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1、第二章 克隆技术第二节 植物的克隆植物克隆的技术基础：植物组织培养植物细胞全能性：植物体的每个生活细胞都具有遗传上的全能性，因而具有发育成完整植株的潜能。细胞全能性的比较：受精卵生殖细胞体细胞植物细胞动物细胞分化程度低的细胞分化程度高的细胞为什么植物细胞具有全能性？细胞具有发育成完整个体所需要的全套基因植物组织培养的理论基础（原理）：细胞的全能性 以下不能说明细胞全能性的实验是:A、胡萝卜韧皮部细胞培育出植株B、紫色糯性玉米种子培育出植株C、转入抗虫基因的棉花细胞培育出植株D、番茄与马铃薯体细胞杂交后培育出的植株在生物体内，细胞没有表现出全能性，而是分化为不同的组织、器官，是因为：A、细胞丧失
2、了全能性 B、基因的表达有选择性 C、不同的细胞内基因不完全相同 D、在个体发育的不同时期，细胞内的基因发生了变化 B细胞离体、一定的营养物质、生长调节剂、无菌等其他外界条件必要条件：、配置半固体培养基、获取植物组织、获得愈伤组织、培育新植株植物组织培养程序 成分？植物组织培养的一般程序：脱分化愈伤组织：相对没有分化的活的薄壁细胞团组成的新生组织再分化调节营养物质和生长调节剂的适当配比（P24）诱导根、芽顶端分生组织离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织根、芽小植株外植体脱分化植物激素：细胞分裂素、生长素等再分化植物组织培养植物组织培养条件：一定的营养物质和植物生长调节剂、一定的温度、空气、无菌环
3、境、适合的PH、适时光照等。获得产物如：紫草素植物组织培养的一般程序：脱分化通过悬浮培养分散成单细胞细胞质丰富、液泡小而细胞核大（胚性细胞的特征）再分化调节营养物质和生长调节剂的适当配比（P24）包裹人工种皮，形成人工种子胚状体人工种皮相当于什么？离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织胚状体小植株外植体脱分化植物激素：细胞分裂素、生长素等再分化植物组织培养单细胞通过悬浮培养分散成包以人工种皮，形成人工种子下列有关植物组织培养过程中细胞脱分化的说法，不正确的是A、已经分化的细胞失去特有的结构和功能而转变成未分化的细胞的过程B、已经分化的细胞转变为具有分生能力的薄壁细胞，进而形成植物愈伤组织的过程C、
4、离体的植物组织在一定的条件下分化出根和芽的过程D、离体的植物组织在脱分化形成愈伤组织的过程中必须经过有关激素的诱导植物组织培养形成的愈伤组织进行培养，又可以分化形成根、芽等器官，这一过程称为：A、脱分化 B、去分化 C、再分化 D、脱分化或去分化下列不能作为植物组织培养的材料是：A、秋海棠的叶 B、马铃薯的块茎C、成熟的花粉 D、木质部中的导管细胞CD植物组培小诗n n植物细胞本领强植物细胞本领强n n离体状态能生长离体状态能生长n n无菌人工控制下无菌人工控制下n n培养基上显风光培养基上显风光n n器官组织和细胞器官组织和细胞n n脱分化后成愈伤脱分化后成愈伤n n再分化后芽根壮再分化后芽
5、根壮n n养成完整植株体养成完整植株体n n多亏全能性来帮忙多亏全能性来帮忙植物组织培养有性生殖离体的花粉粒 单倍体体细胞（根、茎、叶）正常植株克隆植物细胞全能性的体现：几乎所有植物细胞都可注：细胞全能性表达程度受植物种类和基 因型的影响植物克隆成功的条件：1、深入探讨特定植物细胞全能性的表达条件2、尽量选择性状优良、细胞全能性表达充分的 基因型细胞培养和器官培养：愈伤组织细胞芽和根的分生组织完整植株 愈伤组织细胞单细胞细胞团球形胚心形胚胚状体完整植株 愈伤组织器官 器官发生和形态建成主要是通过平衡的植物激素配比进行调控。植物细胞培养和器官培养的主要意义：（P25）激素调控：生长素含量高于细胞
6、分裂素时，主要诱导植物组织脱分化和根原基的形成；当细胞分裂素的效应高于生长素时，主要诱导植物组织再分化和芽原基的形成。、可以在实验室环境进行植物受精过程和植物胚胎发育过程，以及调节控制这些过程的环境因素、遗传基础和分子及生理生化机理研究；、可以进行遗传工程的操作，完成与植物生长发育有关的重要基因或影响因素的研究；、可以通过实验手段培育植物新品种。植物细胞培养和器官培养的意义原生质体培养与植物细胞工程2、获得原生质体 的方法：纤维素酶和果胶酶溶液处理3、原理：细胞壁主要成分纤维素和果胶1、原生质体：细胞中有代谢活性的部分，包括质膜、细胞质、细胞核3、植物细胞工程：植物细胞个体植物细胞原生质体个体
