《[精选]例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽19579.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《[精选]例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽19579.pptx（93页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、1江南大学生物工程学院2有关谷胱甘肽的基本知识 生物活性三肽化合物 小分子硫醇类化合物 含有-肽键 主要有还原型（GSH）和氧化型（GSSG）两种形态3谷胱甘肽的形态转换 图1-1 酵母细胞中谷胱甘肽的形态转化过程 4谷胱甘肽在自然界中的分布情况动物：肝脏、肾、红细胞和眼睛晶状体植物：蔬菜、豆类、谷物、薯类、菇类微生物：酵母（主要为Saccharomyces属和Candida属）谷胱甘肽主要以GSH形式存在，大多数生物细胞中GSH与GSSG的比例约为100:1。5谷胱甘肽的功能 维持生物体内适宜的氧化还原环境 广泛用于生物化学、医学、生物学和化学的研究测定 GSH可以迅速增强机体的免疫力 对消
2、化系统、呼吸系统和新陈代谢等都有很大帮助 GSH具有消除疲劳的作用 近年来还发现GSH具有抑制艾滋病病毒的功效 加拿大麦基尔大学教授古特曼博士这样预测：“GSH很快就会象胆固醇一样深入民心，成为人们衡量健康的指标之一”。6 GSH多用于治疗肝脏疾病 解毒 抗辐射 抗肿瘤、癌症 抗氧化衰老 协调内分泌 疗效明显且无副作用，这些同类药物所不具有的优点使得GSH在临床医药领域有着极为广泛的用途。谷胱甘肽应用于临床7表1-1 GSH的生理功能及其在临床上的应用 8谷胱甘肽应用于食品行业 GSH具有独特的生理功能，被称为长寿因子和抗衰老因子 GSH在强化食品风味的同时对人体有保健作用 它在食品行业的应用
3、前景显然要优于其它类型的防腐剂或抗氧化剂表1-2 GSH在食品加工业中的用途 9谷胱甘肽的应用前景医药工业食品工业体育运动生物研究GSH有一个巨大的市场研究兴趣日益增长需求量不断增加昂贵的市场价格GSH在各领域中的广泛应用限制10谷胱甘肽的制备方法 有机溶剂萃取法 化学合成法 生物技术法 酶转化法 发酵法11酶法合成谷胱甘肽 谷胱甘肽合成酶系酶活的提高 ATP再生系统的构建 E.coli 细胞中的乙酸激酶反应 S.cerevisiae 细胞中的糖酵解途径 固定化酶（细胞）技术的应用 提高ATP的转移效率以及增加ATP在反应体系中的稳定性，以实现ATP再生系统的高效运行。12发酵法生产谷胱甘肽
4、高产菌株的选育 发酵过程的优化及控制 基因工程菌在谷胱甘肽生产中的应用 13高产菌株的选育 图1-3 高产GSH酵母菌株的选育方法与结果 14 发酵条件优化 营养成分的选择 培养条件的优化 发酵过程控制 控制葡萄糖的浓度：流加发酵 控制细胞比生长速率：提高比GSH合成速率 前体物质的添加 添加策略：一次性添加、连续添加等发酵过程的优化及控制15基因工程技术的应用 提高GSH合成酶系的酶活：增加质粒的拷贝数 降低酶系对GSH的敏感性：构建脱敏菌株 ！需要考虑质粒的稳定性 ！16发酵法生产谷胱甘肽研究中仍存在的问题 对C.utilis发酵生产GSH的细胞生长规律和GSH合成特性还缺乏了解 还没有发
5、现从发酵动力学的角度，来分析并获得GSH发酵过程中出现的 规律性结果 在流加发酵中，高细胞密度和高GSH合成能力的矛盾还没有解决 未见运用代谢理论及其手段为GSH合成过程中发生的变化寻求合理的解释 如何将胞内GSH分泌至胞外也需要深入研究17发酵法生产谷胱甘肽研究的意义 日本协和发酵和味之素公司在上世纪80年代就已实现GSH的 工业化生产，并基本垄断国际市场 我国在该方面的研究相对滞后 日本以明显的差价将GSH销往欧美和我国（欧美250美元/kg，我国450美元/kg）因此，大力研制开发并获得具有自主知识产权的GSH生产技术，对于我国功能食品和医药工业的发展都具有重要的意义。18发酵过程优化原
6、理外因：基于微生物反应原理的培养环境优化技术基于微生物反应原理的培养环境优化技术内因：基于代谢特性的分阶段培养技术基于代谢特性的分阶段培养技术外因定量化：基于动力学模型分析的优化和控制技术基于动力学模型分析的优化和控制技术内因定量化：基于代谢通量分析的过程优化技术基于代谢通量分析的过程优化技术19微生物细胞基于微生物反应原理基于微生物反应原理的培养环境优化技术的培养环境优化技术(外因）外因）创造一个适于微生物创造一个适于微生物生长和代谢的环境生长和代谢的环境关键技术 1在一个生物反应体系中20基于代谢特性基于代谢特性的分阶段培养技术的分阶段培养技术(内因）内因）基于微生物反应原理基于微生物反应
