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1、结核病实验室检测新诊断技术介绍省结核病参比实验室 省结核病参比实验室 杨丹丹 杨丹丹n n 发光二极管荧光显微镜（LED）方法n n 液基夹层杯技术 n n 线性探针耐多药检测技术（HAIN）n n 基因芯片耐多药检测技术（GENECHIP）n n TB 和利福平耐药快速分子鉴定（X-Pert）一、发光二极管荧光显微镜（LED）方法n n 适用范围：痰涂片镜检n n 所需试剂/仪器：LED 显微镜、荧光染色液n n 中盖项目：淮安市（淮阴区、楚州区）n n 原理：发光二极管荧光显微镜（发光二极管荧光显微镜（LEDLED）镜下视野镜下视野发光二极管荧光显微镜（LED）不需要加热玻片，步骤简单 不
2、需要加热玻片，步骤简单视野比普通的显微镜大大 视野比普通的显微镜大大2-4 2-4 倍 倍 对数目少的不必使用镜油 对数目少的不必使用镜油 节 节 省 省 人 人 力 力 时 时 间 间，时 时 间 间 为 为 普 普 通 通 的 的1/4 1/4 每 每 天 天 可 可 检 检 查 查 至 至 少 少60 60 个 个 涂 涂片 片 可帮助早期诊断肺结核 可帮助早期诊断肺结核 即使菌浓度较低 即使菌浓度较低 杆 杆 菌 菌 也 也 有 有 很 很 高 高 的 的 灵 灵 敏 敏 度 度，与 与ZN ZN 相 相 比 比 阳 阳 性 性 发 发 现 现 率 率 平 平 均 均 增 增 加 加1
3、0%10%不需要空调设施不需要空调设施n n不需要暗室不需要暗室n n诊断性能优于标准荧光显微镜诊断性能优于标准荧光显微镜n n寿命长（寿命长（15-20,000 15-20,000小时）小时）n n荧光染色液有致癌作用，推荐自动染色机。荧光染色液有致癌作用，推荐自动染色机。n n涂片需避光低温保存。涂片需避光低温保存。n n需加强操作人员的培训和质量控制。需加强操作人员的培训和质量控制。成本低廉，价格低于成本低廉，价格低于现现有的光学有的光学显显微微镜镜。n n适合县、乡级基层实验室使用。适合县、乡级基层实验室使用。二、液基夹层杯技术 n n 适用范围：痰涂片镜检n n 十一五国家重大科技专
4、项：泰兴、江阴n n 厂家：湖南天骑公司n n 原理：集菌法n n 流程图n n 痰标本消化灭活 基片的夹层杯n n 离心 细菌附着在基片 在夹层杯中直接染色 取出基片 于载玻片上 镜检 自动阅片计算机报告系统。所需仪器设备：普通的抗酸染色液、彭氏杯（专利）、涂片机、KP21 型快速干片机、抗酸杆菌自动阅片计算机报告系统。阳性检出率标本及性状 液基法 直涂法754份痰标本 23.50%16.80%脓性痰47.50%40.90%非脓性痰13.50%4.66%即时痰20.48%15.06%夜间痰25.6%17.01%n n 重大专项：泰兴、江阴地区部分实验结果比较三、线性探针耐多药检测方法（HAI
5、N）n n适用范围：适用范围：n n11、TBTB的诊断的诊断n n22、一线抗结核药物耐药诊断、一线抗结核药物耐药诊断n n33、二线抗结核药物耐药的诊断、二线抗结核药物耐药的诊断n n44、目前，利福平（、目前，利福平（rpoBrpoB基因）基因）、异烟肼（、异烟肼（KatKat基基因、因、inhAinhA基因）耐药的诊断基因）耐药的诊断n n所需仪器设备：生安柜、超声振荡仪、所需仪器设备：生安柜、超声振荡仪、PCRPCR扩增扩增仪、可调温振荡仪仪、可调温振荡仪n n 原理：基于分子生物学扩增技术。n n rpoB 基因突变位点有：4 个n n Kat 基因、inhA 基因突变位点有：2
6、个、4 个正确流程杂交PCRDNA 提取MIX 制备痰液前处理操作步骤n n一、痰标本处理一、痰标本处理n n去污染前处理液：氢氧化钠去污染前处理液：氢氧化钠+柠檬酸三钠柠檬酸三钠+N-+N-乙乙酰半胱氨酸。酰半胱氨酸。n n痰标本痰标本+等体积去污染前处理液：振荡等体积去污染前处理液：振荡-离心离心-静静置置-PBS-PBS清洗清洗-离心离心-留取沉淀。留取沉淀。n n二、二、DNADNA提取提取n n处理后痰标本沉淀处理后痰标本沉淀：95C95C孵育孵育-超声裂解超声裂解-取上取上清液用于清液用于PCRPCR扩增。扩增。n n三、扩增产物杂交三、扩增产物杂交n nPCRPCR产物变性，与探
7、针试条上的标记突变位点杂产物变性，与探针试条上的标记突变位点杂交，标记物显色。交，标记物显色。四、结果判读试剂质控 试剂质控位点质控 位点质控HAIN 和目前常规药敏方法比较比较项目 HAIN 常规药敏方法时间 1-2 天 2-3 个月生物安全级别要求 较低 二级实验室人员培训 2-3 天 2-3 个月操作简易程度 简单 复杂仪器设备 性价比较高-对环境洁净度要求 较高，易出现假阳性较高n n 适用范围：n n 1、TB 复合群鉴定。n n 2、TB 菌种鉴定。n n 3、利福平和异烟肼耐药检测。n n 原理：多重PCR 扩增和反向杂交来识别。四、GENECHIP 基因芯片耐多药检测技术基因芯
