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1、第6 章 核 酸Nucleic Acid 概述 核酸的一级结构与序列分析 DNA 的高级结构 DNA遗传物质 DNA 的性质主要内容核酸是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，在生物体内负责生命信息的储存和传递。分类：按其所含戊糖不同分为DNA和RNA。重要性：DNA是主要遗传物质，负责遗传信息的贮存和发布。RNA的功能多样性，参与遗传信息的表达。第1节 概 述1.核酸的概念及研究进展核酸研究史上的大事件 1868年，瑞士青年科学家 F.Miescher 从外科绷带上脓细胞的细胞核中分离得到一种含磷较高的酸性物质，称之为核素（nuclein）。1889年,Altmann 将其纯化，把不含蛋白质的
2、物质称为核酸核酸研究史上的大事件1943年 E.Chargaff 的工作推理出碱基配对的理论1944年 Avery等肺炎球菌转化试验证明DNA是遗传物质 1953年 Watson-Crick 建立了DNA的双螺旋结构模型1958年 Crick 提出遗传信息传递的中心法则1968年 M.W.Niberg 发现遗传密码 1975年 H.M.Temin 和 D.Baltimore 发现反转录酶 1981年 W.Gilbert 和 F.Sanger 建立 DNA测序方法 1985年 PCR技术的发明 1990年 美国启动人类基因组计划(HGP)1994年 中国人类基因组计划启动 2001年 美、英等国
3、完成人类基因组计划基本框架DNA：-D-2-脱氧核糖 A、G、C、TRNA：-D-核糖 A、G、C、U 核 酸（RNA、DNA）核苷酸磷酸核苷戊糖碱基核糖（RNA）脱氧核糖（DNA）嘌呤嘧啶腺嘌呤 鸟嘌呤 胞嘧啶 胸腺嘧啶 尿嘧啶 2.核酸的结构成分戊 糖DNA含脱氧核糖RNA含核糖 嘧 啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶(thymine,T)嘌 呤(purine)腺嘌呤(adenine,A)鸟嘌呤(guanine,G)核酸中除了5类基本的碱基外，还有一些含量甚少的碱基，称为稀有碱基。组成核酸的稀有碱基：I m5C hm5CDHUNNNN
4、ONNNH2OCH3次黄嘌呤5-甲基胞嘧啶 5-羟甲基胞嘧啶二氢尿嘧啶 碱基的酮式一烯醇式互变异构现象正常生理条件下，主要以酮式结构形式存在。核 苷(ribonucleoside)碱基和核糖（脱氧核糖）通过糖苷键连接形成核苷（脱氧核苷）;糖环上的第 1位C原子与嘌呤第9位N原子或嘧啶第1位N原子相连，碱基平面与戊糖平面互相垂直。11嘧啶核甘中嘧啶碱基对核糖的取向只有反式构象嘌呤核甘中嘌呤碱基对核糖的取向有顺式和反式两种构象 核苷（脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。核苷酸(ribonucleotide)核糖核苷的糖环上有三个（5、3、2）游离的羟基，可以形成三种核苷酸；脱氧
5、核糖核苷酸有两个（5、3）游离羟基，形成两种核苷酸。但天然的只发现5连接磷酸的核苷酸，5-核苷酸是核酸的基本单位。核苷酸：AMP、GMP、UMP、CMP脱氧核苷酸：dAMP、dGMP、dTMP、dCMP 核苷酸的磷酸化核苷一磷酸（NMP）核苷二磷酸（NDP）核苷三磷酸（NTP）ADPAMPATPNNNCHCCHN COPOO P P OOOHHHOHOHHCCHOHOOHOHOH OCH2NH212 354作为合成核酸的原料：如用ATP，GTP，CTP，UTP合成RNA，用dATP，dGTP，dCTP，dTTP合成DNA。作为能量的贮存和供应形式：除ATP之外，还有GTP，UTP，CTP等。核
