以前，反应速度随温度升高而加快应速度随温度升高而加快
23、酶是蛋白质，其变性速度酶是蛋白质，其变性速度亦随温度上升而加快亦随温度上升而加快 酶的最适温度不是一个固酶的最适温度不是一个固定不变的常数定不变的常数v温度温度5、激活剂、激活剂对酶作用的影响对酶作用的影响类别类别 金属离子：金属离子：K+、Na+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+、Co2+、Fe2+阴离子：阴离子：Cl-、Br-有机分子有机分子 还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金属螯合剂：金属螯合剂：EDTA凡是能提高酶活性的物质，称为酶的激活剂（凡是能提高酶活性的物质，称为酶的激活剂（activator）6、抑制剂对酶作用的影响抑制
24、剂对酶作用的影响 凡凡是是使使酶酶的的必必需需基基因因或或酶酶的的活活性性部部位位中中的的基基团团的的化化学学性性质质改改变变而而降降低低酶酶活活力力甚甚至至使使酶酶完完全全丧丧失失活性的物质，叫酶的抑制剂（活性的物质，叫酶的抑制剂（inhibitor）。类型类型：可逆抑制剂可逆抑制剂 不可逆抑制剂不可逆抑制剂 应用应用：研制杀虫剂、药物研制杀虫剂、药物 研究酶的作用机理，确定代谢途径研究酶的作用机理，确定代谢途径抑制剂类型和特点抑制剂类型和特点 竞争性抑制剂竞争性抑制剂可逆抑制剂可逆抑制剂 非竞争性抑制剂非竞争性抑制剂 反竞争性抑制剂反竞争性抑制剂 非专一性不可逆抑制剂非专一性不可逆抑制剂不
25、可逆抑制剂不可逆抑制剂 专一性不可逆抑制剂专一性不可逆抑制剂+IEIESP+EE+S竞争性抑制作用竞争性抑制作用 实例：磺胺药物的药用机理实例：磺胺药物的药用机理H2N-SO2NH2对氨基苯磺酰胺对氨基苯磺酰胺H2N-COOH对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸谷氨酸谷氨酸蝶呤蝶呤叶酸叶酸非竞争性抑制作用非竞争性抑制作用+IEI+SESIESP+EE+S+I实例：重金属离子（实例：重金属离子（Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+）金属络合剂（金属络合剂（EDTA、F-、CN-、N3-）反竞争性抑制作用反竞争性抑制作用ESIESP+EE+S+I竞争性抑制作用竞争性抑制作用非竞争性抑制
26、作用非竞争性抑制作用竞竞争争性性非非竞竞争争性性抑抑制制作作用用机机理理示示意意图图底物与酶专一性结合底物与酶专一性结合竞争性抑制曲线竞争性抑制曲线非竞争性抑制曲线非竞争性抑制曲线反竞争性抑制曲线反竞争性抑制曲线有无抑制剂存在时酶促反应的动力学方程有无抑制剂存在时酶促反应的动力学方程 非专一性不可逆抑制剂非专一性不可逆抑制剂 抑抑制制剂剂作作用用于于酶酶分分子子中中的的一一类类或或几几类类基基团团，这这些些基团中包含了必需基团，因而引起酶失活。基团中包含了必需基团，因而引起酶失活。类型类型：专一性不可逆抑制剂专一性不可逆抑制剂 这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与这类抑制剂选择性很强，它只能
27、专一性地与酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活性丧失。性丧失。实例：实例：有机磷杀虫剂有机磷杀虫剂-Ser-OH-Ser-OPO-RO-ROPO-RO-ROX第五节第五节 重要的酶类及酶活性的调节控制重要的酶类及酶活性的调节控制一、多酶体系一、多酶体系(multienzyme system)二、别构酶二、别构酶(allosteric enzyme)三、共价调节酶三、共价调节酶(covalent regulatory enzyme)四、酶原四、酶原(enzymogen或或proenzyme)的激活的激活五、同工酶五、同工酶(isoenzyme)六、
