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1、表面等离子共振技术表面等离子共振技术05医学实验马吟醒 朱倩 薛夏沫 黄辰简介简介l表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance technology，SPR)是20世纪90年代发展起来的，应用SPR原理检测生物传感芯片(biosensor chip)上配位体与分析物作用的一种新技术。发展简史发展简史F1902年，Wood在光学实验中发现SPR现象F1941年，Fano解释了SPR现象F1971年，Kretschmann为SPR传感器结构奠定了基础F1983年，Liedberg将SPR用于IgG与其抗原的反应测定F1987年，Knoll等人开始SPR成像研究F1990
2、年，Biacore AB公司开发出首台商品化SPR仪器SPR用途简介用途简介实时分析，简便快捷地监测DNA与蛋白质之间、蛋白质分子之间以及药物蛋白质、核酸核酸、抗原抗体、受体配体等等生物分子之间的相互作用，在生命科学、医疗检测、药物筛选、食品检测、环境监测、毒品检测、法医鉴定等领域具有广泛的应用需求。表面等离子共振原理表面等离子共振原理l1.消逝波l2.等离子波l3.SPR的光学原理1.消逝波l当光从光密介质入射到光疏介质时（n1n2）就会有全反射现象的产生。n1 sin1=n2 sin2菲涅尔定理：菲涅尔定理：密疏密疏1.消逝波这表示沿X轴方向传播而振幅衰减的一个波，这就是消逝波。全反射的光
3、波会透过光疏介质约为光波波长的一个深度，再沿界面流动约半个波长再返回光密介质。光的总能量没有发生改变。透入光疏介质的光波成为消逝波。界面疏密2.等离子波 等离子体 等离子体通常是指由密度相当高的自由正、负电荷组成的气体，其中正、负带电粒子数目几乎相等。金属表面等离子波 把金属的价电子看成是均匀正电荷背景下运动的电子气体，这实际上也是一种等离子体。由于电磁振荡形成了等离子波。3.SPR光学原理3.SPR光学原理l我们在前面提到光在棱镜与金属膜表面上发生全反射现象时，会形成消逝波进入到光疏介质中，而在介质（假设为金属介质）中又存在一定的等离子波。当两波相遇时可能会发生共振。3.SPR光学原理l当消
4、逝波与表面等离子波发生共振时，检测到的反射光强会大幅度地减弱。能量从光子转移到表面等离子，入射光的大部分能量被表面等离子波吸收，使得反射光的能量急剧减少。3.SPR光学原理l可以从反射光强的响应曲线看到一个最小的尖峰，此时对应的入射光波长为共振波长，对应的入射角为SPR角。SPR角随金表面折射率变化而变化，而折射率的变化又与金表面结合的分子质量成正比。这就是SPR对物质结合检测的基本原理。SPR的响应模式的响应模式n1 sin1=n2 sin2因为因为 sin2=1 所以所以 sin1=n2/n1SPR的检测模式的检测模式直接检测直接检测：适用于大分子（1000 Da）SPR的检测模式的检测模
5、式 抑制模式抑制模式：将待测小分子固定在传感器表面，在样品中加入过量对应大分子。SPRSPR仪的结构及工作原理仪的结构及工作原理朱倩朱倩 90513126BIACORE 3000Biacore ControlBiacore Control工作仪器工作仪器Biacore 3000Biacore 3000工作仪器工作仪器核心部件：核心部件：传感器芯片传感器芯片 液体处理系统液体处理系统 光学系统光学系统其他：其他：LEDLED状态指示器状态指示器 温度控制系统温度控制系统Biacore 3000核心部件Biacore 3000Biacore 3000的光学系统的光学系统Biacore 3000Bi
6、acore 3000传感器基本结构传感器基本结构1.1.光波导耦合器件光波导耦合器件2.2.金属膜金属膜3.3.分子敏感膜分子敏感膜传感芯片传感芯片光波导耦合器件光波导耦合器件Krestschmann棱镜型Otto棱镜型光纤在线传输式光纤终端反射式光栅型金属膜分子敏感膜棱镜型装置工作原理棱镜型装置工作原理(a)Otto 型型 (b)Kretschmann 型型光纤型光波导耦合器光纤型光波导耦合器在线传输式在线传输式SPR 光纤传感器光纤传感器光纤型光波导耦合器光纤型光波导耦合器终端反射式终端反射式SPR 光纤传感器光纤传感器光栅型光波导耦合器光栅型光波导耦合器光源光源lHe2Ne激光器激光器l
7、LEDl白炽灯白炽灯卤钨灯卤钨灯传感芯片传感芯片金属膜金属膜u反射率高反射率高u化学稳定性好化学稳定性好u厚度合适厚度合适金属材料的选择金属材料的选择1、可见光范围内反射率较高：、可见光范围内反射率较高：Ag、Al、Au、Cu 2、化学稳定性好、化学稳定性好Ag、Al、Au、CuAg、AuAgAg膜膜、AuAu膜的比较膜的比较金膜金膜(实线实线)和银膜和银膜(虚线虚线)SPR 光谱理论值光谱理论值恒定波长恒定波长恒定波长恒定波长,反射系数与入射角度关系反射系数与入射角度关系反射系数与入射角度关系反射系数与入射角度关系波长波长波长波长:1:1 和和和和2 2 为为为为750nm,3 750nm,
