《2023年基因工程复习最全面精品资料.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2023年基因工程复习最全面精品资料.pdf（24页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、一、名词解释 1、基因工程工具酶 基因工程的操作，是分子水平的操作，它涉及到一系列相互关连的酶促反应，要靠一些重要酶类作工具，对基因进行人工切割和拼接，故称为“工具酶”。2、限制作用 是指宿主细菌可以通过自身限制酶的作用，破坏入侵的外源 DNA(如噬菌体 DNA 等)，使得外源 DNA 对生物细胞的入侵受到限制，而保护了宿主菌。3、修饰作用 而生物细胞(如宿主)的 DNA 分子合成后，通过自身修饰酶的作用，使特定位置上的碱基发生甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏 4、限制性核酸内切 是一类能够识别双链 DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割 DNA 双链结构的核酸内切酶 5、
2、3粘性末端 粘性末端是指 DNA 分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构（若是-3），它们能够通过互补碱基间的配对而重新连结起来。6、平端切割频率 是指某限制性核酸内切酶在 DNA 分子中预期的切割概率。7、同裂酶 来源不同的限制酶识别序列相同，产生同样的切割，形成同样的末端 8、同尾酶 来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端 10、DNA 分子的限制性图谱（限制性酶的识别序列位点）根据用一种或多种限制酶酶切的结果，可以在 DNA 分子上标识出各种酶切识别序列位点，这种限制性酶切位点的分布图谱 11、DNA 连接酶 能够催化在 2 条 DNA 链之间形成磷
3、酸二酯键的酶 12、Taq DNA 聚合酶（耐热 DNA 聚合酶）用于 DNA 的体外扩增，经 25 次循环后进入酶的反应稳定期，最适反应温度 75 摄氏度，对 95 摄氏度具有良好稳定性，这个酶只有 53DNA聚合酶活性和 53的外切酶活性，缺少 35的外切酶活性。13、RNase H（核糖核酸酶 H）一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解 DNA-RNA 杂合链中的 RNA。RNase H 不能水解单链或双链 DNA或 RNA 中的磷酸二酯键，即不能消化单链或双链 DNA 或 RNA。14、F 因子 雄性致育因子，所以 F+细胞又叫雄性细胞，与此相应的 F细胞则叫做雌性细胞。F+细胞的表面可
4、以形成一种叫做性须的结构，它促进雄性细胞同雌性细胞进行配对。15、R 质粒 也称抗药性因子。R 质粒编码一种或数种抗菌素抗性基因，此种抗性通常能转移到缺乏该质粒的受体细胞里，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。16、Col 质粒 此类质粒编码控制大肠杆菌素合成的基因，即指导合成大肠杆菌毒素因子。17、质粒 是菌体里染色体以外能自主复制的双链闭合环状 DNA 分子，它广泛存在于细菌细胞中。18、拷贝数 一种质粒在一个细胞中存在的数目 19、质粒的不亲和性 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存。20、多克隆位点（MCS）是根据实验需要设计，人工合成的一段
5、具有多种不同的核酸内切限制酶单一识别位点的双链 DNA 短片段 21、冠瘿碱 这是一类相对分子质量较小的碱性氨基酸衍生物，由 Ti 质粒 DNA 编码。22、质粒载体（L 型，OC 型和 CCC 型）在由限制性核酸内切酶修饰过的质粒 DNA 序列中插入外源的目的基因，以质粒为载体，将目的基因通过转化或转导的方法导进宿主细胞，进行重组、筛选、扩增的过程。23、复制子 在宿主细胞中 DNA 分子中能独立进行复制的最小功能单位。24、聚合酶的FIDELITY（错误率 精确度）：保真度：保真度1/错误率；错误率：每个碱基对出错的概率，25.准确度：指在一个错误的碱基被合成前已合成的碱基数目。26.严紧
6、型：一种是低拷贝数的质粒，称“严紧型”复制控制的质粒，此类质粒每个宿主 27.细胞仅含 13 份的拷贝。28.松弛型：另一类是高拷贝数的“松弛型”复制控制的质粒，这类质粒每个宿主细胞可达到 1060份拷贝，甚至经过人工改造后，可多达 10003000份拷贝。29.c基因：c基因表达产生一种阻遏蛋白，可使参与溶菌周期的所有基因失去活性，促使噬菌体进入溶源途径并维持溶源状态。30、cos 位点：当DNA 进入细菌细胞后，便迅速通过黏性末端配对形成双链环状的 DNA 分子，这种黏性末端结合形成双链的区域称为 cos 位点。31、柯斯质粒:是一类由人工构建的既含有DNA 的 cos 序列又含有质粒复制