6、苷酸的生理功能参与代谢或生理活动的调节：如环核苷酸cAMP和cGMP作为激素的第二信使。参与构成酶的辅酶或辅基：如在NAD+,NADP+,FAD,FMN,CoA中均含有核苷酸的成分。作为代谢中间物的载体：用UDP携带糖基，用CDP携带胆碱，乙醇胺或甘油二酯，用腺苷携带蛋氨酸等。核酸的结构基础核苷酸残基通过与前一分子核苷酸3OH和后一分子核苷酸5磷酸基均形成3,5 磷酸二酯键，这样鱼贯联结成链状聚合物；包括250个核苷酸的短核苷酸链称为寡核苷酸；大于50个核苷酸的核苷酸链称为多聚核苷酸，即核酸。3,5 磷酸二酯键自由的 5 磷酸基团自由的3 OHA G P5 P T PG PC PT P OH
7、3 5 pApGpTpGpCpT-OH 3 5 A G T G C T 3 书写及阅读方向：从5端（左侧）到3端（右侧），ApG 表示(A-3)-P(5-G)。3.核酸的种类、分布及功能转移转移RNA(transfer RNA:RNA(transfer RNA:tRNAtRNA)信使信使RNA(messenger RNA:RNA(messenger RNA:mRNAmRNA)核糖体核糖体RNA RNA(ribosomal RNA:ribosomal RNA:rRNA rRNA)脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA）核糖核酸（ribonucleic acid,RNA）
8、:DNA(脱氧核糖核酸)RNA（核糖核酸）分布98%于细胞核中，少量存于线粒体和叶绿体中90%cell质中，10%细胞核中，tRNA 15%，mRNA 5%,rRNA 80%生物功能遗传物质基础，储存和传递遗传信息基因表达，指导蛋白质合成，生物催化,有时RNA也是遗传物质核糖D2脱氧核糖 D核糖碱基A、C、G、T A、C、G、U磷酸磷酸 磷酸核酸的分布及功能RNA的分类及功能4.核酸的紫外吸收核酸的紫外最大吸收峰在波长260nm处蛋白质紫外最大吸收峰在波长280nm处纯DNA样品A260/A280比值为1.8纯RNA样品A260/A280比值2.0以上紫外吸收特性可以鉴定核酸样品的纯度一级结构
9、是指在多核苷酸链中各个核苷酸之间的连接方式、核苷酸的种类、数量以及核苷酸的排列顺序。第2节 核酸的一级结构与序列分析 一、DNA的一级结构与序列分析1.DNA一级结构：4种脱氧核苷酸dAMP、dGMP、dCMP、dTMP按照一定的排列顺序通过磷酸二酯键连接而成的没有分支的多核苷酸链。DNA碱基组成的特点:v具有种的特异性;v没有器官和组织的特异性；v年龄、营养状况、环境的改变不影响DNA的碱基组成；v DNA的碱基组成符合碱基摩尔比例规律。DNA碱基摩尔比例规律 在各种DNA中，腺嘌呤与胸腺嘧啶的摩尔数相等，即AT，鸟嘌呤与胞嘧啶(包括 5-甲基胞嘧啶)的摩尔数相等，即 G C+m5 C；即嘌
10、呤碱基的总摩尔数等于嘧啶碱基的总数：A+G T+C+m5C 这个碱基摩尔比例规律又称为DNA的碱基当量定律，Chargaffs rule。2.DNA测序（sequencing）核酸序列测定方法已经过近20年的发展，测序的具体方法种类繁多。但所依据的基本原理不外乎Sanger的核酸链合成终止法及Maxam和Gilbert的化学降解法两大类。将被测 DNA 制成单链模板，分别加入 4 个反应管中在每个管中加入引物、缓冲液、DNA 聚合酶 和 4 种 dNTP（其中一种为32P标记）；在 1、2、3、4 个管中分别加入 ddTTP、ddCTP、ddGTP 和 ddATP，然后进行保温反应。由于双脱氧
11、的 ddNTP 比正常的 dNTP 少了3-羟基，当它在 DNA 聚合酶作用下掺入到正在延伸的 DNA 链时，因 ddNTP 不含 3-羟基，于是就阻止了其它 dNTP 的继续掺入，起了特异性终止剂的作用。Sanger法的程序双脱氧链终止法DNA的自动测序二、RNA的一级结构与序列分析RNA一级结构：主要为4种核苷酸AMP、GMP、CMP、UMP通过磷酸二酯键连接而成的没有分支的多核苷酸链，RNA 分子中还有某些稀有碱基。RNA种类不同，结构各不相同。1.mRNA的结构与功能占细胞中RNA总量的35；细胞内mRNA的种类很多，分子质量极不均一；mRNA是三类RNA中最不稳定的;作为模板，直接指