7、原理的培养环境优化技术的培养环境优化技术(外因）外因）创造一个适于微生物创造一个适于微生物生长和代谢的环境生长和代谢的环境关键技术 2在一个生物反应体系中控制细胞代谢特性，控制细胞代谢特性，与优化的环境相适应与优化的环境相适应21基于代谢特性基于代谢特性的分阶段培养技术的分阶段培养技术(内因）内因）基于动力学模型分析基于动力学模型分析的优化和控制技术的优化和控制技术(外因，定量化）外因，定量化）关键技术 3在一个生物反应体系中控制细胞代谢特性，控制细胞代谢特性，与优化的环境相适应与优化的环境相适应基于微生物反应原理基于微生物反应原理的培养环境优化技术的培养环境优化技术(外因）外因）22基于代谢
8、特性基于代谢特性的分阶段培养技术的分阶段培养技术(内因）内因）基于动力学模型分析基于动力学模型分析的优化和控制技术的优化和控制技术(外因，定量化）外因，定量化）关键技术 4在一个生物反应体系中基于微生物反应原理基于微生物反应原理的培养环境优化技术的培养环境优化技术(外因）外因）基于代谢通量分析基于代谢通量分析的过程优化技术的过程优化技术(内因，定量化）内因，定量化）23本研究的主要内容 课题来源：江苏省高校高新技术产业发展项目“微生物发酵法生产谷胱甘肽”研究目标：酵母细胞和GSH的高产量、高得率和高生产强度研究内容：（6个部分）产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件产朊假丝酵母发酵生产谷
9、胱甘肽的营养及环境条件 谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学 流加发酵法生产谷胱甘肽流加发酵法生产谷胱甘肽 前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用 谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析 表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响24 产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件 谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学 流加发酵法生产谷胱甘肽流加发酵法生产谷胱甘肽 前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用前体氨基酸在谷胱甘肽
10、过量合成中的作用 谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析 表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响 25碳源种类对谷胱甘肽发酵的影响 表2-1 各种碳源对细胞生长及GSH合成的影响 26图2-2 糖类碳源对细胞生长及GSH合成的影响 Glucose;Sucrose;Fructose 27氮源种类对谷胱甘肽发酵的影响 图2-3 各种氮源对细胞生长及GSH合成的影响 Beef extract;Peptone;Yeast extract;Urea;(NH4)2SO4;NH4Cl;NaNO3 28混合氮源对谷胱甘肽发酵的影响 图2-4 混合氮源（硫
11、酸铵+尿素）对细胞生长及GSH合成的影响 Mixed nitrogen source concentration:6 gL-1;8 gL-1;10 gL-1 29KH2PO4和MgSO4对谷胱甘肽发酵的影响 图2-5 不同浓度磷酸二氢钾和硫酸镁对GSH生物合成的影响 GSH concentration;DCW;GSH content 30谷胱甘肽发酵的营养条件正交优化试验 表2-2 L16(45)正交试验因素水平表 31表2-3 正交试验数据及BP神经网络处理结果 32图2-6 正交试验结果直观分析 GSH concentration;DCW;GSH content 以提高GSH产量为目的（即
12、Y2最大化），通过直观分析图获得的较优化的营养条件组合为A2B3C2D4E2，即葡萄糖浓度30gL-1，(NH4)2SO4浓度4gL-1，尿素浓度4gL-1，KH2PO4浓度3gL-1，MgSO4浓度0.25gL-1。这与BP神经网络预测的结果是一致的。33环境条件对谷胱甘肽发酵的影响 图2-7 环境条件对C.utilis WSH 02-08细胞生长及GSH合成的影响 GSH concentration;DCW;GSH content 34 C.utilis WSH 02-08 生产谷胱甘肽的摇瓶发酵过程 图2-8 C.utilis WSH 02-08摇瓶发酵生产GSH过程曲线 Residua