7、子的特殊类型的质粒载体。32、SV40的潜伏期:在这个期间，病毒颗粒脱去蛋白质外壳，同时 DNA 逐渐地转移到寄主细胞核内.33、人工染色体：是一种人工构建的“穿梭载体”。既有 E.coli(第一受体)质粒的复制起始位点 ori，又有第二受体（如酵母菌）染色体着丝点（CEN）、端粒（TEL）、复制起始序列(ARS)，还有适合的选择标志基因 34、随机引物：人工合成的，一般由 610 个各种随机排列的核苷酸组成。35、串联启动子表达载体:有时为了提高目的基因的表达量，在构建的表达克隆载体中把两个同一种的启动子串联在一起成为串联启动子表达克隆载体。36、cDNA 文库:某种生物基因组转录的部分或全
8、部 mRNA，经反转录产生的各种 cDNA 片段分别与克隆载体重组，贮存在受体菌群体中，这样的群体称为 cDNA 基因文库（又称 C 库）。如果此群体中只贮存该基因组的部分 cDNA，则称为部分 cDNA 文库。与基因组文库不同，cDNA 基因文库内不包含内含子。37、目的基因:通常将那些已被或者准备要被分离改造扩增并表达的特定基因或 DNA 片段，称为目的基因。38、基因组文库:某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这种保存了某种生物全部遗传信息的混合物的集群，即为该生物的基因组文库（又称 G 库）。39、双启动子表达载体：具有两个启动子排列在一起高效启动表达的
9、载体 40、文库筛选:（有时也称为筛库）即采用分子生物学的方法和技术从基因文库中确定目的基因克隆子（“钓”目的基因）的过程。41、表面显示技术:是一种基因表达筛选技术，是将目的基因克隆在特定的表达载体中，使其表达产物显示在活的噬菌体、细菌或细胞表面，然后根据表达产物的某些生物学活性的检测来筛选、富集和克隆带有目的基因的噬菌体、细菌或细胞。42、噬菌体显示文库:应用噬菌体表面显示技术的关键是构建表达性基因文库，这种文库称为噬菌体显示文库。43、套式 PCR(nested PCR):是指用两对引物扩增同一样品的方法。一般先用外侧引物扩增一段较长的靶序列，即外部长片段。然后取 12l 第一次扩增产物
10、，再用内部引物扩增其中部分片段，又称内部短片段。44、反向 PCR(inverse PCR)：是一种多聚合酶链式反应（PCR）应用的方法，可使已知序列的核心区边侧的未知 DNA 成几何级数扩增。用适当的限制性内切裂解含核心区的 DNA，以产生适合于 PCR 扩增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子。45、不对称 PCR(asymmetric PCR):在 PCR 扩增循环中所用的两个引物的浓度不同时，所进行的 PCR 就是不对称 PCR。46、锚定 PCR(anchored PCR):又称单侧 PCR，是指通过添加锚定引物接头的方式来扩增合成未知序列或未全知序列的方法。47、长程 PC
11、R(long and accurated PCR)是一种超长 DNA片段的 PCR扩增方法。最大特点：采用强力 LA Taq DNA聚合酶或 EX Taq DNA 聚合酶来扩增长片段 DNA。48、反转录 PCR(RT-PCR):亦称为 RNA PCR，通过 mRNA 反转录，得到对应的 cDNA，然后利用特定的 PCR引物直接以反转录得到的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增反应，获得大量必需的基因。49、Alu PCR:根据 Alu 序列的高度保守区域设计引物，扩增 Alu 重复序列间的未知区域的 PCR 方法称为 Alu PCR。50、锚定引物：oligo(dT)12MN，其中 M为 A
12、、G、C 中的任意一种,N 为 A、G、C、T中的任意一种,由 MN组合而成的 12 种引物统称为锚定引物 51、转座子标签法:当转座子随机转入某一功能基因内部，会诱导该基因发生突变失活，而转座子转离基因时，又可使它恢复活性，根据转座子这种生物学特性建立的分离基因方法叫做转座子标签法 52、TDNA 标签法：通过T-DNA 上的标记基因(如卡那霉素抗性基因)检测出突变位置，得到与T-DNA 相连的DNA 片段。再以此DNA 片段制备探针筛选野生型基因组DNA 文库，就可得到与突变相应的完整基因。53、人工合成接头：合成接头是自相互补的两个化学合成的寡核苷酸的等摩尔混合物，而两个寡聚体可形成带一
13、个或多个限制性酶切位点的平端双链体。54、实时荧光定量 PCR 的基线：就是扩增曲线中的水平部分。55、阈值：基线（背景）信号标准偏差 10 56、Ct 值：从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。57、DNA0 58、同聚物加尾法：就是利用末端转移酶的可催化 dNTP加到单链或双链 DNA 的-OH的能力，在目的 DNA 和质粒载体上加入互补同聚物，两者再通过互补同聚物间的氢键，形成重组子 59、DNA 衔接物：是人工合成的一小段双链寡核苷酸，与人工接头不同的是一头为平整末端（与双链目的DNA 平端连接），另一头带有某种限制酶的粘性末端（与载体的相应粘端连接）。60、转化 分子信标：是一种呈
