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1、学习好资料 欢迎下载 前言：1.遗传、变异的含义及其相互关系；遗传使子代与亲代保持不变，保持亲本的性状，从而使每个物种具有相对的稳定性，能延续后代；变异使子代发生改变，表现与亲代不同；没有变异，物种将一成不变，没有变异就没有生物的进化和发展；遗传是相对的，变异是绝对的。2.孟德尔的遗传观念及其在遗传学中发展的作用；孟德尔的遗传观念：基因的分离定律；基因的自由组合定律；两个定律体现了基因的颗粒性，为一基因一酶学说的提出奠定了基础也为现代分子遗传学奠定了分子机制基础。第一章基因与 DNA结构 1.什么是基因，什么叫内含子；一个或几个 DNA片段形成的一个功能性 RNA分子或为一个 RNA分子。2.
2、Topo1 和 Topo11 的区别；1：催化瞬时的单链的断开和连接（单链切口）2：催化双链断开成一个缺口 3.Gyrase 是什么；DNA促旋酶是什么；促进 DNA发生螺旋结构的旋转变化的酶 4.正负螺旋的生物学意义 正超：嗜热生物特有，解旋须要更多的能量，防止环境高温引起 DNA变性 负超：含自由能，有局部解旋倾向，可以为打开 DNA双链供能。5.链环数，扭转数，缠绕数；链环数：指 cccDNA（共价闭合环 DNA）中一条链绕另一条链的总数 扭转数：双螺旋圈数 缠绕数：超螺旋数目。6.断裂基因（split gene）；限制性内切酶（restriction）；变性（deneturation）
3、；复性（renaturotion）；退火（anneal）;southern/northern blotting;原位杂交；断裂基因：基因的编码序列在 DNA上不连续，有一些不编码的序列隔开。限制性内切酶：一组能特异性识别一段短的回文 DNA序列并于此处切开 DNA的酶。变性：一定条件下，双链 DNA双链键断开打开成单链 复性：适当条件下，单链 DNA互补恢复成天然双链 DNA。退火：单链 DNA经过互补配对，重新形成双链 DNA的过程 Southern 杂交：使用特定的探针对 DNA进行杂交，以获得特定的 DNA片段。Northern 杂交：使用特定的探针对 RNA进行杂交，以获得特定的 RN
4、A片段。原位杂交：使用特定的 DNA或 RNA探针直接对组织或细胞进行杂交。7.证明 DNA是遗传物质的细菌转化实验和噬菌体实验 细菌转化实验：（1）粗糙型菌+光滑型菌=光滑型菌 粗糙型菌+光滑型菌提取物=光滑型菌 粗糙型菌+光滑型菌提取物高温处理=光滑型菌（2）粗糙型菌+光滑型菌提取物高温处理=光滑型菌 粗糙型菌+光滑型菌提取物 DNA酶处理=粗糙型菌 结论：DNA是遗传物质 噬菌体实验:32P 和35S 标记噬菌体，入侵；检测发现32P 进入细菌体内。子代中有32P 但没有35S 出现。结论：DNA是遗传物质 8.DNA双螺旋结构特征(1)右手螺旋，每个螺旋 10 碱基；(2)螺距 3.4
5、nm，碱基堆积 0.34nm；学习好资料 欢迎下载(3)大沟 22A，小沟 12A；(4)直径 20A。第二章 DNA复制 1.什么是复制 复制是指以 DNA的一条链为模板合成互补的子代 DNA，且子代 DNA与模板链结合成子代 DNA分子。2.DNA聚合酶工作原理 DNA聚合酶结合在母链上，以复制起始位点开始，连续合成新的与母链互补的 DNA子链。3.大肠杆菌的复制原点结构 复制。从复制起始位点开始，双链双向解开，DNA复制开始，呈现 状的复制模型。5-3 AT区 AT-chustor DnaA box DnaA box GATC sit HF-binding sit R1-4原点 I1-4
6、 box 4.复制中滑动夹的作用 滑动夹有多个蛋白亚基组装成夹子状在复制叉处与 DNA聚合酶紧密结合，保持 DNA聚合酶与 DNA紧密结合，大大的增加了 DNA聚合酶的延伸能力。真核生物：PCNA-三聚体；原核生物：Dna 二聚体 5.大肠杆菌有多少复制起点 一个复制其实位点，双向复制 6.几种 DNA聚合酶参与大肠杆菌 DNA复制 DNA pol RNA引物的去除、DNA 修复 DNA polDNA 修复 DNA pol 染色体复制 DNA pol 全酶 染色体复制 7.先导链与滞后链的 DNA复制有何不同 先导链：沿复制叉解旋方法由 5向 3 连续合成；只需要一个引物；合成速度快；滞后链：