13、l glucose;pH;GSH concentration;DCW;GSH content 35摇瓶分批补糖方式对谷胱甘肽发酵的影响 表2-4 摇瓶中不同补糖方式对GSH发酵的影响 36本章小结：1、确定了 C.utilis WSH 02-08发酵生产 GSH培养基的营养成分 及其浓度组合；2、以实现细胞的高产和 GSH的高合成为目标，获得了较优的 环境条件组合；3、摇瓶发酵结果表明，DCW最大值达 9.0 gL-1，GSH最大浓度 208.3 mgL-1，胞内GSH含量2.35%；4、总糖浓度固定的情况下，适当的补糖策略对 GSH的合成有 一定的促进作用。37 产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽
14、的营养及环境条件产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件 谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学 流加发酵法生产谷胱甘肽流加发酵法生产谷胱甘肽 前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用 谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析 表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响 38溶氧对谷胱甘肽分批发酵的影响 图3-1 不同搅拌转速下发酵过程的溶氧变化趋势1350 rmin-1;2300 rmin-1;3250 rmin-1;4200 rmin-1 39图3-2 不同搅拌转速下的GSH分批发酵
15、过程 200 rmin-1;250 rmin-1;300 rmin-1;350 rmin-1 40不控制pH的谷胱甘肽发酵过程 图3-3 不同pH控制方式下 GSH发酵过程曲线 glucose;DCW;extracellular GSH;intracellular GSH;pH;total GSH;intracellular GSH content;Panel A-C,no pH control;Panel D-F,pH 5.5 发现低pH培养环境下，产朊假丝酵母胞内合成的GSH大量向胞外渗漏41控制恒定pH时的谷胱甘肽发酵过程 图3-4 不同恒定pH条件下GSH发酵各过程参数比较 DCW;P
16、GSH;qP;GSH content;GSH concentration;YX/S;YP/S 42基于动力学模型解析pH对谷胱甘肽发酵的影响 表3-2 不同pH下GSH分批发酵动力学参数模拟结果 KI表示底物浓度对细胞生长的抑制程度，且KI值越高则抑制效应越低。43图3-5 不同pH条件下GSH合成能力及细胞生长比较 pH为5.5时GSH总量达到最大，从动力学角度分析，是因为在这一pH下兼具了KI值高（底物对细胞生长的抑制效应小）、值低和值高（细胞生长过程中和生长结束后均可保持较高的比GSH合成速率）的特点。为直线斜率，表示在相同的条件下，细胞合成GSH能力的强弱；为截距，反映生长停止后（=0
17、）细胞继续合成GSH能力的高低。44不同温度下的谷胱甘肽发酵过程分析图3-6 不同温度条件下GSH发酵过程及动力学参数随时间变化情况 and curve 1,32C;and curve 2,30C;and curve 3,28C;and curve 4,26C;and curve 5,24C 45表3-3 不同温度条件下GSH分批发酵过程参数比较 46细胞生长动力学模型及其参数估计 表3-4 不同温度下细胞生长动力学参数模拟结果 47谷胱甘肽合成动力学模型及其参数估计 表3-5 不同温度下GSH合成动力学参数模拟结果 48图3-7 温度对C.utilis WSH 02-08细胞生长动力学参数的
18、影响及其模拟 不同温度和葡萄糖浓度下的细胞浓度随时间变化情况：49图3-8 C.utilis WSH 02-08细胞生长动力学模型的验证A:Temperature 29C,initial glucose concentration 28.3 gL-1B:Temperature 30C,initial glucose concentration 33.2 gL-1 50分阶段温度控制策略的提出与实现 表3-8 不同温度下分批发酵8 h前后的平均比生长速率 和平均比GSH合成速率比较结果 51图3-9 分阶段温度控制策略下的GSH发酵过程曲线 Glucose;GSH;DCW 52表3-3 不同温度