14、发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。61、农杆菌：是一类土壤习居菌，革兰氏染色呈阴性，能感染双子叶植物和裸子植物，而对绝大多数单子叶植物无侵染能力。62、DNA 的变性：某些理化因素导致两条 DNA 链间的氢链断裂变为单链的过程。63、DNA 复性:变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。64、Southern 印迹:指将电泳分离的 DNA 片段转移到一定的固相支持物上的过程 65
15、、电穿孔(electroporation)：系指在高压电脉冲的作用下，使细胞膜上出现微小孔洞的现象。外源DNA可以穿过这样的孔洞进入细胞并转运进细胞核，因此利用电穿孔技术可以成功的进行基因转移。收。66、Northern 印迹：指将电泳分离的 RNA 片段转移到一定的固相支持物上的过程 67、转基因受体细胞：又称为宿主细胞或寄主细胞(host cell)等，从实验技术上讲是能摄取外源 DNA 并使其稳定维持或表达的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。68、感受态细胞：是指处于能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态的细胞。69、外植体：用于植物基因转化操作的受体。70、转导：
16、是指通过噬菌体(病毒)颗粒感染宿主细胞的途径把外源 DNA 分子转移到受体细胞内的过程。71共培养：在诱导愈伤组织或不定芽固体分化培养基上培养，随着外植体的细胞分裂和生长，农杆菌在外植体切面也进行着增殖生长，故该培养过程称之为农杆菌与外植体的共培养。72、脱菌培养：是指把共培养后的外植体转移到含有抗生素的培养基上继续培养生长的过程。73、显微注射法:是一种利用显微注射仪，通过机械方法把外源 DNA 直接注入细胞质或细胞核的基因转化方法。74、阳性克隆子：由体外重组产生的 DNA 分子，通过转化、转染、转导等适当途径引入宿主会得到大量的重组体细胞或噬菌体 75、PLac 和 PTac 表达系统
17、是以 lac操纵子调控机制为基础设计和构建的表达系统。76、PL 和 PR 表达系统 是以噬菌体早期转录启动子 PL 和 PR 构建的。在野生型噬菌体中，PL和 PR启动子的转录与否决定噬菌体进入裂解周期或溶原周期 77、T7 表达系统 利用大肠杆菌 T7 噬菌体转录系统元件构建的表达系统具有很高的表达能力。78包涵体蛋白：在一定的条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体蛋白。79.自主复制顺序(ARS)：同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，能在两种细胞中存在和复制 80.2um质粒：是酿酒酵母中含有一个长度为 2um 的内源质粒，它
18、的 DNA 分子通常与蛋白质结合构成复合物，存在于核区。81.“分泌”：是指蛋白质从胞质跨过内膜进入周间质这一过程。“外排”：蛋白质从胞质跨过内、外膜进入培养液 82.穿梭载体：可以在两种截然不同的生物细胞中复制的载体 83.愈伤组织：切取植物体的一部分，置于含有生长素和细胞分裂素的培养液中培养，诱导产生的无定形的组织团块。84.遗传病：由遗传物质发生改变而引起的或者是由致病基因所控制的疾病。85.嵌合体抗体：利用 DNA 重组技术将鼠单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出人鼠嵌合的抗体。86.RFLP连锁分析：指 DNA 多态性若发生在限制性内切酶识
19、别位点上，酶切水解该 DNA 片段就会产生长度不同的片段。以基因组 DNA 为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列(通常为 10 个碱基对)为引物，在热稳定的 DNA 聚合酶(Taq 酶)作用下，进行 PCR 扩增 87.人源化小鼠抗体；是针对鼠源单克隆抗体存在抗鼠免疫反应的缺陷而发展起来的 88、in situ基因治疗：vector is placed directly into the affected tissues 89.基因治疗：是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病以达到治疗的目的。90.基因诊断:采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因