7、沿 5 向 3 先不连续合成冈崎片段，然后片段之间连接成一条连续的完整的新 DNA链；需要模板链上的特殊序列和信号；需要多个引物；合成速度慢；8.先导链与滞后链是怎么样合成的？9.端粒，端粒酶；端粒酶是怎样介导端粒复制的？端粒：真核生物线性染色体的两端有一段短片段重复序列，末端还有一个特殊发夹结构；端粒酶：DNA复制时特异性参与染色体末端端粒的复制过程的复制的酶，有蛋白和 RNA组成。端粒复制：反应为四步进行，首先是端粒酶与端粒 DNA结合，端粒酶中的 RNA与凸出的 3引物配对；以 RNA为模板，在 DNA3端上从头合成 DNA；延伸六个 nt；合成一个重复单位后，端粒酶向DNA模板新合成的
8、 3移动，引物再和模板配对，就这样循环往复，周而复始。最后延伸的 3端再回折，以 GG 配对的方式形成发夹结构或通过四链 DNA形成拓扑结构，产生端粒。10.DNA复制的重要性 第三章 DNA损伤及修复 1.DNA损伤类型：氧化、射线、碱基突变、插入、转换、颠换 2.修复途径：错配修复、RecBCD途径；光修复、移位修复；错配修复：(1)识别错配的碱基对；(2)对错配的一对碱基要能准确区别哪一个是错的，哪一个是对的；(3)切除错误的碱基，并进行修复合成。MutS 能识别错配位点，MutL能作用新合成的链，UrrD 是解旋酶可使错配区双链打开，然后 SSB结合在单链上防止复性，MutH作为外切酶
9、将含有错配碱基的新链片段切除掉，再由 DNA Pol进行修补，最后由连接酶把裂缺封闭好。这样就完成了错配修复。的进化和发展遗传是相对的变异是绝对的孟德尔的遗传观念及其在遗传奠定了分子机制基础第一章基因与结构什么是基因什么叫内含子一个或转变化的酶正负螺旋的生物学意义正超嗜热生物特有解旋须要更多的能学习好资料 欢迎下载 RecBCD途径：3.修复系统目标，什么酶包含在每一个修复途径中？4.MutS 和 DisA功能比较？新合成的链中 MutS 的功能，它是怎样识别新链？MutS：DisA：MutS 的功能：新链识别：5.SOS修复；怎样介导？SOS修复：介导：第三章 DNA重组 第三章重组 1.T
10、he recombination event is guided by a set of proteins.RecA.Rad52 重组事件由一系列蛋白指导。RecA.Rad52 （大肠杆菌中涉及重组的酶）Rad52:真核中存在，链交换蛋白组装，在原核中起此作用的是 RecBCD RecBCD系统 具有核酸酶，解旋酶和 ATPase活性。在 Chi位点产生单链 3游离未端；RecBCD酶作用于断裂的 DNA分子以产生单链 DNA区域。RecB,RecC,RecD RecBCD是 ATP依赖的外切酶和解旋酶(外切酶 V)，它与双链断口结合，解开DNA并导入裂口，其倾向性位点称为 chi。RecBC
11、解旋酶活性，RecD去掉后RecBCD失去核酸酶活性。RecA（真 核Rad51）同源 DNA联会及促进链侵入。(1)具有蛋白酶活性;(2)在单链 DNA和 ATP存在的条件下 RecA能启动 DNA单链和与之互补的双链分子进行碱基配对。*（RecG 具有解旋酶活性，可解离 Holliday连接）RuvAB系统 Hollidy联结体识别和分支移位。（具有解离 Holliday连接的活性）RuvA 特异性结合 Holliday联结体 RuvB 是一种 ATPase，它可发动迁移反应 RuvC 拆分 Holliday联结体。的进化和发展遗传是相对的变异是绝对的孟德尔的遗传观念及其在遗传奠定了分子机
12、制基础第一章基因与结构什么是基因什么叫内含子一个或转变化的酶正负螺旋的生物学意义正超嗜热生物特有解旋须要更多的能学习好资料 欢迎下载 2.These breaks are processed into single standed 3end RecBCD 这些片段被加工成单链 3 末端 RecBCD蛋白 3.The single standed 3invades a homology partner DNA duplex which catalyzed by RecA family Proteins 单链 3 侵入一被 RecA蛋白家族催化的同源的 partner DNA 双螺旋（RecA蛋白