19、条件下GSH分批发酵过程参数比较 53本章小结：1、在满足细胞生长的范围内，溶氧对胞内GSH含量影响不大。在葡萄糖浓度为30 gL-1且通气量1.2 vvm的情况下，将搅拌转速恒定在300 rmin-1即可满足细胞生长和GSH合成对溶解氧的需求；2、不控制pH时，发酵液pH迅速下降，至pH 1.5时胞内合成的GSH开始向胞外 渗漏，最终DCW和GSH产量比pH 5.5时的发酵结果分别低27%和95%，且GSH的胞外渗漏量约占GSH合成总量的50%；3、在pH 4.06.5范围内，pH 5.5时最有利于GSH的合成。从分批发酵动力学角度进行分析，解释了pH对细胞生长和GSH合成的影响这一生理学现
20、象；544、在24C32C范围内，较高温度对C.utilis WSH 02-08细胞生长有促进作用，而较低温度更有利于GSH的合成；5、根据细胞生长动力学参数，得到24C32C范围内GSH分批发酵过程中细胞浓度同温度以及底物浓度之间的一般关系式：验证实验结果表明，该模型在24C32C范围内可用于预测不同温度下的细胞生长情况；6、提出分阶段温度控制策略：发酵起始温度30C，8 h后切换至26C并保持到发酵结束。结果表明，分阶段温度控制策略的实施可以进一步提高GSH的合成能力，其中GSH产量分别比在26C和30C时提高了5%和23%，而胞内GSH含量更是高达2.61%。因此，该策略具有很好的实用性
21、。55 产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件 谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学 流加发酵法生产谷胱甘肽流加发酵法生产谷胱甘肽 前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用 谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析 表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响56初糖浓度对谷胱甘肽分批发酵的影响 图4-1 不同初糖浓度下的GSH发酵过程 17.2 gL-1;25.2 gL-1;33.2 gL-1;41.8 gL-1;49.9 gL-1 57表
22、4-1 不同初糖浓度下的GSH发酵过程参数比较 58分批补料培养生产谷胱甘肽的发酵过程 图4-2 分批补料培养方式下的GSH发酵过程 Glucose;DCW;GSH;GSH content 59恒速流加发酵对谷胱甘肽生产的影响 图4-3 葡萄糖恒速流加下 的GSH发酵过程 Glucose;DCW;GSH;GSH content;A-B,4.2 gL-1h-1;C-D,5.0 gL-1h-1;E-F,6.4 gL-1h-1 60指数流加发酵对谷胱甘肽生产的影响 图4-4 葡萄糖指数流加培养下的GSH发酵过程 Glucose;DCW;GSH;GSH content61不同培养方式下谷胱甘肽生产情况
23、比较 表4-2 不同培养方式下细胞生长和GSH合成过程参数比较 a Fed-batch(1),(2),(3)were representative for glucose feeding at constant rate of 4.2 gL-1h-1,5.0 gL-1h-1 and 6.4 gL-1h-1,respectively,while Fed-batch(4)was representative for the cultivation mode of glucose feeding at a exponential rate.b qP refers to specific GSH pr
24、oduction rate.62本章小结：1、不同葡萄糖浓度下的实验结果表明，仅通过分批培养难以实现细胞和 GSH 高产量、高得率和高生产强度的有机统一；2、分批补料、恒速流加和指数流加等几种培养方式都可以实现酵母细胞和 GSH的高产量，其中指数流加还可以同时提高细胞和 GSH的生产强度。经 过48 h的指数流加培养，DCW达 到 40.9 gL-1，GSH产量和胞内 GSH含量均 达到最大值857.2 mgL-1和2.25%。63 产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件 谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学 流加发酵法