20、的结构(DNA 水平)或功能(RNA 水平)是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。91.单克隆抗体：是由识别一种抗原决定簇的细胞所产生的均一性抗体，它反映的特异性高、亲和力强、效价高、血清交叉反应少。92、ex vivo 基因治疗（间接疗法）：将含有外源基因的载体在体外导入人体自身或异体细胞，经体外细胞扩增后，输回人体。93.in vivo 基因治疗（活体内疗法）：将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体，直接导入机体内。94.锌指核酸酶(ZFN)：是由锌指蛋白与非特异核酸酶结合的人工合成酶。二、简述题目 1.II 型限制性核酸内切酶的特点（1）.为单链多肽,最适 pH6-8,能被盐抑制、被 M
21、g2+激活；（2）.底物 DNA 分子双链中有特异性识别序列，通常有 4-8个 bP 甚或更多，大都为一回文对称的结构。（3）.一般可在特异性识别序列内切割双链 DNA 分子（有例外），产生链的断裂，断裂端有粘性末端和平齐末端之分。其中两个粘性末端可以互补配对连结成重组分子。2.限制性核酸内切酶的命名原则，以 Eco RI 为例说明（1）用属名的第 1 个字母（大写）和种名的头 2 个字母（小写），组成 3 个字母的略语表示寄主菌的物种名称。（例如，大肠杆菌(Escherichia coli)用 Eco 表示）（2）用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型，例如 Ecok、（3）如果一种特殊的寄
22、主菌株，具有几个不同的 R-M体系时，则以罗马数字表示。（4）名称：限制酶，核酸内切限制酶用 R 表示外，还要带有系统的名称，例如，流感嗜血菌核酸内切酶 RHindIII；修饰酶，则在它的系统名称之前加上甲基化酶 M 表示。3、自杀基因策略基因治疗方案的原理是什么？即用（逆转录）病毒载体将编码某种酶的基因（自杀基因）转染到肿瘤细胞中，此酶可将一种无害的药物前体转变为细胞毒复合物，进而杀伤肿瘤细胞（肿瘤细胞不能复制而死亡）。这种基因载体只能在特定的组织或肿瘤中表达，而正常细胞中不表达。4、什么是新星活性，如何避免：！（第二章）在“非最适的”反应条件下(包括高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低
23、离子强度)，有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割 DNA 分子，这种现象称为 Star 活性。5、影响限制性内切核酸酶的效率有哪些因素？1)DNA 的纯度 2)DNA 的甲基化程度 3)酶切消化反应的温度 4)DNA 的分子结构 5)核酸内切限制酶的缓冲液 6、DNA 连接酶可以连接 DNA 的缺刻。那么它可以连接单链的 DNA 吗？DNA 连接酶并不能够连接两条单链的 DNA 分子或环化的单链 DNA 分子，被连接的链必须是双螺旋的一部分。实际上，DNA 连接酶是封闭双螺旋 DNA 骨架上的缺口，即在双链 DNA 的某一条链上两个相邻核苷
24、酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂；7、T4-DNA 多核苷酸磷酸激酶的活性有哪些？哪种活性可用于放射性标记核酸 5末端的 0H 基？用那种底物？即 5，-3，的聚合酶活性和 3，-5，的核酸外切酶活性。用 T4 多聚核苷酸激酶(缺失 3 磷酸酶活性)对 3 端有磷酸基团的寡核苷酸的 5 端进行标记 pNp底物 8、末端转脱氧核苷酸移酶（TdT）的活性是什么？可用于哪些重要的反应？（第二章）（1）、是一种无需模板的 DNA 聚合酶，催化脱氧核苷酸结合到 DNA 分子的 3 羟基端。（2）、dUTP 缺口末端标记技术（细胞凋亡的原位检测）3-末端标记 3-加尾，便于两 DNA 分子重组 9
25、、T7 和 SP6RNA 聚合物的活性是什么？它在基因工程有什么样的应用？（1）、分别对 T7 和 SP6 噬菌体启动子具有高度的特异性。可将目的基因序列克隆到 T7 和 SP6 启动子下游的多克隆位点中，以此克隆的 DNA 为模板体外合成相应的 RNA。用 T7 和 SP6 RNA 聚合酶合成的 RNA 具有 mRNA 的生物特性，可进行准确剪切。（2）、制备放射标记 RNA 探针 合成 RNA，用于体外翻译 合成 RNA 反义链，调控基因表达 10、常用的两种反转录酶是什么？在基因工程中主要用它的那个活性？（1）、莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶 是一种 RNA 介导的 DNA 聚合酶。该酶能