13、使单链 DNA取代双链 DNA中的同源部分）RecA操作DNA的活性之一能使单链DNA取代双链分子中同源的链，此反应称为单链取代（single-strand uptake）或单链同化（single-strand assimilation）这种取代反应能发生在各种形状的 DNA分子之间，但一般要具备三个条件：其中一个 DNA分子必须要有一个单链区域；其中一个 DNA分子必须要有一个游离的 3末端；此单链区域和 3末端必须和另一个 DNA分子有互补区。4.Branch migration(RuvAB)accompanied by limited DNA synthesis then leads t
14、o the formation of four-standed structures known as Holiday junctions 伴随限制性 DNA合成发生的分支移位（RuvAB）导致叫做 Holiday junctions 的四分体结构的形成 1、同源 DNA分子的联会 2、引入 DNA断裂 3、链侵入 4、Holliday联结体的移动（分支移位）5、Holliday联结体的剪切 Figure 22.2 The Holliday model of recombination.(a)Nicks occurin the same places in homologous chromos
15、omes(blue and red).(b)Strands of the two chromosomes exchange.(c)Nicks are sealed,permanently 的进化和发展遗传是相对的变异是绝对的孟德尔的遗传观念及其在遗传奠定了分子机制基础第一章基因与结构什么是基因什么叫内含子一个或转变化的酶正负螺旋的生物学意义正超嗜热生物特有解旋须要更多的能学习好资料 欢迎下载 joining the two chromosomes through two of their fourstrands and yielding a Holliday junction.(d)Branc
16、h migration occursby breaking some base pairs and re-forming others.(e)and(f)Theseare simply bends and twists introduced into this illustration of theHolliday junction to make the subsequent events easier to understand.(g)One kind of resolution of the Holliday junction.The same strandsare nicked as
17、were nicked in panel(a).(h)Sealing these nicks leavestwo DNA duplexes with short stretches of“heteroduplex,”containingone strand from each of the recombining partners.This is called noncrossoverrecombination.(i)The alternative resolution of the Hollidayjunction.The strands opposite those nicked orig
18、inally are nicked.(j)When the nicks are sealed,two crossover recombinant DNAduplexes emerge.5.Each recombination ends when RuvC resolves these intermediates.当 RuvC剪切那些中间体时每个重组事件结束 RuvC引起的拆分经识别 Holliday 联结体后，特异的剪切两条同极性的同源 DNA链。形成 5 端磷酸基团末端和 3-OH末端，这些末端可被 DNA连接酶连上。依据剪切不同产生交换产物或非交换产物。RuvC靠识别结构而非特定序列行使功
19、能，但其剪切 DNA只在 5A/T-T-T-G/C 序列的第二个 T后面剪切。都在 1 处剪切产生交换产物，都在 2 处剪切产生非交换产物，在 1、2 处剪切产生交换产物。第三章转座 1.位点特异性重组的机制 位点特异性重组（site-specific recombination）：这种重组的特点是重组发生在特异位点，此位点含有短的同源序列,供位点特异性重组酶识别；重组过程涉及到蛋白的催化的交错切割。2.相变（phase variation）的分子基础 沙门氏菌编码鞭毛的基因中出现的一段 hin-H2启动子，当启动子为正向排列时，H2启动子激活 H2基因表达，H1抑制子表达抑制 H1基因表达；