25、生产谷胱甘肽流加发酵法生产谷胱甘肽 前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用 谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析 表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响 64L-谷氨酸添加对谷胱甘肽发酵的影响 图5-1 L-谷氨酸的添加对GSH发酵的影响 0 h;6 h;12 h;16 h 65甘氨酸添加对谷胱甘肽发酵的影响 图5-2 甘氨酸的添加对GSH发酵的影响 0 h;6 h;12 h;16 h 66L-半胱氨酸添加对谷胱甘肽发酵的影响 图5-3 L-半胱氨酸对GSH摇瓶发酵的影响 0 h;4 h;8 h;12
26、h;16 h 67分批发酵中L-半胱氨酸对谷胱甘肽过量合成的作用 图5-4 L-半胱氨酸对分批发酵过量合成GSH的影响 Glucose;DCW;GSH;Residual thiols;Total thiol;GSH content;A-B,添加8mmo/L的LCys;C-D,添加16mmo/L的LCys 68流加发酵中添加L-半胱氨酸促进谷胱甘肽的合成 图5-5 L-半胱氨酸对流加发酵培养生产GSH的影响 Glucose;DCW;GSH;Residual thiols;Total thiol;GSH content 69L-半胱氨酸对不同培养方式下GSH生产影响的比较 表5-1 L-半胱氨酸添
27、加对不同培养方式下GSH合成的影响 a Average qP here refers to the average specific GSH production rate after L-cysteine addition.b Average qP here was representative for the average specific GSH production rate of the whole process.70本章小结：1、L-谷氨酸和甘氨酸在细胞不同生长阶段的添加对GSH发酵过程并无太 大的影响，L-半胱氨酸虽然对细胞生长有抑制作用，但可以大幅度提 高GSH产量和胞内G
28、SH含量；2、对于分批发酵来说，在L-半胱氨酸添加前后，GSH的合成量约各占总 量的50%，对于流加发酵，最终GSH产量可以高达1150 mgL-1；3、总体上来看，L-半胱氨酸对GSH发酵的影响主要表现在GSH产量和胞 内GSH含量提高的幅度上，以及添加前后GSH平均比合成速率变化的 差异上。71 产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件 谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学 流加发酵法生产谷胱甘肽流加发酵法生产谷胱甘肽 前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用 谷胱甘肽分批发酵过程代谢网
29、络分析谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析 表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响 72 代谢工程的概念起源于上世纪 90年代初，实质是对细胞代谢通量及其控制进 行定量分析，并对代谢进行合理改造，以最大限度提高目的代谢产物的产率 涉及生理学、分子生物学、生物化学及生物途径工程学等多门学科 常用的定量方法有代谢控制分析、代谢通量分析、生化系统理论、途径分析、控制论模型等 代谢通量分析模型（MFA）是代谢工程基础研究中最主要的计算代谢途径中 各物质通量的手段 MFA假定细胞内的物质、能量处于拟稳态，在测定胞外代谢物浓度和菌体组 成的基础上，根据物料平衡和已知的代谢途径计算
30、细胞内的代谢通量 代谢工程的基本知识73图6-1 C.utilis WSH 02-08分批培养合成GSH的代谢网络结构模型 74代谢通量的计算 代谢通量分析（MFA）最主要的基础是拟稳态假设 采用化学计量方程对各代谢物的质量平衡进行计算 Ar=X 计算原则 1、矩阵A中元素的确定遵循“反应为负，生成为正”和“1 C-mol基准”原则；2、代谢物通量都是以消耗葡萄糖的比速率为基准的相对碳摩尔通量，葡萄糖 的摄入（r1）以100计。75图6-2 GSH分批发酵第一阶段的代谢通量分布（06 h）76图6-2 GSH分批发酵第二阶段的代谢通量分布（614 h）775.6图6-2 GSH分批发酵第三阶段
31、的代谢通量分布（1430 h）785.3图6-3 分阶段温度控制策略下GSH分批发酵第三阶段的代谢通量分布 795.0图6-4 L-半胱氨酸添加后GSH分批发酵第三阶段的代谢通量分布 80本章小结：1、分析了 C.utilis WSH 02-08细胞生物合成 GSH的代谢网络，发现在分批发酵 前期，HMP途径代谢活跃，为细胞的生物合成提供足够的 NADPH；在发 酵中后期，EMP途径和 TCA循环代谢加强，产生更多的 NADH和FADH2进 入呼吸链被氧化而产生ATP以供给细胞代谢维持的需要；2、温度的切换（30C26C）使更多的 NADPH参与到 CYS的合成成为可能，而经过 SER进 入