7、转基因细胞个体重组细胞个体花粉细胞单倍体个体植物细胞杂交酶解法（纤维素酶、果胶酶）意义：克服远缘杂交不亲和的障碍，培育出作物新品种。杂种细胞形成的标志杂种细胞的类型？植物组织培养杂种植株是几倍体？融合方法？多途径的植物克隆实践：P25植物克隆的发展：1、探索阶段2、奠基阶段3、成熟发展阶段第二章 克隆技术第三节 动物的克隆动物细胞与组织培养细胞克隆单克隆抗体细胞核移植动物的克隆常用技术动物细胞融合动物细胞与组织培养是动物克隆的技术基础动物克隆的技术基础：动物细胞和组织培养细胞生物学的主要技术基础：细胞培养动物细胞培养的原理：细胞增殖细胞工程（细胞生物学）的主要技术手段：细胞培养和细胞融合细胞工
8、程：细胞水平上的生物工程（P31）动物细胞的培养和克隆的形成当一个人烧伤需要皮肤移植的时候,最好移植谁的?1、自己2、同卵双胞胎兄弟或姐妹3、父母4、一般兄弟或姐妹5、其他人动物细胞培养过程：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液机械消化胰蛋白酶消化10代细胞原代培养50代细胞传代培养无限传代单个细胞加培养液（分解弹性纤维）分装成多个培养瓶接触抑制成分？为什么？n n 原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。n n 传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。动物组织
9、培养技术的发展细胞系和细胞株细胞系：可连续传代是细胞细胞系种类：1、连续细胞系：原代培养物在首次传代时就成为细胞系，能连续培养下去的细胞系2、有限细胞系：原代培养物在首次传代时就成为细胞系，不能连续培养下去的细胞系原因：发生转化，大多数具有异倍体核型如：恶性细胞系（具有异体致瘤性）获得不死性（保留接触抑制，不致癌）细胞株：通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞细胞株的特点：具有恒定的染色体组型、同功酶类型、病毒敏感性和生化特性等细胞株的种类：1、连续细胞株：可连续多次传代2、有限细胞株：可连续次数有限细胞系和细胞株细胞系泛指可传代的细胞，细胞株是具有特殊性质的
10、细胞系动物组织培养：（P28）动物组织在体外及人工条件下维持生活状态或生长特性。动物细胞培养和动物组织培养：可以统称为组织培养获得细胞细胞的全能性细胞株、细胞系植物体培养结果或细胞分泌蛋白快速繁殖、培育无病毒植株等培养目的葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素培养基特有成分液体培养基 固体培养基培养基性质细胞增殖原理动物细胞培养 植物组织培养 比较项目植物组织培养和动物细胞培养的比较具 体应用得到动 物 组 织 培 养胚胎或幼龄动物的脏器单 个 细 胞机械消化、胰蛋白酶消化原 代 培养培养液 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等传代培养大量的组织细胞(构成组织或器官)修复受损皮肤、器官等细胞株或
11、细胞系动 物 组 织 培 养胚胎或幼龄动物的脏器单 个 细 胞机械消化、胰蛋白酶消化原 代 培养培养液 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等传代培养药物研究治疗癌症的药物及其疗效某物质检测有毒物质、致癌物质等细胞株或细胞系n n20052005年年44月月,美国一家非官方癌症研究中心发布信息说美国一家非官方癌症研究中心发布信息说,“,“高露洁高露洁”牙膏中含有的抗菌化学物质三氯生可能是牙膏中含有的抗菌化学物质三氯生可能是致癌物质。公众对此表示怀疑。科研人员欲采用一定致癌物质。公众对此表示怀疑。科研人员欲采用一定的技术手段探究三氯生对人体是否有危害。请回答：的技术手段探究三氯生对人体是否有