20、当 hin-H2启动子出现倒置变异时，H2启动子不能启动 H2基因表达，1 抑制子表达受抑制，H1基因激活表达。3.H片段；G 片段；Tn3；Ty；Compia；Grop；内含子；DS-AC H片段：鼠类沙门氏菌中调节 H2基因激活与失活的一段 995bp 的反向重复序列（hin-H2 promotersegment）G片段：噬菌体 Mu鞭毛基因中的一个片段，片段由两组反向的基因组组成，两端有一个 34bp 的反向重复序列，通过片段的倒位变化来调节直接连接在启动子后面的一组基因的表达。Tn3：它们具有邻近的倒转重复位点的常见特征，通常 38bp 长。每一个重复序列的顺式位点缺失都会阻止元件的转
21、座。在靶位产生一个 5bp 的重复，它们携带抗性标记，例如 AMPr。TnA转座的两个阶段是由转座酶和拆分酶完成的。它们由 tnpA 和 tnaR 基因编码，是通过隐性突变鉴定的。在转座阶段中元件末端的作用与在 IS 型元件作用中类似。拆分需要一个特异的内部位点，它是 TnA家族一个的特征。tnpR基因产物具有双功能。它是基因表达的阻遏物，也具有拆分酶功能。Ty：Ty 是酵母转座子（transponson yeast）的缩写。两端为同乡重复序列。在转座的过程中产生了一个特征性的足迹：在已插入的 Ty 因子两侧存在 5bp 的靶 DNA 正向重复序列，Ty 的转座频率要比细菌转录座子低，约为 1
22、0-710-8。在单个 Ty 因子之间可能有歧化。大部分 Ty 因子可分为两类：Ty1 和 Ty917。每个 Ty 因子长 6.3 kb，2 端有 330 bp 的正向重复，叫做。Ty序列有两个开放阅读框，以相同方向表达，但读框不同，但有 13 氨基酸的重叠。TyA的序列编码一种 DNA结合蛋白。TyB序列含有的区域与反转录病毒的反转酶、蛋白酶及整合酶序列具有同源性 的进化和发展遗传是相对的变异是绝对的孟德尔的遗传观念及其在遗传奠定了分子机制基础第一章基因与结构什么是基因什么叫内含子一个或转变化的酶正负螺旋的生物学意义正超嗜热生物特有解旋须要更多的能学习好资料 欢迎下载 Compia：copi
23、a 是最为特殊的反转录的家族。它的名字反映了存在大量密切相关的编码高丰度 mRNAs的序列。copia 因子长约 5kb，末端带有 276bp 的正向重复。正向重复序列本身的两端又存反向重复。在插入位点产生一个 5bp 的正向重复序列。Copia 成分有很高的转录活性，能转录出有 pol A 尾的 mRNA。整个转录物有一个很长的开放阅读框，其蛋白与 Ty因子相似，此表明与反转录病毒的关系。Grop内含子：在 I 类 II 类的某些内含子中含有开放读框，可产生具有三种功能的蛋白。这些蛋白可使内含子（或以其原来的 DNA形式，或作为 RNA的 DNA拷贝）移动（mobile），使内含子可插到一个
24、新的靶位点，这个现象叫做归巢。第 II类内含子具有编码核酸内切酶和反转录酶似的序列，另外成熟酶的活性也与此蛋白有关。第二类内含子由 RNA 介导归巢。DS-AC：若玉米带有野生型 C基因，则胚乳呈紫色，C基因的突变阻断了紫色素的合成，那么胚乳呈白色。在胚乳发育的过程中，突变发生回复导致斑点的产生。回复突变发生在早期发育阶段，紫斑就比较大。McClintock 推测原来的 C突变（无色素）是由一个“可移动的控制因子”引起的，称解离因子（dissociator，Ds）。它可以插入到 C 基因中。我们现在知道这是发生了转座。另一个可移动的控制因子是激活因子（activator，Ac），它的存在可激活
25、 Ds转座，进入 C基因或其他基因，也能使 Ds从基因中转出，使突变基因产生“回复突变”，这就是 Ac-Ds系统。4.反转录 以 RNA 为模板合成原病毒的 DNA 拷贝，并插入宿主细胞的染色体中。5.转座子 可以从 DNA 上一个地方转到另一个地方的遗传因子。转座是一种特殊的遗传重组，将一定的遗传因子从 DNA 上的一个地方移位到另一个地方。6.复制型转座（replicative transposition）和非复制型转座（nonreplicative transposition）复制型转座：这种类型的转座因子在反应中产生重复。因此转座的整个 DNA 序列是原转座因子的一个拷贝，而不是它本身