32、CYS碳通量的增加，直接的结果是流向 GC和GSH碳通量的 增加，因而提高了GSH的产量；3、L-半胱氨酸的添加使 HMP途径近似于关闭，碳通量直接进入 EMP途径和 TCA循环，同时外加的 L-半胱氨酸使经过 CYS的碳通量大增，最终 GSH产 量提高将近1倍。81 产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件 谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学 流加发酵法生产谷胱甘肽流加发酵法生产谷胱甘肽 前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用 谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析谷胱甘肽分批发酵过程代谢网
33、络分析 表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响 82表面活性剂对细胞生长的影响 图7-1 不同类型表面活性剂对细胞生长的影响 83低浓度离子型表面活性剂对谷胱甘肽合成的影响 图7-2 低浓度离子型表面活性剂对GSH合成的影响 Intracellular GSH;Extracellular GSH；Total GSH；GSH content 84高浓度离子型表面活性剂对GSH胞外积累的影响 图7-3 高浓度离子型表面活性剂对GSH胞外积累的影响 Extracellular GSH;Intracellular GSH;DCW;GSH content;Total GSH
34、;TGSH/DCW 8 h;16 h;24 h 85非离子型表面活性剂对谷胱甘肽合成的影响 图7-4 非离子型表面活性剂对GSH胞外积累的影响,Intracellular GSH;,Extracellular GSH;,Total GSH;,TGSH/DCW;0 h;16 h 86本章小结：1、离子型表面活性剂 SDS和CTAB对酵母细胞生长存在临界浓度现象，醚类 非离子表面活性剂 Brij30只有在高浓度时才对细胞生长产生部分抑制，而 酯类非离子表面活性剂Tween80对细胞生长几乎没有负面影响；2、低于临界浓度的离子型表面活性剂影响了酵母细胞的 GSH合成能力，但不 能促进 GSH向胞外积
35、累；高于临界浓度时，对于培养后期的酵母细胞内 GSH的胞外分泌具有积极的作用；3、Brij30在一定浓度下对细胞生长和 GSH合成表现出与离子型表面活性剂相 似的特点，但对 GSH的胞外积累贡献不大；Tween80对GSH发酵过程以及 酵母细胞合成GSH的能力几乎没有影响。87结 论(1)以C.utilis WSH 02-08作为微生物发酵法生产 GSH的出发菌株。在单因素实验 的基础上，采用 L1 6(45)正交表安排发酵培养基中各营养组分及其浓度的正交优 化试验，结合 BP神经网络的预测，得到以提高 GSH产量为目标的营养条件组 合为：葡萄糖 30 gL-1，(NH4)2SO4 4 gL-
36、1，尿素 4 gL-1，KH2PO4 3 gL-1，MgSO4 0.25 gL-1。进一步获得了 GSH摇瓶发酵较优的环境条件组合为：初始 pH 6.0、装液量50 mL/500 mL、接种量10%。(2)在C.utilis WSH 02-08发酵生产 GSH的摇瓶培养过程中，26 h时DCW达最大值 9.0 gL-1，28 h时GSH积累至最大浓度 208.3 mgL-1，胞内 GSH含 量 2.35%。在 总糖浓度固定的情况下，合适的摇瓶补糖方式对 GSH合成具有促进作用，最 多可以提高GSH产量约10%，胞内GSH含量也高达2.52%。88(3)在7 L搅拌式发酵罐中进行 C.utili
37、s WSH 02-08分批培养生产 GSH，搅拌转速 对胞内 GSH含量影响较小。因此，当葡萄糖浓度为 30 gL-1且通气量控制在 1.2 vvm时，搅拌转速只要不低于 300 rmin-1即可满足细胞生长和 GSH合成对 溶解氧的需求。(4)不 同 pH控制方式对 GSH分批发酵的影响有较大差异。不控制 pH时，不仅会 引起发酵后期 GSH向胞外渗漏，而且最终 DCW和GSH产量均比恒定 pH条 件 下的结果低。通过对 pH4.06.5范围内的各 GSH分批发酵过程参数进行比较，发现在 pH 5.5最有利于 GSH的合成，并从发酵动力学的角度解释了 pH对细胞 生长和GSH合成的影响这一生