8、3 为为为为600nm,600nm,4 4 为为为为500nm500nm恒定入射角度恒定入射角度恒定入射角度恒定入射角度,反射系数与波长关系反射系数与波长关系反射系数与波长关系反射系数与波长关系入射角度入射角度入射角度入射角度:1:1 为为为为80,2 80,2 为为为为70,70,3 3 为为为为72,4 72,4 为为为为6815,5 6815,5 为为为为65156515金属膜厚度对金属膜厚度对SPR SPR 谱的影响谱的影响=63218nm介质为水介质为水(n=1.333)棱镜折射率为棱镜折射率为1.51550nm传感芯片传感芯片分子敏感膜分子敏感膜成膜方法：成膜方法：1.金属膜直接吸
9、附法金属膜直接吸附法2.共价连接法（生物素共价连接法（生物素-亲和素、葡聚糖亲和素、葡聚糖凝胶、水凝胶、高分子膜、多肽等）凝胶、水凝胶、高分子膜、多肽等）3.单分子复合膜法单分子复合膜法4.分子印膜技术分子印膜技术Biacore 3000Biacore 3000液体处理系统液体处理系统Biacore 3000Biacore 3000的的LEDLED状态指示器状态指示器LEDLED（light-emitting diodelight-emitting diode）lReady：亮：亮/灭灭lError：亮：亮/灭灭lTemperature：稳定：稳定/闪烁闪烁lSensor Chip：稳定：稳定
10、/闪烁闪烁lRun：亮：亮/灭灭Biacore 3000Biacore 3000的温度控制系统的温度控制系统l SPR 技术的应用黄辰90513125物理学应用化学应用生物学应用物理学应用若某种物理量会引起特定敏感膜折射率的变化，就可以采用SPR 传感技术进行检测。例如，基于温度变化引起特定敏感膜的吸湿量变化，并导致其折射率变化，从而利用SPR 传感技术进行检测的湿度传感系统，以及基于氢化无定型硅的热光效应的温度传感系统等。化学应用待测分子与被敏感膜有选择性地化学吸附或与敏感膜中的特定分子发生化学反应引起敏感膜的光学属性(主要是折射率)的变化表面等离子共振条件的变化通过检测共振角或共振波长的变
11、化来检测待测分子的成分、浓度以及参与化学反应的特性生物学应用生物学检测领域药物领域食品工业及环境监测领域蛋白质组学领域临床诊断领域遗传分析领域生物学应用生物学检测领域生物学应用生物学检测主要用于检测生物分子的结合作用或者通过生物分子结合作用的检测来完成特定生物分子的识别及其浓度的测定生物学应用生物学检测领域药物领域食品工业及环境监测领域药物领域药物与蛋白之间的相互作用药物筛选与新药开发 SPR技术因其实时效性，高通量，特异性及能在天然状态下研究药物分子与靶点的相互作用，为新药研发提供了有力的工具维生素检测生物毒素检测细菌和病原菌检测农、兽药残留量检测食品工业及环境监测领域生物传感器的在线分析能
12、力和高灵敏度，微量样品需求的特点，使得这种仪器成为食品及环境安全监控的理想工具生物学应用生物学检测领域药物领域食品工业及环境监测领域蛋白质组学领域生物学应用蛋白质组学SPR技术因其高效灵敏、无需额外标记高效灵敏、无需额外标记等优势，广泛应用与蛋白质检测和蛋白-蛋白相互作用等蛋白质组学研究，它能在保持蛋白质天然状态的情况下实时提供靶蛋白的细胞器分布，结合动力学及浓度变化等功能信息，为蛋白质组研究开辟了全新模式生物学应用生物学检测领域药物领域食品工业及环境监测领域蛋白质组学领域临床诊断领域生物学应用临床诊断利用生物传感器，可监测和定量测定病人血清中的生物药剂和抗体滴度的可行性，跟踪检测动物模型、人
13、类临床试验SLESLE患者常伴有血栓发生患者常伴有血栓发生它与它与PSPS结合并阻断结合并阻断PSPS的抗凝血作用的抗凝血作用系统性红斑狼疮（系统性红斑狼疮（SLESLE）患者血浆中含）患者血浆中含有有C4bBPC4bBP利用SPR技术在胞外环境中研究控制基技术在胞外环境中研究控制基因转录、细胞周期、细胞分裂和凋亡的因转录、细胞周期、细胞分裂和凋亡的信号传递途径，从而可以准确地设计出信号传递途径，从而可以准确地设计出这些生化作用催化剂的拮抗物，应用于这些生化作用催化剂的拮抗物，应用于癌症的治疗。癌症的治疗。生物学应用生物学检测领域药物领域食品工业及环境监测领域蛋白质组学领域临床诊断领域遗传分析