28、抗体酶六、抗体酶(abzyme)一、多酶体系和多酶复合体一、多酶体系和多酶复合体 细胞中的许多酶常常是细胞中的许多酶常常是在一个连续的反应链中起在一个连续的反应链中起作用，即前一个反应的产作用，即前一个反应的产物是后一个反应的底物，物是后一个反应的底物，在完整细胞内的某一代谢在完整细胞内的某一代谢过程中，由几个酶形成的过程中，由几个酶形成的反应体系，称为多酶体系反应体系，称为多酶体系（multienzyme system）。）。如果如果体系中几种酶彼此体系中几种酶彼此有机地组合在一起。精巧有机地组合在一起。精巧地镶嵌成一定的结构，即地镶嵌成一定的结构，即形成形成多酶复合体多酶复合体。这种结。这
29、种结构即能提高反应途径的效构即能提高反应途径的效率，又能增强调控的准确率，又能增强调控的准确性。性。分散多酶体系与中分散多酶体系与中间物示意图间物示意图多酶复合体示意图多酶复合体示意图二、酶的别构（变构）效应和别构酶二、酶的别构（变构）效应和别构酶 概概念念：酶酶分分子子的的非非催催化化部部位位与与某某些些化化合合物物可可逆逆地地非非共共价价结结合合后后导导致致酶酶分分子子发发生生构构象象改改变变，进进而而改改变变酶酶的的活活性性状状态态，称称为为酶酶的的别别构构调调节节(allosteric regulation)，具具有有这这种种调调节节作作用用的的酶酶称称别别构构酶酶(allosteri
30、c enzyme)。别别构构酶酶促反应底物浓度和反应速度的关系不符合米氏方程，呈促反应底物浓度和反应速度的关系不符合米氏方程，呈S型曲线型曲线。凡凡能能使使酶酶分分子子发发生生别别构构作作用用的的物物质质称称为为效效应应物物(effector)，通通常常为为小小分分子子代代谢谢物物或或辅辅因因子子。如如因因别别构构导导致致酶酶活活性性增增加加的的物物质质称称为为正正效效应应物物(positive effector)或别构激活剂，反之称负效应物或别构激活剂，反之称负效应物(negative effector)或别构抑制剂。或别构抑制剂。别别构构调调节节普普遍遍存存在在于于生生物物界界，许许多多代
31、代谢谢途途径径的的关关键键酶酶利利用用别别构构调调节节来来控控制代谢途径之间的平衡，研究别构调控有重要的生物学意义。制代谢途径之间的平衡，研究别构调控有重要的生物学意义。实例实例：天冬氨酸转氨甲酰酶：天冬氨酸转氨甲酰酶 （anspartate transcarbamoylase，ATCase）别构酶活性调节机理别构酶活性调节机理：序变模型和齐变模型：序变模型和齐变模型酶的别构（变构）效应示意图酶的别构（变构）效应示意图效应剂效应剂别别构构中中心心活性活性中心中心别构酶的反馈调控机理别构酶的反馈调控机理A（产物或中间产物）产物或中间产物）EDCB关键酶关键酶 a-非调节酶非调节酶 b-正协同别构
32、酶正协同别构酶 的的S形曲线形曲线 别构酶与米氏酶的动力学曲线比较别构酶与米氏酶的动力学曲线比较1-非调节酶非调节酶2-正协同别构酶正协同别构酶3-负协同别构酶负协同别构酶 正、负协同别构酶与非调节酶的动力学曲线比较正、负协同别构酶与非调节酶的动力学曲线比较ATCaseATP+ATCase所催化的反应所催化的反应氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸天冬氨酸天冬氨酸CTP-UTPUMP氨甲酰天冬氨酸氨甲酰天冬氨酸E.coli的的ATCase的亚基排列的亚基排列催化催化(C)亚基（亚基（catalytic subunit）调节调节(R)亚基（亚基（regulative subunit）ATCase的半分子结构AT
33、Case半分子半分子（C3R3)的结构的结构CTP sitecatalytic siteATCase aloneATCase-PALA plex ATCase的的别构过度作用别构过度作用低催化活性构象低催化活性构象T(tense)-态态CCCCCC R R R R R RCCCCCC高催化活性构象高催化活性构象R(relax)-态态R RR RR RPALAPALAPALA(N-磷乙酰磷乙酰-L-天冬氨酸天冬氨酸)结合到结合到ATCase活性中心的模型活性中心的模型ATCase变构效应的动力学特征变构效应的动力学特征ATP（正效应剂）正效应剂）CTP（负效应剂）负效应剂）低催化活性构象低催化活