38、理学现象。89(5)根据温度同细胞生长动力学参数之间的内在联系，得到GSH分批发酵过程 中细胞浓度的变化同温度以及底物浓度之间的一般关系式：验证实验结果表明，该模型在24C32C范围内具有很好的适用性。(6)提出了分阶段温度控制策略：发酵起始温度 30C，8 h后切换至 26C并保持 到发酵结束。该温度控制策略的实施可以进一步提高 GSH的合成能力，其 中GSH产量分别比在 26C和30C时提高了 5%和23%，而胞内 GSH含量更是 高达2.61%。90(7)不同葡萄糖浓度下的实验结果表明仅通过分批培养难以实现细胞和 GSH高 产 量、高得率和高生产强度的有机统一。分批补料、恒速流加和指数流
39、加发酵 和分批培养相比均可提高菌体细胞和 GSH的产量和生产强度，其中指数流加 方式下 C.utilis WSH 02-08的细胞干重 40.9 gL-1，GSH产 量 857.2 mgL-1，胞内 GSH含量2.25%，比较适合于GSH的高效生产。(8)L-半胱氨酸对 GSH发酵过程有很大影响，是 GSH合成的关键氨基酸。当 L-半 胱氨酸添加浓度为 8 mmolL-1时，摇瓶下 GSH产量和胞内 GSH含量分别比对照 提高了 91%和106%；分批培养下 GSH产量明显提高，胞内 GSH含量高出将近 一倍；而对于流加发酵，最终 GSH产量可以高达 1150 mgL-1，L-半胱氨酸添 加后
40、的平均比GSH合成速率更是高出110%。91(9)根 据 C.utilis WSH 02-08利用葡萄糖作为唯一碳源时生物合成 GSH的代谢网络，利用代谢通量分析方法分析了典型的 GSH分批发酵不同阶段下各代谢物通量的 变化规律，对分阶段温度控制策略下和 L-半胱氨酸添加时的代谢网络中通量的 改变进行比较，并对这些培养方式下GSH的过量合成进行了解释。(10)离子型表面活性剂 SDS和CTAB对酵母细胞生长存在临界浓度现象，醚类非离 子表面活性剂 Brij30对细胞生长只有部分抑制，而酯类非离子表面活性剂 Tween80对细胞生长几乎没有负面影响。SDS和CTAB对细胞的 GSH合成能力会 产
41、生影响，且高浓度的 SDS和CTAB在发酵后期加入可以使胞内合成的 GSH积 累至胞外；Brij30只能部分促进 GSH的胞外积累，而 Tween80的存在对 GSH的 胞 外积累没有任何作用。921.实现发酵过程优化控制的目标有哪些？如何根据发酵过程的特点实现这些目标的相对统一？举一例进行表述。2.用于发酵过程的优化技术主要有哪些？试详细叙述之，并举一例说明。思考题n n9 9、静夜四无邻，荒居旧业贫。、静夜四无邻，荒居旧业贫。5 5月月-23-235 5月月-23-23Saturday,May 20,2023Saturday,May 20,2023n n1010、雨中黄叶树，灯下白头人。、
42、雨中黄叶树，灯下白头人。14:17:5414:17:5414:17:5414:17:5414:1714:175/20/2023 2:17:55 PM5/20/2023 2:17:55 PMn n1111、以我独沈久，愧君相见频。、以我独沈久，愧君相见频。5 5月月-23-2314:17:5514:17:5514:1714:17May-23May-2320-May-2320-May-23n n1212、故人江海别，几度隔山川。、故人江海别，几度隔山川。14:17:5514:17:5514:17:5514:17:5514:1714:17Saturday,May 20,2023Saturday,Ma
43、y 20,2023n n1313、乍见翻疑梦，相悲各问年。、乍见翻疑梦，相悲各问年。5 5月月-23-235 5月月-23-2314:17:5514:17:5514:17:5514:17:55May 20,2023May 20,2023n n1414、他乡生白发，旧国见青山。、他乡生白发，旧国见青山。20 20 五月五月 2023 20232:17:55 2:17:55 下午下午14:17:5514:17:555 5月月-23-23n n1515、比不了得就不比，得不到的就不要。、比不了得就不比，得不到的就不要。五月五月 23 232:17 2:17 下午下午5 5月月-23-2314:171
44、4:17May 20,2023May 20,2023n n1616、行动出成果，工作出财富。、行动出成果，工作出财富。2023/5/20 14:17:552023/5/20 14:17:5514:17:5514:17:5520 May 202320 May 2023n n1717、做前，能够环视四周；做时，你只能或者最好沿着以脚为起点的射线向前。、做前，能够环视四周；做时，你只能或者最好沿着以脚为起点的射线向前。2:17:55 2:17:55 下午下午2:17 2:17 下午下午14:17:5514:17:555 5月月-23-23n n9 9、没有失败，只有暂时停止成功！。、没有失败，只有暂