26、。转座子作为移动的拷贝，即一个拷贝留在原处，另一拷贝插入到新的靶位点。转座是伴随着新拷贝的复制。这种类型的转座涉及到两种酶：一是转座酶，它要作用原来转座子的末端；二是解离酶，它作用在重复的拷贝上。与 TnA相关的一群转座子仅通过复制转座进行移动。非复制型转座：这类转座因子直接从原位点移到靶位点。这种类型又有两种机制：一种是利用供体和受体靶 DNA 序列的连接。IS 和复合转座子 Tn10 及 Tn5 就是用这种机制转座。这涉及到转座子转移时怎样从供体 DNA 上释放出来。这种类型的机制只需要转座酶。另一类非复制型转座是保守转座。非复制转座之后供体分子一种可能是供体消失了；另一种可能是宿主的修复
27、系统能识别此处双链断裂而将它修复。7.反转录转座子（retrotransposns）真核生物的一些转座子通常与反转录原病毒有关，并通过 RNA 为中间体进行转座，此类转座子即为反转录转座子。9.转座原则 1.转座元件本身可导致序列的缺失、插入或将宿主序列转到一个新的位点。2.转座子作为细胞重组系统的底物是通过“同源便携区(Portable region of homology)”的功能实现的。在不同座位(或不同染色体)上同一转座子的两个拷贝可能为相应的重组提供位点。这种交换会产生缺失、插入、倒置或转座。的进化和发展遗传是相对的变异是绝对的孟德尔的遗传观念及其在遗传奠定了分子机制基础第一章基因与
28、结构什么是基因什么叫内含子一个或转变化的酶正负螺旋的生物学意义正超嗜热生物特有解旋须要更多的能学习好资料 欢迎下载 第四章 基因组 1.基因组学 研究基因组的结构、功能及表达产物的学科。基因组的产物不仅是蛋白质，还有许多复杂功能的 RNA。包括三个不同的亚领域，即结构基因组学、功能基因组学和比较基因组学。2.蛋白组学 阐明生物体各种生物基因组在细胞中表达的全部蛋白质的表达模式及功能模式的学科。包括鉴定蛋白质的表达、存在方式(修饰形式)、结构、功能和相互作用等。3.鸟枪法测序 使用基因组中的随机产生的片段作为模板进行克隆的方法。使用限制性内切酶将带有目的基因的 DNA链切成若干小段再使用 DNA
29、连接酶将其整合到载体的基因中,并使其表达。如果在某个细胞中得到了目的产物,就说明整合到该细胞中的 DNA片断就是所需要的 DNA片断。4.YAC和 BAC 酵母人工染色体（YAC)是人工染色体中能克隆最大 DNA 片段的载体，可以插入人工染色体 100-2000kb的外源 DNA片段。YAC是由酵母的自主复制序列、着丝点、四膜虫的端粒以及酵母选择性标记组成的酵母线性克隆载体。左臂含有端粒、酵母筛选标记 Trp1、自主复制序列 ARS 和着丝粒，右臂含有酵母筛选标记Ura3 和端粒，然后在两臂之间插入大片段 DNA构成的。优点 可以容纳更长的 DNA片段，用较少的克隆就可以包含特定的基因组全部序
30、列，从而保持了基因组特定序列的完整性，有利于物理图谱的制作。缺点（1）克隆外源基因易出现嵌合体。（2）有些克隆不稳定。（3）YAC克隆不容易与酵母自身染色体相分离 细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome，BAC）是指一种以 F质粒（F-plasmid）为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，长用来克隆 150kb 左右大小的 DNA片段，最多可保存 300kb 个碱基对。该质粒主要包括 oriS，repE(控制 F质粒复制）和 parA、parB（控制拷贝数）等成分。以 BAC为基础克隆的载体成嵌合体的频率较低，转化效率高，而且以环状结构存在于细菌体内，易于
31、分辨和分离纯化。5.RFLP 限制性片段长度多态性:用于分析相关基因多态性的技术。即用同一种限制性内切酶，完全酶切来源于同一物种不同个体的基因组 DNA，从而获得长度各异的 DNA片段(酶切谱)。6.STS 序列标签位点：是指根据单拷贝的 DNA 片段两端的序列设计一对特异引物扩增基因组 DNA，产生的一段长度为几百 bp 的特异序列，在基因组中往往只出现一次，能够界定基因组的特异位点 7.EST 表达序列标签：从互补 DNA(cDNA)分子所测得部分序列的短段 DNA(通常 300500bp)。从 cDNA文库所得到的进化和发展遗传是相对的变异是绝对的孟德尔的遗传观念及其在遗传奠定了分子机制