12、危害。请回答：11、根据所学的动物细胞工程知识，采取下列哪种技术手、根据所学的动物细胞工程知识，采取下列哪种技术手段最合适段最合适AA、动物细胞融合、动物细胞融合BB、动物细胞培养、动物细胞培养CC、胚胎移植、胚胎移植DD、核移植、核移植22、根据上述选择，请你设计一个实验来探究、根据上述选择，请你设计一个实验来探究“三氯生三氯生”对人体是否有危害。对人体是否有危害。（11）该实验的原理是）该实验的原理是 B许多致畸物质加入动物细胞培养液后，培养细胞会发生染色体结构或数目的变异。根据变异细胞占观察培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性（22）实验方法步骤：）实验方法步骤：材料准备：从医院妇产
13、科获得所需要的原始材料组材料准备：从医院妇产科获得所需要的原始材料组织，浓度为织，浓度为0.09%0.09%的三氯生试剂的三氯生试剂,高倍显微镜高倍显微镜,培养瓶若培养瓶若干干,配置好的培养液配置好的培养液,剪刀剪刀,培养箱培养箱,所需要的酶所需要的酶.制备检测细胞配置细胞悬浮液:（）将细胞悬浮液分装到两个以上的培养瓶中,置于培养箱中培养一段时间.配置培养液:取两个培养瓶,分别编号1、2，（）将上述组织用剪刀剪碎，再用胰蛋白酶使其分散成单个细胞，然后利用培养液配置成一定浓度的细胞悬浮液分别往其中加入等量的配置好的培养液，再往1号瓶中滴加几滴0.09%的“三氯生”试剂，摇匀将上述某一个培养状况较
14、好的培养瓶中的细胞培养液分成两份，分别加入1、2号培养瓶中，培养一段时间。检测过程：分别从1、2号培养瓶中取样做多次镜检，计算出变异细胞占观察培养细胞的百分数。预期结果和结论：a:若1号和2号培养瓶中变异细胞的百分比相当，则说明“三氯生”对人体无害。b:若1号培养瓶中变异细胞百分数大于2号，则说明“三氯生”对人体有害。克隆培养法（细胞克隆）把一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个细胞群体的技术。细胞克隆的最基本要求：克隆来源于单个细胞细胞克隆较易成功的细胞：无限细胞系、转化细胞系、肿瘤细胞提高细胞克隆形成率的措施：P30选择适宜的培养基、添加血清、以滋养细胞支持生长、激素刺激、使用
15、CO2培养箱调节pH细胞克隆的最主要用途之一：分离缺乏特殊基因的突变细胞系动物的细胞融合技术及其应用细胞融合是将不同种类的两种细胞经过特殊处理后放在一起，在某些促融因子作用下发生融合，形成杂种细胞。细胞A 细胞B融合细胞灭活的仙台病毒、PEG等促融剂电融合动物的细胞融合技术及其应用基因型不同的细胞融合就是细胞杂交基因定位一、动物细胞融合的原理：与植物细胞原生质体融合的基本原理相同利用:细胞膜的流动性植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目比较项目植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合细胞融合原理细胞融合原理细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞融合的方法细
16、胞融合的方法去除细胞壁去除细胞壁后诱导后诱导原生质体融合原生质体融合使细胞分散后诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融合诱导方法诱导方法电刺激电刺激化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）电融合、电融合、PEGPEG、灭活的仙台病毒灭活的仙台病毒用途用途获得杂种植株获得杂种植株制备单克隆抗体制备单克隆抗体单克隆抗体传统方法获取抗体，产量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。1、起因：抗体的作用很大传统获取抗体的方法：某种抗原注射到动物体内（需要反复注射）动物体内产生抗体从动物的 血清中分离出所需要的抗体科学家分析、探索过程：1、体内B淋巴细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体；2、每一个淋巴细胞只
17、分泌一种特异性抗体3、临床医学目的：获得大量的单一抗体理论方法：用单个B淋巴细胞进行无性繁殖，也就是通过克隆，形成细胞群，由该细胞群就能产生出单克隆抗体（化学性质单一、特异性强的抗体）4、遇到的难题：体外培养时，一个B淋巴细胞不可能无限繁殖，无法得到大细胞群大胆设想：小鼠骨髓瘤细胞：能在体外培养下大量增殖 小鼠骨髓瘤细胞+某一种淋巴细胞某一种淋巴细胞：能产生特异性抗体过程：抗原注 射入小鼠 体内B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合 筛选杂交瘤细胞细胞 培养选出能产 生特定抗体的细胞 群，继续培养A细胞B细胞（B淋巴细胞）（骨髓瘤细胞）问：这2种细胞经过融合过程可产生多少种细胞？A B AA BB AB