26、以 RNA(合成 cDNA 时)或单链 DNA 做模板由引物起始合成一条互补的 DNA。M-MuLV 反转录酶无 3 5核酸外切酶活性。禽骨髓母细胞瘤病毒反转录酶 是一种 RNA 介导的 DNA 聚合酶。该酶能以 RNA(合成 cDNA 时)或单链 DNA 为模板从引物开始合成互补的 DNA 链。（2）、依赖 RNA 的 DNA 聚合酶 以 RNA 链为模板，以带 3，一 OH 末端的 DNA 片段为引物，沿 5，-3，方向合成 cDNA 链(第一链)。11、世界上第一例基因治疗是大致是如何进行的？效果如何？将她的白细胞取出，插入所缺少的基因，然后又将其送回到体内 强化了她的免疫机能 仅持续了
27、几个月 12、体细胞基因治疗和生殖细胞基因治疗各有哪些特点？1、生殖细胞的基因治疗 将正常细胞基因转移到患者的生殖细胞（精细胞，卵细胞早期胚胎）使其发育成正常个体。从根本上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中播散。缺点：1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展；2）基因转移效率不高，只能用显微注射方法；3）只适用于排卵周期短而次数多的动物，很难适用于人类。2、体细胞基因治疗 将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给后代。缺点：（1）对特定座位基因转移，目前还存在较大困难；（2）随机插入可能引起后代的基因突变。13、同源重组单交换和双交换对所转 DNA 来说各
28、自能造成什么后果？（九，基因治疗 38）14、锌指酶如何构建？有什么功能？1、由锌指蛋白与非特异核酸酶结合 2、酶的 N 末端为锌指蛋白 DNA 结合域,能识别含有特定碱基序列的 DNA 序列,并结合在此位点;C 末端是为非特异性核酸酶 FokI 结构域.15、单克隆抗体治疗疾病的原理是什么？9 章基因工程的 16、基因治疗载体有哪些？各都有什么特征？优点 缺点 脂质体 无感染能力 无特异性靶细胞 理论上无 DNA大小限制 转染效率低 毒性低 仅有短暂表达，体内应用困难 受体介导的转运 无感染能力 转染效率低 特异性转染靶细胞 体内应用困难 理论上无 DNA大小限制 可能有免疫原性 构建灵活
29、只有短暂表达 17、DNA 连接酶用什么作为辅酶？18、限制性内切酶活性单位的定义 限制性内切酶的一个活性单位是指，在 50l 的反应体系里，采用随酶提供的 Buffer，用 1 个小时的时间，彻底消化 1g 底物 DNA 所需要的酶量 19.大肠杆菌 DHA 聚合酶全酶有哪些活性？有哪些基本用途？（1）5到 3的 DNA 聚合酶活性 5到 3的核酸外切酶活性 3到 5的核酸外切酶活性 （2）1.通过核苷酸聚合反应，使 DNA 链沿着 53方向延长；2.由 3端水解 DNA 链；3.由 5端水解 DNA 链；4.由 3端使 DNA 链发生焦磷酸解；5.无机焦磷酸盐与脱氧核苷三磷酸之间的磷酸基交
30、换。20.Klenow 片段有哪些活性？可用于哪些反应？（1）5到 3的 DNA 聚合酶活性 3到 5的核酸外切酶活性 （2）补平由核酸内切酶产生的 3粘性凹出末端 抹平 DNA 的 3粘性凸出末端 DNA 片段的同位素末端标记 cDNA 第二链的合成 双脱氧末端终止法测定 DNA 序列 21.T4 DNA 聚合酶有哪些活性？基本用途是什么？（1）有 3到 5的核酸外切酶活性和 5到 3的 DNA 聚合酶活性 在无 dNTP 时，可以从任何 3-OH端外切 在只有一种 dNTP 时，外切至互不核苷酸。在四种 dNTP 均存在时，聚合活性占主导地位。（2）切平由核算内切酶产生的 3粘性末端 DN
31、A 片段的同位素末端标记 22.基因工程中，碱性磷酸酶的活性用途是什么？常用的碱性磷酸酶有哪几种？各有什么特点？（1）催化水解 DNA、RNA、dNTP 和 NTP 上的 5-磷酸残基。（2）细菌碱性磷酸酶（BAP）和牛小肠碱性磷酸酶（CIAP），后者更常用。（3）CIAP 可在 7010内加热灭活或通过苯酚抽提而变性失活，同时 CIAP 的活性比 BAP 的高 1020倍。23.S1核酸酶活性？可用于哪些反应？（1）（2）内切单链 DNA 或 RNA 内切带缺口或缺刻的双链 DNA 或 RNA 24.大肠杆菌质粒载体常用的抗药性 （P17）第三章 开始处 25.组成质粒载体的最基本遗传元素有
32、哪些？（1）能自主复制，即本身是复制子 （2）具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；（3）在基因组中有 12 个筛选标记基因，为寄主细胞提供易于检测的表型特征。（4）分子量要小，多拷贝，易于操作。26.互补作用：pUC 质粒结构中具有来自大肠杆菌 lac 操纵子的 lacZ，基因，其所编码的半乳糖苷酶的肽链缺少了部分 氨基酸残基，用这种质粒去转化肽链缺少了另外部分氨基酸残基的宿主菌（为结构突变型的 lacZ-M15 基因 型），如 JM101 JM103 JM105 等大肠杆菌菌株。两者即可产生互补，形成具有酶学活性的蛋白质，即互补作用。27.