32、基础第一章基因与结构什么是基因什么叫内含子一个或转变化的酶正负螺旋的生物学意义正超嗜热生物特有解旋须要更多的能学习好资料 欢迎下载 的许多表达序列标签集合组成表达序列标签数据库，代表在一定的发育时期或特定的环境条件下，特定的组织细胞基因表达的序列。可用于验证基因在特定组织中的表达，推导全长 cDNA序列，或作为标签标志基因组中的特殊位点以确定基因的位置等。8.SNP 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的 DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的 90%以上。SNP
33、在人类基因组中广泛存在，平均每 5001000 个碱基对中就有 1 个，估计其总数可达 300 万个甚至更多。染色体步移 从第一个重组克隆插入片段的一端分离出一个片段作为探针从文库中筛选第二个重组克隆，该克隆插入片段含有与探针重叠顺序和染色体的其他顺序。从第二个重组克隆的插入片段再分离出末端小片段筛选第三个重组克隆，如此重复，得到一个相邻的片段，等于在染色体上移了一步，故称之为染色体步移（Chromosome Walking），是一种重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。9.CPG岛 基因组中长度为 3003000 bp 的富含 CpG二核苷酸的一些区域，
34、主要存在于基因的 5区域。启动子区中CpG岛的未甲基化状态是基因转录所必需的，而 CpG序列中的 C的甲基化可导致基因转录被抑制。10.Rough draff of a genome and final draff of a genome?Rough draff 允许的误差是 1%，final draff 允许的误差是 0.01%11.CDNA microarray cDNA微阵列芯片.微阵列上印有大量已知部分序列的 cDNA 探针,微阵列技术就是利用分子杂交原理,使同时被比较的标本(用同位素或荧光素标记)与微阵列杂交,通过检测杂交信号强度及数据处理,把他们转化成不同标本中特异基因的丰度,从而
35、全面比较不同标本的基因表达水平的差异.第五章原核生物转录 1.RNA聚合酶构造 每种细菌都编码 RNA聚合酶，其作用和 DNA 聚合酶相似。大肠杆菌 RNA聚合酶是四聚体的核心酶(core enzyme)，包含和亚基，分子式为2。这对转录延伸已足够，但起始还需要一个称为的亚基，加入亚基后称为全酶(holoenzyme).2.Sigma（）因子的功能 因子有两个功能：它识别启动子并将封闭的启动子复合物转换成开放的状态。一旦转录起始，因子从全酶中脱离。核心酶能与 DNA结合，但效率低，特异性差。因子的基本功能是增加 RNA聚合酶对启动子的特异性结合，减少非特异性结合。3.启动子 域中的基序并与之结
36、合，启动转录的起始。一般将 DNA 上的转录位点定位+1 来排序，其下游（右侧）为正值，其上游（左侧）为负值。原核生物不同基因的启动子虽然结构也有一定的差异，但明显具有共同的特点。结构典型，都含有识别（R），结合（B）和起始（I）三个位点；序列保守，如-35 序列，-10序列结构都十分保守；位置和距离都比较恒定；直接和多聚酶相结合；常和操纵子相邻；都在其控制基因的 5端；决定转录的启动和方向。4.核心酶(holoenzyme)与全酶 核心酶：大肠杆菌 RNA聚合酶是四聚体的核心酶(core enzyme)，包含和亚基，分子式为2。全酶：核心酶加入亚基后称为全酶 5.转录起始阶段 起始的过程可分
37、为四个阶段：1.核心酶在因子的参与下与模板的 DNA接触，生成非专一的，不稳定的复合物在模板上移动；2.起始识别：全酶与模板的启动子结合，产生封闭的“酶-启动子二元复合物”（closed binary complex）；3 酶紧密地结合在启动子的-10序列处，模板 DNA局部变性，形成“开放的启动子二元复合体”（open 的进化和发展遗传是相对的变异是绝对的孟德尔的遗传观念及其在遗传奠定了分子机制基础第一章基因与结构什么是基因什么叫内含子一个或转变化的酶正负螺旋的生物学意义正超嗜热生物特有解旋须要更多的能学习好资料 欢迎下载 binary complex）；4.酶移动到转录起始点上，第一个 r