45、时停止成功！。5 5月月-23-235 5月月-23-23Saturday,May 20,2023Saturday,May 20,2023n n1010、很多事情努力了未必有结果，但是不努力却什么改变也没有。、很多事情努力了未必有结果，但是不努力却什么改变也没有。14:17:5514:17:5514:17:5514:17:5514:1714:175/20/2023 2:17:55 PM5/20/2023 2:17:55 PMn n1111、成功就是日复一日那一点点小小努力的积累。、成功就是日复一日那一点点小小努力的积累。5 5月月-23-2314:17:5514:17:5514:1714:17
46、May-23May-2320-May-2320-May-23n n1212、世间成事，不求其绝对圆满，留一份不足，可得无限完美。、世间成事，不求其绝对圆满，留一份不足，可得无限完美。14:17:5514:17:5514:17:5514:17:5514:1714:17Saturday,May 20,2023Saturday,May 20,2023n n1313、不知香积寺，数里入云峰。、不知香积寺，数里入云峰。5 5月月-23-235 5月月-23-2314:17:5514:17:5514:17:5514:17:55May 20,2023May 20,2023n n1414、意志坚强的人能把世界
47、放在手中像泥块一样任意揉捏。、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。20 20 五月五月 2023 20232:17:55 2:17:55 下午下午14:17:5514:17:555 5月月-23-23n n1515、楚塞三湘接，荆门九派通。、楚塞三湘接，荆门九派通。五月五月 23 232:17 2:17 下午下午5 5月月-23-2314:1714:17May 20,2023May 20,2023n n1616、少年十五二十时，步行夺得胡马骑。、少年十五二十时，步行夺得胡马骑。2023/5/20 14:17:552023/5/20 14:17:5514:17:5514:17:552
48、0 May 202320 May 2023n n1717、空山新雨后，天气晚来秋。、空山新雨后，天气晚来秋。2:17:55 2:17:55 下午下午2:17 2:17 下午下午14:17:5514:17:555 5月月-23-23n n9 9、杨柳散和风，青山澹吾虑。、杨柳散和风，青山澹吾虑。5 5月月-23-235 5月月-23-23Saturday,May 20,2023Saturday,May 20,2023n n1010、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。14:17:5514:17:5514:17:5514:17:5514:1714:175/
49、20/2023 2:17:55 PM5/20/2023 2:17:55 PMn n1111、越是没有本领的就越加自命不凡。、越是没有本领的就越加自命不凡。5 5月月-23-2314:17:5514:17:5514:1714:17May-23May-2320-May-2320-May-23n n1212、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。14:17:5514:17:5514:17:5514:17:5514:1714:17Saturday,May 20,2023Saturday,May 20,2023n n1313、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。
50、、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。5 5月月-23-235 5月月-23-2314:17:5514:17:5514:17:5514:17:55May 20,2023May 20,2023n n1414、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。20 20 五月五月 2023 20232:17:55 2:17:55 下午下午14:17:5514:17:555 5月月-23-23n n1515、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。五月五月 23 232:17 2:17 下午下午5 5月月-23-2314