33、Ti质粒：Ti 质粒存在于能够引起植物形成冠瘿瘤的土壤农癌杆菌中。这种肿瘤的形成是由 Ti 质粒决定的，故称为诱导肿瘤的质粒(tumor inducing plasmid)，简称 Ti 质粒。28.为什么可将冠瘿瘤细胞分为章鱼碱型、胭脂碱型和农杆碱型肿瘤细胞？在 Ti 质粒诱导的肿瘤细胞中，具有大量的不正常的氨基酸类物质冠瘿碱(opine)，这是一类相对分子质量较小的碱性氨基酸衍生物，由 Ti 质粒 DNA 编码。正常植物细胞不能合成和利用冠瘿碱，而土壤农癌杆菌能够选择性地利用这类化合物作为自己唯一的能源、碳源和氮源。最常见的冠瘿碱有章鱼碱(octopine)、胭脂碱(nopaline)和农杆
34、碱(agropine)。根据所产生的冠瘿碱的类型和差别，可将冠瘿瘤细胞分为章鱼碱型、胭脂碱型和农杆碱型肿瘤细胞。29.Ti 质粒的 T-DNA 的功能是什么？一是决定肿瘤的形成和形态，二是控制冠瘿碱的合成。30.温和噬菌体生活周期的裂解周期和溶源性周期 在裂解周期中，噬菌体的 DNA 分子一旦注入寄主细胞中，便可借助于寄主的复制和转录系统的功能，使自身 DNA 大量复制同时合成大量的外壳蛋白，并组装成大量(约 100 个)完整的噬菌体颗粒，最后，使宿主裂解并从细胞中释放出来。在溶源周期中，噬菌体的 DNA 分子进入宿主后并不马上复制，而是在特定的位点整合到宿主染色体 DNA 中，与宿主染色体形
35、成一体，并随宿主染色体的复制而复制，随宿主的分裂繁殖传给其子代细胞 31.插入型噬菌体载体载体和取代（置换）型载体的区别 插入型载体：只具有一个限制酶切位点可便于外源 DNA 插入，称为插入型载体。取代（置换）型载体：含有二个限制酶切点，在两个位点之间的 DNA 区段可以被外源 DNA 片段所取代，称为取代型载体。32.pBR322和 pUC 名称怎么来的？（1）“p”表示它是一种质粒；“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者 FBo1ivar 和 RLRodriguez 姓氏的头一个字母，“322”指实验室编号，便以与其他质粒载体如 pBR325，pBR327，pBR328等相区别。（2）
36、此类质粒载体之所以取名为 pUC，是因为它是由美国加利福尼亚大学(UC)的科学家 JMessing 和JVieria于 1987年首先构建的。33.噬菌体载体的应用 （1）基因组 DNA 文库的构建；（2）cDNA 文库的构建 （3）大容量载体(如粘粒等)中增殖的 大片段外源 DNA 序列的亚克隆等。34.DNA 的体外包装：(P69)是指在试管中完成噬菌体在寄主细胞内的全部组装过程。基本原理：噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。头部基因发生突变的噬菌体只能形成尾部，而尾部基因发生突变的噬菌体只能形成头部。将这两种不同类型的噬菌体提取物混合起来，就能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。只要
37、为重组 DNA 提供高浓度的噬菌体前体，包括包装蛋白、头部和尾巴，就有可能形成完整的噬菌体颗粒 35.M13噬菌体载体的特点(3 P86)优：（1）克隆的片段大。允许包装大于病毒单位长度的外源 DNA（可达 40Kb）；可直接产生单链的 DNA。这对于 DNA 测序、DNA 诱变、制备特异的单链 DNA 探针都是很有用的；（2）感染细菌后复制环状 DNA经包装形成噬菌体颗粒分泌到细胞外而不产生溶菌。这一特性不仅便于分离单链的 DNA，而且在产生大量的单链 DNA 中，可以含有外源 DNA 序列。缺：1）较大的外源片段插入后，在扩增过程中不够稳定，克隆的片段越大，发生丢失的机率越大；2）单链载体
38、分子感染的细胞中，常常是单链和双链混杂，分离双链比较麻烦 36.SV40-DNA的早期转录和晚期转录(P94)（1）SV40-DNA进入敏感的动物细胞后，先启动反时针方向的转录，转录与病毒感染相关的 t 抗原基因和T 抗原基因，转译出 t 抗原(175aa)和 T 抗原(792aa)，称为早期转录 （2）随后启动顺时针方向的转录，转录与病毒壳蛋白合成相关的基因，转译出壳蛋白 Vp1(363aa)、Vp2(235aa)和 Vp3(352aa)，称为晚期转录。37、SV40病毒的基础分子生物学 一种小型的 20 面体的蛋白质颗粒，由三种病毒外壳蛋白质 Vp1、Vp2 和 Vp3 构成，中间包装着一