38、NTP转录开始，因子释放，形成酶-启动子-rNTP三元复合体。6.Sigma 片段与启动子片段的相互作用 RNA 聚合酶的核心酶只能起到和模板结合和催化的功能，并不能识别-35 序列，只有亚基才能识别-35序列，选择转录选择模板链，选择转录起始位点。核心酶在因子的参与下与模板的 DNA接触，生成非专一的，不稳定的复合物在模板上移动。当第一个转录产物合成后，因子从全酶上解离。第六章原核生物转录 1.利福平(rifampicin)和链霉溶菌素(streptolydigin)的功能 利福平：抑制 RNA合成的起始。链霉溶菌素：抑制 RNA链的延长。2.RNA 聚合酶 亚基的功能 参与与底物的结合（包
39、括前体核苷三磷酸以及已形成的 RNA链）以及催化磷酸二酯键形成核心。3.酶-DNA-RNA 三元复合体 由于酶的结合，被结合的 DNA中有一个很短的区域（-10序列）熔解，使这个封闭复合体变成一个“开放复合体”（open complex），此开放复合体被称为紧密结合（tight binding）反应。下一步是头两个核苷酸的结合，然后在它们两之间形成磷酸二酯键。这样就产生了含有 RNA，DNA和酶的三元复合体。当起始成功后，酶就释放因子并形成一个由 RNA聚合酶的核心酶-DNA-新生 RNA构成的“转录延伸三元复合体”。4.双链 DNA转录的拓扑结构 在延伸的时候，酶后端边缘的分界线也可作为 R
40、NA链延伸的末端处。即酶的后端向前每移动 1bp，RNA延伸的末端也就加上了一个 rNTP，但酶的前端并没有移动，仍保持原来的位置，只不过酶整体收缩了 1bp的长度。酶内部所覆盖的 DNA双链的开放区及 RNA的生长点（3端）都向前移动了 1 个 bp。当 RNA链已延伸到多个 nt 时，酶的前端突然向前一下子延伸 7-8bp。像是尺蠖向前运动的方式。延伸时 RNA 聚合酶以稳定收缩和突然伸展的方式在 DNA上“爬行”，稳定的收缩是指 RNA聚合酶从 35bp 长连续地收缩到28bp，然后前端又突然向前伸展 8bp,RNA聚合酶又恢复到 35 bp 长。5.Roh 依赖终止 弱终止子需要在一种
41、蛋白质因子的帮助下才能终止，所以又称为依赖性终止子。Roh 依赖终止：（1）.转录进行，因子结合在新合成的 RNA链上，因子与 RNA聚合酶中夹着核糖体；（2）.转录进行到终止序列时，转录停止，核糖体解离，因子追赶上 RNA 聚合酶，在转录泡中因子解开 DNARNA杂合链；（3）。RNA聚合酶转录终止，释放因子和 RNA链。、还有一种依赖性终止子，它可形成茎环结构，但在茎中的 G.C 含量少，茎环易打开。在其 3端没有寡聚 U，因此 RNA 聚合酶合成此段 RNA后，由于茎环的存在可使聚合酶暂停一下，若此时因子追上来和聚合酶结合，那么转录即可终止，若无因子聚合酶还可越过终止进行“通读”。6.R
42、oh 不依赖终止 转录的终止不依赖 因子，就能自行终止。其特点有：有回文结构存在。由它转录出 mRNA可形成茎环结构，可阻止 RNA 聚合酶的前进；茎的区域富内含 G-C，使茎环不易解开；强终止子 3端上有 6 个 U，由于它和模板形成的连续 U-A配对较易打开，从而便于释放出 RNA。第七章原核生物转录调控 1.举例说明一下操纵子 包括结构基因和控制区以及调节基因的整个核苷酸序列叫做操纵子。就乳糖操纵子来说，从结构基因溯流而上而仅靠结构基因的部分叫做操纵子；它是调节基因阻遏蛋白的结合位点。2.lac 乳糖操纵子的正负调控 正调控：在乳糖存在同时葡萄糖缺乏的时候，CAP（CRP）结合在 CAP
43、位点上，从而激活 RNA聚合酶结合在 lac 操纵子的启动子上，激活 lac 的表达。负调控：当环境中不存在乳糖是，lac 抑制子基因表达成 lac 抑制子，lac 抑制子以四聚体形式结合在 lac 操的进化和发展遗传是相对的变异是绝对的孟德尔的遗传观念及其在遗传奠定了分子机制基础第一章基因与结构什么是基因什么叫内含子一个或转变化的酶正负螺旋的生物学意义正超嗜热生物特有解旋须要更多的能学习好资料 欢迎下载 纵子的特异性位点，阻挡了 RNA聚合酶结合在启动子上，进而阻挡 lac 基因的转录表达。3.CAP激活的分子机制 葡萄糖降低细胞内小分子-cAMP的浓度，这一分子是 CAP的变构因子：只有当
44、 CAP与 cAMP形成复合物时，CAP蛋白才会形成结合 DNA的构象。因此，只有当 cAMP水平高（葡萄糖降低）时，CAP才会结合DNA，激活 lac 基因。CAP被 RNA聚合酶的 亚基的 CTD识别。当 RNA聚合酶与 CAP相互作用时，CTD也在靠近 CAP位点处与 DNA接触，启动 lac 的表达。4.隐性突变（recessive），顺式显性突变，顺式-反式显性突变，显性失活突变 隐性突变：突变发生在半乳糖苷酶或半乳糖苷透明质酸酶上，从而导致菌种不能在乳糖的诱导下启动 lac的表达进而利用乳糖，导致乳糖在细胞内的积累。顺式显性突变：野生型等位基因为阻遏性状纯隐性时，在一对等位基因操纵