34、性构象T(tense)-态态CCCCCC R R R R R RCCCCCC高催化活性构象高催化活性构象R(relax)-态态R RR RR RVmax1/2VmaxKm别构酶的序变模型别构酶的序变模型SS SS SSSSSSSSSS亚基全部亚基全部处于处于R型型亚基全部亚基全部处于处于T型型依次序变化依次序变化别构酶的齐变模型别构酶的齐变模型S SSSS SSS SST状态（对称亚基）状态（对称亚基）T状态（对称亚基）状态（对称亚基）SSSS对称亚基对称亚基对称亚基对称亚基齐步变化齐步变化三、酶的共价修饰三、酶的共价修饰 某某些些酶酶可可以以通通过过其其它它酶酶对对其其多多肽肽链链上上某某些
35、些基基团团进进行行可可逆逆的的共共价价修修饰饰，使使其其处处于于活活性性与与非非活活性性的的互互变变状状态态，从从而而调调节节酶酶活活性性。这这类类酶酶称称为为共共价价修修饰饰酶酶。目目前前发发现现有有数数百百种种酶酶被被翻翻译译后后都都要要进进行行共共价价修修饰饰，其其中中一一部部分分处处于于分分支支代代谢谢途途径径，成成为为对对代代谢谢流流量量起调节作用的起调节作用的关键酶或限速酶关键酶或限速酶。由由于于这这种种调调节节的的生生理理意意义义广广泛泛，反反应应灵灵敏敏，节节约约能能量量，机机制制多多样样，在在体体内内显显得得十十分分灵灵活活，加加之之它它们们常常受受激激素素甚甚至至神神经经的
36、的指指令令，导导致致级级联联放放大大反反应应，所以日益引人注目。所以日益引人注目。AP1GEDCBHEa-bEc-dEc-g关键酶（限速酶）关键酶（限速酶）P2蛋白质的磷酸化和脱磷酸化蛋白质的磷酸化和脱磷酸化 蛋白激酶蛋白激酶ATPADP蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质Pn蛋白磷酸酶蛋白磷酸酶nPiH2O第一类：第一类：第一类：第一类：Ser/ThrSer/Thr型型型型第二类：第二类：第二类：第二类：TyrTyr型型型型 第一类：第一类：第一类：第一类：Ser/ThrSer/Thr型型型型 第二类：第二类：第二类：第二类：TyrTyr型型型型 第三类：双重底物型第三类：双重底物型第三类：双重底物型第
37、三类：双重底物型反应类型反应类型 共价修饰共价修饰 被修饰的氨基酸残基被修饰的氨基酸残基共共价价修修饰饰反反应应的的例例子子磷酸化磷酸化腺苷酰化腺苷酰化尿苷酰化尿苷酰化Tyr,Ser,Thr.HisTyrTyr甲基化甲基化GluS-腺苷腺苷-MetS-腺苷腺苷-同型同型 Cys 级联系统调控级联系统调控糖原分解示意图糖原分解示意图意义意义：由于由于酶的共价修饰酶的共价修饰反应是酶促反反应是酶促反应，只要有少应，只要有少量信号分子量信号分子（如激素）存（如激素）存在，即可通过在，即可通过加速这种酶促加速这种酶促反应，而使大反应，而使大量的另一种酶量的另一种酶发生化学修饰，发生化学修饰，从而获得放
38、大从而获得放大效应。这种调效应。这种调节方式快速、节方式快速、效率极高。效率极高。肾上腺素或肾上腺素或胰高血糖素胰高血糖素1、腺苷酸环化酶、腺苷酸环化酶（无活性）（无活性）腺苷酸环化酶（活性）腺苷酸环化酶（活性）2、ATPcAMPR、cAMP3、蛋白激酶、蛋白激酶（无活性）（无活性）蛋白激酶（活性）蛋白激酶（活性）4、磷酸化酶激酶、磷酸化酶激酶（无活性）（无活性）磷酸化酶激酶（活性）磷酸化酶激酶（活性）5、磷酸化酶、磷酸化酶 b（无活性）无活性）磷酸化酶磷酸化酶 a（活性）活性）6、糖原、糖原6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖1-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖葡萄糖葡萄糖血液血液ATP ADPATP ADP肾上腺
39、素或肾上腺素或胰高血糖素胰高血糖素132 102 104 106 108葡萄糖葡萄糖456（极微量）（极微量）（大量）（大量）四、酶四、酶 原原 的的 激激 活活 体体内内合合成成出出来来的的酶酶，有有时时不不具具有有生生物物活活性性，经经过过蛋蛋白白水水解解酶酶专专一一作作用用后后，构构象象发发生生变变化化，形形成成活活性性中中心心，变变成成有有活活性性的的酶酶。这这个个不不具具活活性性的的蛋蛋白白质质称称为为酶酶原原（zymogen或或proenzyme），这这个个过过程程称称为为酶酶原原的的激激活。活。该该变变化化过过程程，是是生生物物体体的的一一种种调调控控机机制制。这这种种调调控控作