39、条环形的病毒基因组 DNA。同其它病毒不同，SV40 DNA 同除了 H1 之外的所有寄主细胞组蛋白(H4、H2a、H2b 和 H3)相结合。这些组蛋白使病毒 DNA 分子紧缩成真核染色质所特有的念珠状核小体，这种结构特称为微型染色体(minichromosome)。感染之后的 SV40 基因组，输送到细胞核内进行转录和复制。SV40病毒基因组表达的时间顺序是相当严格的,据此可将其区分为早期表达区和晚期表达区。38、人工染色体是如何构建的？(P107)1)自主复制 DNA 序列 2)着丝粒 DNA 序列 3)端粒 DNA 序列 用 DNA 重组技术将这 3 个元件分别从染色体上分离出来，并按顺
40、序重组就构成所谓的“人造微小染色体”这种线状小染色体转化进入酵母细胞可以进行正常的复制和有丝分裂。这种小染色体经过改造，组装上作为载体所必须的其他功能序列，就可以成为人工染色体载体。39、如何利用 SV40病毒元素构建载体？为什么有时要辅助病毒？a、包装严格的 SV40 病毒只能构建成“取代型”克隆载体，因其非必需区很小，在插入 SV40 中外源 DNA时，需置换出某些有功能的区段，如 T 抗原基因、壳蛋白基因等，结果形成“缺损型病毒”。所以，人工构建的 SV40病毒作载体使用时，需要“辅助病毒”同时感染相容细胞。b、SV40病毒 DNA 可与质粒重组成新的载体，如：pBR322与 SV40D
41、NA 组成 pSV1GT5、pSV1GT7 等。也可加入适当的选择标志和多聚腺苷酸信号。40、随机文库是什么？如何确定随机文库的大小？随机文库的大小和什么因素有关？随机文库指代表基因组各部分 DNA 的摩尔数相等的文库。ln(1-P)_ N=ln（1-x/y）N：克隆数目 P：设定的概率值(如：099，表示在片段随机 分布时，从文库中找到任一序列的概率不低 于 099)x：插入片段平均大小(1520kb)y：基因组的大小(以 kb 计)41、基因组文库的特点？一个完整的基因组文库所需的克隆子总数取决于该生物的基因组大小和切割片段的大小。当某生物的基因组越大，克隆数目就越多；基因组越小，克隆数目
42、就越少；而当某生物基因组切割的 DNA 片断越长，克隆数目就越少；反之就越多。42、为什么说 cos 基因文库转化后在平板上出现的是菌落而不是噬菌斑？COS 细胞（CV-1，origin,SV40 的缩写）源于非洲绿猴肾细胞系(CV-1)，CV-1细胞经复制起始区缺陷的 SV40病毒基因组转化后，产生以组成性表达 SV40的大 T 抗原的 COS 细胞株。COS 细胞具有如下特点：细胞来源丰富、易于培养和转染；能使转染到该细胞中的带有 SV40复制子的质粒载体快速扩增；能瞬时大量表达外源基因的产物。43、cDNA 合成常用的随机引物有哪几种？610个核苷酸组成的寡核苷酸短片段的混合物 单链 c
43、DNA 3端形成的发卡结构 44、强烈变性剂如盐酸胍或硫氰酸胍溶液处理细胞的目的是什么？破裂细胞，抑制核酸酶。提取细胞总 RNA的方法，用强烈变性剂如盐酸胍或硫氰酸胍溶液处理细胞，使核糖体解裂释放出 RNA，再经CsCl 梯度离心或乙醇沉淀获得总 RNA 45、文库的免疫杂交筛选 46、RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)是通过 PCR 进行 cDNA 末端快速克隆的技术。是以 mRNA 为模板反转录成 cDNA第一链后用 PCR技术扩增出某个特异位点到 3，或 5，端之间未知序列的方法 47、表达序列标签法（简称 EST）是指基因序列中一段能特异地标记
44、或表征基因的序列，通常它含有足够的结构信息以显示出该基因与其他基因的差异，长度一般为 100 500bp。利用 EST 寻找新基因的一种策略即为表达序列标签法（ESTs）。48、人工接头（DNA 寡核苷酸连杆）：是化学合成的核苷酸寡聚体，可带有一个或几个限制性酶切位点的平末端双链寡核苷酸短片段（一般由 8-12个核苷酸组成）。49、DNA（探针，质粒等）的常用方法有哪些？质粒 DNA 的提取根据实验目的不同，可以有不同的方法，但基本步骤多为三步，第一细菌培养和质粒的扩增，第二细菌菌体的裂解，第三质粒 DNA 的纯化。菌体裂解方法不同，决定了质粒 DNA 提取方法的差异，目前菌体裂解方法主要有煮
45、沸法，SDS 法，碱解法,Triton-溶菌酶法等。质粒 DNA 的纯化方法主要有梯度离心法、柱层析法等，但由于目前所用质粒的复制量极大，小量常规制备的质粒既可以满足内切酶图的绘制、细菌转化、特定 DNA 片段的分离、常规亚克隆及探针标记等方面的工作需要。在质粒 DNA 提取中，质粒DNA 的质量和产量在很大程度上受培养条件的影响,通过一些实验发现,下列培养方式能获得较好的结果：1 培养应用菌龄不超过 4 天的平板单菌落作为起始菌 2 培养菌应在 37,220rpm下,生长 16-18小时 3 不能用经储藏的培养菌直接进行质粒提取制备.常用质粒 DNA 提取的方法：碱解法提取质粒 DNA 50