18、 淋巴细胞：S，D途径合成DNA，但一般不分裂骨髓瘤细胞：D途径合成DNA，能不断分裂注：D途径可被氨基嘌呤阻断筛选杂交瘤细胞：加氨基嘌呤，收集连续分裂的细胞选择培养基 B淋巴细胞 一般不分裂 骨髓瘤细胞 能不断分裂合成DNA分子的途径特点S途径D途径D途径可被氨基嘌呤阻断（添加氨基嘌呤后）D途径AA A B BB AB 能不断分裂S途径D途径死亡存活存活继续培养死亡存活筛选出的细胞 杂交瘤细胞 返回乙肝病毒B淋巴细胞 浆细胞抗 体Y抗原1 抗原2 抗原3YY抗乙肝抗体抗 体2 抗 体3B淋巴细胞1 B淋巴细胞2 B淋巴细胞3骨髓瘤细胞杂交瘤细胞1 杂交瘤细胞2杂交瘤细胞3抗体1 抗体2 抗体
19、3YY Y选出符合要求的杂交瘤细胞(能产生特定抗体)YY能发生特异性结合不能发生特异性结合抗原1Y1 Y1Y1Y1 Y1Y1Y1Y1 Y1Y1Y1 Y1 Y1Y1 Y1Y1Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1Y1Y1 Y1 Y1 Y1 Y1克隆杂交瘤细胞增殖产生的 细胞群杂交瘤细胞增殖产生Y Y Y Y Y Y Y抗体单克隆抗体称做概念:单个杂交瘤细胞增殖形成的细胞群所产生的抗体.返回体外培养体内培养从培养瓶中提取注射入小鼠的腹腔中从小鼠的腹水中提取放入培养瓶中培养单克隆抗体动物细胞培养杂交瘤细胞用抗原免疫小鼠免疫B细胞骨髓瘤细胞在PEG作用下融合成杂交瘤细胞HAT培养基筛选杂交瘤细胞增殖,未增
20、殖细胞死亡筛选产生特异性抗体的杂交瘤细胞克隆化,制备单克隆抗体单克隆抗体的应用：*疾病的诊断、治疗和预防优点：特异性强，灵敏度高，优越性强临床应用：1.单抗探针2.生物导弹 单克隆抗体具有高度专一性，能够识别细胞表面抗原、各种受体、各种体液成分及细胞内和组织内的各种成分，能精确地瞄准和捕获靶细胞，特异性地与靶目标发生反应，因而有“生物导弹”之称。正在研究：用单克隆抗体治疗癌症动物的克隆繁殖动物体细胞难以克隆的原因？动物体细胞高度分化动物细胞全能性的表现程度囊胚 桑椹胚组织、器官分化、形成个体受精卵四分裂球 八分裂球原肠胚仍具有全能性多能干细胞：具有分化出多种组织细胞的潜能单能造血干细胞动物的克
21、隆繁殖动物细胞的全能性全能性大小比较：受精卵胚胎干细胞 组织干细胞生殖细胞高度分化的体细胞去核的卵细胞 乳腺细胞核 重组细胞细胞核移植实验和动物的克隆繁殖核移植：利用一个细胞的细胞核（供体核）来取代另一细胞中的细胞核，形成一个“合子”两栖类细胞核移植 1981 1981年，瑞士日内瓦大学和美国杰克逊实验年，瑞士日内瓦大学和美国杰克逊实验室合作，首次对小鼠卵进行移核试验获得成功。室合作，首次对小鼠卵进行移核试验获得成功。277次乳腺细胞核移植实验；获得29个发育为8细胞的“胚”；13头代孕母亲；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名为“多莉”。分裂3次卵细胞母绵羊母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞
22、核移植早期胚胎卵裂3次C母绵羊子宫胚胎移植多莉羊分娩 妊娠多莉羊的培育过程融合后的卵细胞为什么选择卵细胞？多莉羊的克隆成功证明：1、高度分化细胞经一定技术处理，也可回复到类似受精卵时期的功能。2、在胚胎和个体发育中，细胞质具有调控细胞核（包括异源的细胞核）发育的作用。胚胎克隆 使用的核供体细胞如果来自多细胞阶段的胚胎，叫做胚胎克隆。体细胞克隆 使用的核供体细胞来自动物体细胞，叫做 体细胞克隆。克隆技术的应用：P371、遗传疾病的治疗2、培育优良品种3、濒危动物的保存4、转基因动物的扩群5、生产克隆产品，如药物等下图表示利用植物细胞工程对棉花进行改良的过程，据图分析错误的是A 过程需在适宜条件下用纤维酶和果胶酶处理B 过程定向改变原生质体的遗传特性C 过程需要通过液体悬浮培养D 过程需用适宜浓度的生长调节剂处理C下列有关克隆的叙述错误的是A 二倍体细胞的传代培养次数通常是有限的B 克隆培养法培养过程中多数细胞的基因型会发生改变C 每个细胞中都携带整套遗传信息是植物克隆的物质基础D 单倍体克隆过程能够发生基因突变B