40、作用用的的特特点点是是，蛋蛋白白质质由由 无无活活性性状状态态转转变变成成活活性性状状态态是不可逆的。是不可逆的。实例实例：消化系统蛋白酶原的激活：消化系统蛋白酶原的激活 凝血机制（自学）凝血机制（自学）胰蛋白酶原胰蛋白酶原胰蛋白酶胰蛋白酶六肽六肽肠肠激激酶酶活性中心活性中心胰蛋白酶原的激活示意图胰蛋白酶原的激活示意图胰蛋白酶原胰蛋白酶原胰蛋白酶胰蛋白酶六肽六肽肠肠激激酶酶胰蛋白酶对各种胰脏蛋白酶的激活作用胰蛋白酶对各种胰脏蛋白酶的激活作用胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶原弹性蛋白酶原弹性蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶原羧肽酶原羧肽酶羧肽酶五、酶的多种分子形式五、酶的多种
41、分子形式同工酶同工酶 概概念念：存存在在于于同同一一种种属属或或不不同同种种属属，同同一一个个体体的的不不同同组组织织或或同同一一组组织织、同同一一细细胞胞，具具有有不不同同分分子子形形式式但但却却能能催催化化相相同同的的化化学学反反应应的的一一组组酶酶，称称之之为为同同工工酶酶（isoenzymeisoenzyme）。乳乳酸酸脱脱氢氢酶酶是是研研究究的的最多的同工酶。最多的同工酶。生物学功能：生物学功能：遗传的标志遗传的标志 和个体发育及组织分化密切相关和个体发育及组织分化密切相关 适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要 在各学科中的在各学科中的
42、应用应用乳酸脱氢酶同工酶形成示意图乳酸脱氢酶同工酶形成示意图多肽多肽亚基亚基mRNA四聚体四聚体结构基因结构基因a b乳酸脱氢酶同乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱工酶电泳图谱+H4MH3M2H2M3HM4点样线点样线不同组织中不同组织中LDH同工酶的电泳图谱同工酶的电泳图谱LDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M4)心肌心肌 肾肾 肝肝 骨骼肌骨骼肌 血清血清-+原点原点胰蛋白酶原胰蛋白酶原胰蛋白酶胰蛋白酶六肽六肽肠肠激激酶酶胰蛋白酶对各种胰脏蛋白酶的激活作用胰蛋白酶对各种胰脏蛋白酶的激活作用胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶原弹
43、性蛋白酶原弹性蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶原羧肽酶原羧肽酶羧肽酶同工酶在各学科中的应用同工酶在各学科中的应用 (1)遗传学和分类学遗传学和分类学：提供了一种精良的判别遗传标志的工具。：提供了一种精良的判别遗传标志的工具。(2)发育学发育学：有效地标志细胞类型及细胞在不同条件下的分化情：有效地标志细胞类型及细胞在不同条件下的分化情况，以及个体发育和系统发育的关系。况，以及个体发育和系统发育的关系。(3)生物化学和生理学生物化学和生理学：根据不同器官组织中同工酶的动力学、：根据不同器官组织中同工酶的动力学、底物专一性、辅助因子专一性、酶的变构性等性质的差异，从而底物专一性、辅助因子专一性、酶的变构性等性
44、质的差异，从而解释它们代谢功能的差别。解释它们代谢功能的差别。（4）医学和临床诊断医学和临床诊断：体内同工酶的变化，可看作机体组织损：体内同工酶的变化，可看作机体组织损伤，或遗传缺陷，或肿瘤分化的的分子标志。伤，或遗传缺陷，或肿瘤分化的的分子标志。六、六、抗体酶抗体酶 抗抗体体酶酶（abzyme）又又称称催催化化抗抗体体（catalytic antibody）,是是指指通通过过一一系系列列化化学学与与生生物物技技术术方方法法制制备备出出的的具具有有催催化化活活性性的的抗抗体体，它它除除了了具具有有相相应应免疫学性质，还类似于酶，能催化某种活化反应。免疫学性质，还类似于酶，能催化某种活化反应。抗