8、片n 将核酸片段有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚n 丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二n 维分子排列。n 采用光导原位合成或微量点样等方法。n 然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交。n 通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。n，耐药检测基因芯片n n 基因芯片是基于特定基因位点突变与耐药性的相关性，通过PCR 扩增和核酸杂交技术，检测荧光信号的有无，判断特定位点的突变情况和细菌耐药性的检测方法。n n 结核分枝杆菌耐药检测基因芯片基于rpoB/katG/inhA 的基因突变，快速
9、检测分离株或者痰样本中结核杆菌耐药性（利福平、异烟肼）。n rpoB 基因突变位点：13 个位点。n katG 基因突变位点：2 个位点。n/inhA 基因突变位点：2 个突变位点。耐药分子诊断的基本原理n n 操作较复杂。n n 特异度与灵敏度不高。n n 基因芯片耐多药检测试剂已获得欧盟体外诊断试剂证书（CE-IVD）。n n 中国药品食品监督管理局的医疗器械证书。n n 可以作为临床耐药结核病临床诊断和治疗的依据。五、结核和利福平耐药的快速分子鉴定（x-pert）n n 适用范围：n n 1、TB 复合群鉴定。n n 2、利福平耐药检测。n n 原理：多重PCR 扩增和反向杂交来识别。n
10、 n 可以在2 小时出报告结果。实验室方法n n 痰标本的前处理：同前方法。n n 试剂加入去污处理的痰标本中。n n 室温下手工晃动密闭痰盒，15 分钟内2 次，然后取2ml 灭活后的物质加入检测盒(其内含相当于0.7ml 未处理痰液或0.5ml 已去污处理的痰液)，检测盒放入检测平台。n n MTB/RIF 检测系统直接输出电子结果。实验室方法n n阳性培养物经阳性培养物经MPT64MPT64抗原检测以确定其是否属于抗原检测以确定其是否属于结核分枝杆菌菌属。结核分枝杆菌菌属。n nL-JL-J培养基比例法药敏培养基比例法药敏/MIGT/MIGT 快速药敏法。快速药敏法。n n常规的常规的D
11、NADNA核酸扩增核酸扩增n nhainhain方法检测耐药方法检测耐药实验室方法n n 试剂分别按2:1 和3:1 加入未经处理的痰标本和去污处理的痰标本中。n n 室温下手工晃动密闭痰盒，15 分钟内2 次，然后取2ml 灭活后的物质加入检测盒(其内含相当于0.7ml 未处理痰液或0.5ml 已去污处理的痰液)，检测盒放入检测平台。n n MTB/RIF 检测系统直接输出电子结果。灵敏度特异度培阳97.60%-涂阳培阳99.80%-涂阴培阳90.20%-检测一份标本72.50%99.20%检测两份标本85.10%98.60%检测三份标本90.20%98.10%检测HIV合并感染93.90%
12、-检测HIVTB98.40%-与HAIN 比较无差异无差异与PCR 比较高 无差异灵敏度 特异度21 1 例利福平耐药 99.10%506例利福平敏感 100%讨论 n n 该检测方法适用于低收入国家精确诊断肺结核并能够进行福平耐药筛选的快速检测方法。n n 以培养方法作金标准，该方法可以检测出97%以上的肺结核患者，包括90%的涂阴病人。n n 南非有60%-80%的人感染HIV，鉴于合并HIV+TB 阳性出率较低，尤其HIV+TB-，MTB/RIF 有较高的检出率。讨论n n MTB/RIF 优点：简单、安全n n 标本处理简单，操作方便，检测全自动，2小时内出结果，机器判读，结果精确，减
13、少核酸污染。n n 该检测方法产生的气溶胶无传染性。n n 对实验室生物安全级别要求较低，可以在基层开展（从生物安全要求出发），由于较快速，可以减少诊断延迟，检测更多标本。讨论n nMTB/RIFMTB/RIF缺点：缺点：n n基层实验室人员培训、温度控制、电力保障、是基层实验室人员培训、温度控制、电力保障、是否到位。否到位。n n但是每年一次的仪器校准对于基层实验室是个挑但是每年一次的仪器校准对于基层实验室是个挑战，不过已经大量开展能否在基层实验室应用的战，不过已经大量开展能否在基层实验室应用的验证了。验证了。n n技术尖端，生产费用较高。尽管基金会试图通过技术尖端，生产费用较高。尽管基金会试图通过谈判降低价格和低检测费用，但仍会比显微镜价谈判降低价格和低检测费用，但仍会比显微镜价格要高，但比培养和药敏检测仪器要便宜。格要高，但比培养和药敏检测仪器要便宜。