14、领域生物学应用遗传分析SPR生物传感器用于遗传分析是一个崭新的领域。如用于检测点突变，用于检测区分野生的和经遗传修饰的大豆基因序列等展望未来如今，SPR技术已被广泛地用来分析生物分子蛋白质蛋白质-蛋白质蛋白质药物药物-蛋蛋白质白质蛋白质蛋白质-核酸核酸核酸核酸-核核酸酸结合位点结合位点和反应物和反应物浓度浓度展望未来涉及的研究领域包括免疫识别免疫识别信号传导信号传导药物筛选药物筛选抗体定性抗体定性蛋白质构象变化蛋白质构象变化展望未来SPR技术在分子生物学研究领域中应用的范围非常广，在研究基因工程中：载体与质粒DNA之间的相互作用，以评价载体效率DNA序列特异性抗体的性质鉴定等方面，SPR技术都
15、发挥了重要作用SPR技术与其他分析技术的联合应用，必将加速分子生物学的研究进展，使我们对生命现象的了解更加深入Thanks for your attention!90513101 90513101 马吟醒马吟醒90513126 90513126 朱倩朱倩90513129 90513129 薛夏沫薛夏沫90513125 90513125 黄辰黄辰Mar 19Mar 19thth 2008 2008SPRSPR的特点及发展方向的特点及发展方向AdvantagesDisadvantagesFuture DevelopmentExamplesMain Advantagesn n实时监测实时监测n n无
16、需标记样品无需标记样品n n样品需要极少样品需要极少 n n检测过程方便快捷，灵敏度较高检测过程方便快捷，灵敏度较高n n应用范围广泛应用范围广泛-Other Advantagesn n跟踪监控跟踪监控跟踪监控跟踪监控n n不干扰反应的平衡不干扰反应的平衡不干扰反应的平衡不干扰反应的平衡n n不需要对样品进行处理不需要对样品进行处理不需要对样品进行处理不需要对样品进行处理n n能在混浊的甚至不透明的样品中进行能在混浊的甚至不透明的样品中进行能在混浊的甚至不透明的样品中进行能在混浊的甚至不透明的样品中进行 Disadvantages传感曲线经常不符合假一级动力学传感曲线经常不符合假一级动力学n
17、n多价结合多价结合n n多步结合反应多步结合反应n n空间位阻效应空间位阻效应n n配体或者分析物的不均一配体或者分析物的不均一n n扩散速度限制扩散速度限制n n重结合现象重结合现象Disadvantagesn n检测成本检测成本n n易用性易用性n n稳定性稳定性n n检测效率检测效率改进与发展改进与发展Developmentn n增强稳定性n n提高检测灵敏度n n实现多通道检测n n联用n n装置微型化n n降低成本n n稳定性稳定性生物分子&金属薄膜结合+一层SAM(self-assembles monolayer)自组装单分子层自组装单分子层在金属薄膜层上覆盖羧甲基葡聚糖凝胶覆盖羧
18、甲基葡聚糖凝胶 not only but also微流控多通道微流控多通道SPR检测检测SPR ImagingLayout and photograph of the microfluidic chip designed for coupling with SPR imaging system n n联用联用MALDI-TOFMALDI-TOF质谱法结合质谱法结合“二维二维”SPR可对相互作用进行定量分析 MALDI-TOF提供定性分析的详细结果n nRP-HPLCRP-HPLC高效液相层析技术高效液相层析技术用于SPR技术中研究溶细胞肽与抗微生物肽和细胞膜磷脂的相互作用情况，以了解肽的构想及
19、溶解活性。n n电化学与电化学与SPRSPR联用联用 为固液表面发生的各种电化学现象和过程提为固液表面发生的各种电化学现象和过程提供有价值的信息供有价值的信息 电诱导分子吸附电诱导分子吸附/脱附，脱附，吸附物、电沉积和阳极溶出过程中吸附物、电沉积和阳极溶出过程中 的结构变化。的结构变化。微型化微型化Biacore 2000Dimensions:760 x 350 x 610 mmNet Weight:50 kgSpreeta 2000Spreeta 传感器和SPR分析系统示意图n nBiosensing Instrument(生物传感仪器)公司 BI SPR 1100小结小结n n表面等离子体
20、共振（表面等离子体共振（SPRSPR）技术是瑞典）技术是瑞典PharmaciaPharmacia公司在公司在2020世纪世纪9090年代开发的年代开发的生物传感技术。生物传感技术。n n以其检测过程方便快捷、始终保持生以其检测过程方便快捷、始终保持生物分子的活性、实时检测、应用范围物分子的活性、实时检测、应用范围广、检测灵敏度高等很多优点广泛应广、检测灵敏度高等很多优点广泛应用于生物分子相互作用的研究。用于生物分子相互作用的研究。小结小结n n随着 SPR 技术成为分析生物化学、药物研发和食物监控领域中的一个不可缺少的部分,SPR 生物传感器的应用将更加趋向多样化,特别是它在小分子检测和脂膜领域的新兴应用将使其在未来的药物发现和膜生物学中扮演一个越来越重要的角色。SPR的应用领域将不断扩大技术水平及实用程度也将不断提高