12、导蛋白质的合成。真核mRNA 5 端的帽子结构7-甲基鸟苷三磷酸与 mRNA 原来的5端核苷酸连接形成m7GpppN。其作用是：vmRNA的稳定性维系：作为一种保护装置将mRNA 5端封闭起来，可使mRNA免受核酸外切酶的水解破坏；v翻译起始的调控：作为蛋白质合成起始的辨认信号，启动和加速翻译过程。v mRNA核内向胞质的转位帽子结构真核细胞的mRNA 3 末端的结构大多数真核细胞mRNA在3 末端有一个长约 200个核苷酸的polyA;PolyA是在转录后经polyA聚合酶的作用添加上去的，原核生物的mRNA一般无3PolyA;功能：与mRNA从细胞核到细胞质的转移有关；与mRNA的半衰期即
13、稳定性有关（新合成的mRNA其PolyA 链长，而衰老的mRNA其PolyA链较短）。tRNA皆由 7090 个核苷酸组成，有较多的稀有碱基；在三类 RNA 中它的分子质量最小。含 1020%稀有碱基，如 DHU 3末端为 CCA-OH 5末端大多数为G也有pC的 2.tRNA的一级结构特点3.RNA的测序 利用酶的特异性，将RNA的特异核甘酸位点切断后测序；将RNA反转录成cDNA后再用DNA测序法测序。第3节 DNA的高级结构 Watson 和 Crick 于 1953 年在前人研究工作的基础上，根据DNA结晶的X-衍射图谱和分子模型，提出了著名的DNA双螺旋结构模型，并对模型的生物学意义
14、作出了科学的解释和预测，它是上世纪最重大的自然科学成就之一，1962年荣获诺贝尔化学奖。（一）DNA的二级结构1.DNA双螺旋结构的研究背景 碱基组成分析 Chargaff 规则：A=T G C 碱基的理化数据分析 A-T、G-C以氢键配对较合理 DNA纤维的X-射线衍射图谱分析 2.DNA双螺旋结构模型要点 DNA分子由两条方向相反多聚脱氧核糖核苷酸链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。其中一条链的方向为53，而另一条链的方向为35。2.DNA双螺旋结构模型要点 疏水碱基于螺旋的内侧，亲水的磷酸基和脱氧核糖以磷酸二酯键相连成的骨架位于外侧；双螺旋的直径为2nm，沿中心轴形成大沟和小沟交
15、替出现2.DNA双螺旋结构模型要点 碱基呈平面状，与中心轴垂直；相邻碱基平面间的距离为 0.34nm，夹角为36；每10对核苷酸绕中心轴旋转一圈，故螺旋的螺距为 3.4nm。2.DNA双螺旋结构模型要点 两条链碱基对之间形成氢键，碱基的相互结合具有严格的配对规律，即AT、GC配对。A和T之间形成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。TAG C碱基配对3.DNA双螺旋的稳定性 DNA双螺旋结构在生理条件下是很稳定的,维持这种稳定性的因素包括：v 两条DNA链之间形成的氢键。v 碱基堆积力：由于双螺旋结构内部形成的疏水区，消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响。v 介质中的阳离子（如Na+、K+和Mg
16、2+）中和了磷酸基团的负电荷，降低了DNA链之间的排斥力、范德华力等。v 改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳定性。DNA双螺旋结构 DNA，双螺旋，正反向，互补链。A对T，GC连，配对时，成氢键。十碱基，转一圈，螺距34点中间。碱基力和氢键，维持螺旋结构坚。DNA双螺旋结构的多样性Watson和Crick所提出的模型称为B-DNA,B型是最稳定的构型反向重复序列(inverted repeats)回文序列(palindrome)1957年发现在基因的调控区或染色质的 重组部位有DNA的三螺旋结构DNA的三级结构是指双螺旋进一步扭曲、折叠形成的更高层次的空间结构，也就是比双螺旋更为复杂的构