45、抗体体与与酶酶相相似似，都都是是蛋蛋白白质质分分子子，酶酶与与底底物物的的结结合合及及抗抗体体与与抗抗原原的的结结合合都都是是高高度度专专一一性性的的，但但这这两两种种结结合合的的基基本本区区别别在在于于酶酶与与高高能能的的过过度度态态分分子子向向结结合合，而而抗抗体体则则与与抗抗原原（基基态态分分子子）相相结结合合。利利用用抗抗体体能能与与抗抗原原特特异异结结合合的的原原理理可可用用过过度度态态类类似似物物作作为为半半抗抗原原来来诱诱发发抗抗体体，这这样样产产生生的的抗抗体体便便能能特特异异地地识识别别反反应应过过程程中中真真正正的的过过渡渡分分子子，从从而而降降低低反反应应的的活活化化能能
46、。达达到到催化反应的目的，这种具有催化功能的抗体就被称为催化抗体或抗体酶。催化反应的目的，这种具有催化功能的抗体就被称为催化抗体或抗体酶。O C A.酯酶的底酯酶的底物物酯酯B.酯的羧基碳酯的羧基碳原子受到亲核原子受到亲核攻击形成四面攻击形成四面体过渡态体过渡态C.设计的磷酸设计的磷酸酯类似物酯类似物,作作为抗原去免疫为抗原去免疫实验动物实验动物磷酸酯类似物磷酸酯类似物(半抗原半抗原)对酯水解反应有催化对酯水解反应有催化作用的单克隆作用的单克隆抗体抗体免疫免疫免疫反应免疫反应诱导法制备具有酯酶活性的抗体诱导法制备具有酯酶活性的抗体基因工程抗体酶的制备基因工程抗体酶的制备 对对已已产产生生的的单
47、单抗抗，分分析析氨氨基基酸酸的的组组成成或或相相应应基基因因的的碱碱基基序序列列，对对抗抗体体结结合合的的部部位位的的基基因因进进行行定定位位突突变变，在在抗抗体体结结合合部部位位换换上上有有催催化化活活性性的的氨氨基基酸酸，基基因因工工程程的的技技术术使使得得建建立立抗抗体体基基因因的的组组合合文文库库，并并根根据据需需要要构构建建适适当当程序的基因片段成为可能。程序的基因片段成为可能。抗体酶的筛选抗体酶的筛选 在在抗抗体体酶酶研研究究中中，一一个个不不可可少少的的步步骤骤是是在在细细胞胞融融合合后后筛筛选选到到能能分分泌泌催催化化抗抗体体的的细细胞胞克克隆隆。一一般般的的方方法法是是先先筛
48、筛选选其其抗抗体体能能结结合合特特异异抗抗原原的的细细胞胞克克隆隆，再再从从纯纯化化的的抗抗体体中中筛筛选选出出有有催催化化能能力力的的单单抗抗。主主要要筛筛选选方方法法有有生生物物学学筛筛选选法法和和纯纯化学筛选法化学筛选法。抗体酶的研究和应用前景抗体酶的研究和应用前景 催催化化抗抗体体的的出出现现不不仅仅为为人人们们开开创创了了一一条条人人工工设设计计酶酶的的新新方方法法，也也使使人人们们对对催催化化过过程程中中催催化化剂剂的的作作用用机机理理和和催催化化剂剂和底物的相互识别有了进一步认识。和底物的相互识别有了进一步认识。目目前前已已经经发发现现具具有有催催化化作作用用的的自自身身抗抗体体
49、在在生生物物体体内内的的存存在在，其其不不仅仅和和疾疾病病相相关关，可可能能还还参参与与了了生生物物体体内内的的某某些些或或基本的生物学反应。有可能成为抗体酶研究的新热点。基本的生物学反应。有可能成为抗体酶研究的新热点。充充分分利利用用抗抗体体的的种种类类繁繁多多以以及及抗抗体体酶酶的的可可诱诱导导、可可改改造造的的特特点点，可可望望制制备备出出具具有有治治疗疗和和辅辅助助治治疗疗某某些些疾疾病病或或催催化化某类具有特殊意义反应的抗体酶。某类具有特殊意义反应的抗体酶。抗抗体体酶酶的的研研究究无无疑疑会会对对化化学学、生生物物学学、医医学学等等领领域域产产生生深远影响。深远影响。第六节第六节 酶
50、工程简介酶工程简介一、化学酶工程一、化学酶工程 天然酶天然酶 固定化酶固定化酶 化学修饰酶化学修饰酶 人工模拟酶人工模拟酶二、生物酶工程二、生物酶工程 克隆酶克隆酶 突变酶突变酶 新酶新酶 将酶学和工程学相结将酶学和工程学相结合，产生了酶工程合，产生了酶工程(enzyme engineering)这这样一个新的领域。酶工样一个新的领域。酶工程主要研究酶的生产、程主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的生和理论研究等方面的应用应用。固定化酶固定化酶 将将水水溶溶性性酶酶用用物物理