45、子上的一个突变将突变细胞的额纯隐性性状转变为脱阻遏的显性性状。这种突变即为。顺式-反式显性突变：显性突变发生在二倍体不同对的等位基因上，导致诱导物不再能诱导 lac 的表达。显性失活突变：lac 的抑制子基因发生突变，使得四聚体抑制子不能再结合到特异位点上从而导致的抑制失活性状。5.举例说明 lacO 是 lac 1 抑制子的靶位点 Cohn 的滤膜实验证明，组成型突变操纵子比野生型操纵子需要更多的抑制子来完成抑制子的全部结合到操纵子上，说明 lac 是 lac 1 抑制子的靶位点。6.举例说明 RNA多聚酶在存在 lac 抑制子时和 lac 启动子形成开放式启动子复合物 Lee and Go
46、ldfarb 的实验表明在同时添加抑制子和诱导物的实验组中，放射性标记表明 RNA的合成与同时不添加抑制子和诱导物的对照组中情况一样，而与只添加抑制子不添加诱导物的实验组不同。说明在诱导物的存在下，RNA多聚酶在即便存在 lac 抑制子时还能 lac 启动子形成开放式启动子复合物，启动转录的进行。细菌转录起始阶段，聚合酶与启动子初步结合形成闭合式复合体，尔后发生聚合酶结构变化、DNA解链最终形成开放式复合体。Lac抑制子结合 lac 操纵子时，阻止了 RNA聚合酶在启动子上的结合和 RNA合成的起始。细菌中，Lac抑制子只在乳糖缺乏的时候才结合 DNA从而抑制转录，在乳糖存在时，抑制子没有活性
47、。They incubated E.coli RNA polymerasewith DNA bearing an E.coli promoter known asthe lac UV5 promoter.Along with the polymerase andDNA,they included heparin,a negatively charged polysaccharidethat competes with DNA in binding tightly tofree RNA polymerase.The heparin prevented any reassociationbetwe
48、en DNA and polymerase released at the endof a cycle of transcription.These workers also includedlabeled ATP in their assay to label the RNA products.Then they subjected the products to gel electrophoresis tomeasure their sizes.They found several very smalloligonucleotides,ranging in size from dimers
49、 to hexamers(2 6 nt long),as shown in Figure 6.12.The sequences ofthese oligonucleotides matched the sequence of the beginningof the expected transcript from the lacZ promoter.Moreover,when Carpousis and Gralla measured theamounts of these oligonucleotides and compared them tothe number of RNA polym
50、erases,they found manyoligonucleotides per polymerase.Because the heparin inthe assay prevented free polymerase from reassociatingwith the DNA,this result implied that the polymerase wasmaking many small,abortive transcripts without everleaving the promoter.Thus,we see that transcription initiation