17、象。DNA的三级结构包括线状DNA形成的纽结、超螺旋和多重螺旋以及环状的结、超螺旋和连环等多种类型，其中超螺旋是最常见的三级结构。（二）DNA的三级结构正超螺旋(positive supercoil)处于拧紧状态时所形成的超螺旋(左手超螺旋)负超螺旋(negative supercoil)处于拧松状态时形成的超螺旋(右手超螺旋)天然DNA中的超螺旋都是负超螺旋。超螺旋连环数（linking number,L）DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数扭转数（twisting number,T）DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目 超螺旋数（缠绕数,writhing numb
18、er,W）L=T+W三种环状分子具有相同结构，但L值不同，称为拓扑异构体。自然界存在的所有超螺旋DNA分子都是最初缠绕不足形成的负超螺旋真核生物内，DNA以致密形式存在于细胞核的染色体中。染色体的基本单位是核小体核小体：DNA和组蛋白共同构成核心组蛋白：4种组蛋白(H2A,H2B,H3,H4)形成的8聚体DNA：以负超螺旋缠绕在核心组蛋白上H1在核小体之间起连接作用染色体的基本单位是核小体(nucleosome)核小体的串珠状结构 RNA是单链分子，因此，在RNA分子中，并不遵守碱基种类的数量比例关系，即分子中的嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基的总数。（三）RNA的高级结构发夹式结构 A-U,C
19、-G配对 RNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结构，不能形成双螺旋的部分，则形成突环。这种结构可以形象地称为“发夹型”结构。1.tRNA的二级结构v呈“三叶草”形状，一般可将其分为四臂四环：大致分为氨基酸臂、二氢尿嘧啶环、反密码子环、额外环和TC环五部分。2.tRNA的三级结构tRNA三叶草结构进一步扭曲、折叠形成倒写“”字母的三维结构。tRNA的二级结构与三级结构倒结构三叶草结构 3.rRNA的高级结构 rRNA的种类（根据沉降系数）：真核生物：5S rRNA 28S rRNA 5.8S rRNA 18S rRNA原核生物：5S rRNA 23S rRNA 16S rRNA5S rRNA 与
20、16S rRNA（四）DNA遗传物质 间接证据 直接证据 原核与真核生物DNA的特点间接证据v特定的组织细胞的DNA数量是稳定的，随着组织的复杂，其数量逐渐增加;v年龄、营养状况和环境的改变不影响DNA的数量和组成;v DNA碱基的组成具有种的特异性。直接证据|肺炎球菌的转化实验|噬菌体的感染实验 原核生物与真核生物DNADNA分子中不同排列顺序的DNA区段构成特定的功能单位，即基因(gene)。细胞内染色体所包含的DNA总体称为基因组(genome)。原核生物基因组结构特点l 基因组较小，形式多样，可能是DNA，也可能是RNA，可能是单链,双链的，闭环分子，线性分子；细菌染色体为环状双链DN
21、A分子，与RNA和支架蛋白构成致密区域，称类核(nucleoid)。l 功能相关的结构基因常常串连在一起，并转录在同一个mRNA分子中，称为多顺反子(polycistron)。l DNA分子绝大部分用于编码蛋白质，非编码区通常包含控制基因表达的顺序。l 基因重叠是病毒基因组的结构特点。真核生物基因组结构特点单顺反子(monocistron)，即一个结构基因转录、翻译成一个mRNA分子，一条多肽链;存在大量重复序列，包括卫星DNA、反向重复序列和较复杂的重复单位组成的重复序列;基因组中不编码的区域多于编码区域基因是不连续的，在真核生物结构基因的内部存在许多不编码蛋白质的间隔序列(interven