46、、实时荧光定量 PCR 的用途是什么？分作几个阶段？通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对 PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品的初始模板量。内插染料双标记探针分子信标 51、SYBR green I 的用途是什么？当它没有结合上双链 DNA 时，只发生相对弱的荧光；然而，当它一旦插入到双链 DNA 里时，荧光信号将会强烈地增加，从而根据荧光信号的增加来及时 PCR扩增产物的增加。52、TaqMan 探针的原理是什么？FRET 是怎样形成的？TaqMan 探针 3 端 Q 荧光分子能够吸收 5端 R荧光分子发出的荧光，因此正常情况下该探
47、针检测不到 5端荧光分子发出的荧光，只能检测到 3端荧光分子发出的荧光信号，但当溶液中有 PCR 产物时，探针与末班退火，即产生了适合于核酸外切酶活性的底物，从而激活 Taq 酶的 5外切酶活性，将探针 5端连接的 R荧光分子从探针上切割下来，破坏了两个荧光分子间的 FRET，从而发出荧光，切割的 R荧光分子数与 PCR产物的数量成比例，因此根据 PCR 反应液的荧光强度即可算出初始模板的数量。53、DEPC 的用途是什么？，粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。与蛋白质中 His 结合使蛋白变性。54.在 DNA 纯化的过程中，酚/氯仿抽提的目的是什么？酚：氯：异戊醇的比例各是多少？异戊醇的作用是什
48、么？酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。酚：氯：异戊醉=25：24：1 异戊醇的作用是：防止起泡和促使水相与有机相的分离 55.DNA 变性的方法有几种？变性前后会发生什么现象？（1）热变性：温度升高到 90100时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。（2）酸碱变性：pH 值低于 3 或高于 10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。（3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂。变性后的现象：紫外吸光度值升高，粘度降低，浮力密度升高，酸碱滴定曲线改变 56.甲酰胺在杂交中的作用是什么？甲酰胺能降低核酸杂交的 Tm 值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测
49、核酸杂交更稳定 57.为什么 DNA 杂交时，在正式加入探针前要先加入非特异性 DNA？杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附 58.RNaseA 和 RNaseT1 在 RNA 酶保护分析法液相杂交中起什么作用？RNaseA 和 RNaseT1 专一水解杂交体系中的单链 RNA，不水解探针 RNA 与待测 RNA 互补形成的双链 RNA，使杂交分子得到保护，称 RNA 酶保护分析法。59.常用的原核生物受体细胞有哪几种 大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌 60.农杆菌介导的转化方法有几种？叶盘转化法 植株接种共转化法 植物愈伤组织共培养转化法 植物悬浮细胞共培养转化法 原生质体共培养
50、转化法等。61.多聚物介导的遗传转化分子机理是什么？多聚体可以使细胞膜之间或使 DNA 与膜之间形成分子桥，促使相互间的接触和粘连。还可以引起膜表面电荷的紊乱，干扰细胞间的识别，从而有利于细胞膜间的融合和外源 DNA 进入原生质体 62.脂质体介导的转化 由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构的脂质体，可以将 DNA 包在其内，并通过脂质体与原生质体的融合或由于原生质体的吞噬过程，把外源 DNA 转运到细胞内。此方法的优点是包在脂质体内的 DNA 可免受细胞 DNA 酶降解。63.cI857(ts)的基因产物如何调控 PL 和 PR 启动子的转录？温度敏感突变体 cI857(ts)的基因产物来