22、ing sequences)，称为内含子(intron)，编码区则称为外显子(exon)。基因组远大于原核生物的基因组，具有许多复制起点，而每个复制子的长度较小。核酸的降解指通过核酸酶或物理、化学的方法使核酸的3,5磷酸二酯键断裂，多聚核甘酸链变成小段寡聚核甘酸链。第5节 DNA的性质1.降解与变性振荡、搅拌、反复冻融等易导致DNA的降解指DNA分子由稳定的双螺旋结构，松解为单链无规则线性结构的现象。DNA的变性只涉及维持双螺旋稳定性的次级键的断裂，一级结构并不改变。凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件，如过量酸，碱，加热，变性试剂（尿素、酰胺）以及某些有机溶剂（乙醇、丙酮、尿素等）
23、DNA的变性 变性后的 DNA生物活性丧失，同时发生一系列理化性质的改变，包括：粘度下降；沉降系数增加；比旋下降；紫外光吸收值升高等。DNA的变性酸碱变性v低或高的pH值条件趋向影响DNA双螺旋中氢键的形成，导致DNA的变性。低离子浓度v双链DNA浓度过低，带正电荷的物质减少导致DNA 上带负电荷的磷酸基团部分脱防护，使相连的磷酸基团相互斥力增加，使DNA双链分离。Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，50%的DNA分子发生变性时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(melting temperature,Tm)。一般DNA的Tm值在82-95 C之间 热变性G和C的含量
24、高，Tm值高：因而测定Tm值，可反映DNA分子中G、C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)2.44Tm大小可反映出DNA的均一性：均质DNA的熔解过程发生在一个较小的温度范围内；异质DNA的熔解过程发生在一个较宽的温度范围内。介质中的离子强度：低浓度介质中，Tm值低，范围宽。影响Tm值的因素 增色效应（hyperchromic effect）：变性后DNA对260nm紫外光的吸收率比变性前明显增加，这种现象称为增色效应。减色效应（hypochromic effect）：当温度缓慢降低时，吸光率下降，DNA由无规则单链再转变成双链，此时紫外吸收值降低，这种现象称之为减色效应
25、。增色效应DNA的紫外吸收光谱定义：变性DNA在适当的条件下又可使两条彼此分开的链重新缔合成双螺旋，这个过程叫。DNA复性的影响因素：温度和时间DNA浓度 DNA序列的复杂性2.复性与杂交DNA复性退火淬火杂 交定义：在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）就可以在不同的分子间形成杂化双链。这种杂合双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。DNA-DNA杂交双链分子变性 复性 不同来源的D
26、NA分子 核酸的杂交 核酸探针（probe）：一条人工合成的已知序列的 DNA 或 RNA 片段，经放射性同位素或其它方法标记，用来进行杂交。通常使“探针”与特定未知的序列发生杂交形成杂合体，即可达到寻找和鉴定特定序列的目的。研究DNA分子中某一种基因的位置确定两种核酸分子间的序列相似性检测某专一序列在待检样品中存在与否基因芯片技术的基础 核酸杂交的应用限制性内切酶（restriction enzyme）DNA的限制图谱1.DNA与RNA的基本结构。2.核苷酸的生物学功能。3.tRNA、mRNA、rRNA的结构和功能。4.DNA双螺旋结构的特点。5.Tm、Chargaff定律、DNA的变性和复性、分子杂交、增色效应、减色效应。思考题