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1、抗菌药物敏感性试验第1页，本讲稿共17页n教学对象：高等医学院校卫生检验专业学生教学对象：高等医学院校卫生检验专业学生n实验课时：实验课时：4 4学时学时n课程类型：专业实验课课程类型：专业实验课n课程要求：必修课程要求：必修n每组人数：每组人数：2 2人人第2页，本讲稿共17页实验目的和要求实验目的和要求n掌握纸片扩散法（KB法）的原理、操作方法等、结果判断、意义及质量控制；n熟悉肉汤稀释法抗生素敏感性试验的原理、操作方法、结果判断及意义等；n了解稀释法的质量控制。第3页，本讲稿共17页实验内容实验内容n常用抗菌药物敏感性试验与耐药检测方法介绍。n纸片扩散法。n肉汤稀释法。第4页，本讲稿共1
2、7页一、常用抗菌药物敏感性试验与耐药检测一、常用抗菌药物敏感性试验与耐药检测方法介绍方法介绍n纸片扩散法（Kirby-Bauer test）n稀释法（dilution test）nE试验法（E test）n联合药物敏感试验 n特殊耐药菌及耐药酶的表型检测n耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的检测n-内酰胺酶、超广谱-内酰胺酶检测等第5页，本讲稿共17页二、纸片扩散法（二、纸片扩散法（K-B法法）n原理：n含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。n抑
3、菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑制浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。第6页，本讲稿共17页抑菌圈抑菌圈 含药纸片含药纸片 第7页，本讲稿共17页n方法：n菌液制备：挑取孵育16-24h的血平板上数个菌落置于生理盐水管中，校正浓度至0.5麦氏标准；n涂布接种：无菌棉拭蘸取菌液，在试管壁旋转挤去多余菌液后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60，最后沿平板内缘涂抹1周；n贴含药纸片：平板在室温下干燥3-5min，用无菌镊子将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心相距应大于24mm
4、，纸片距平板内缘应大于15mm；n孵育：35C 16-18h，量取抑菌圈直径。第8页，本讲稿共17页n结果判读：n用刻度尺量取抑菌圈直径，根据CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）标准判读结果；n报告：细菌对该抗生素是 敏感（susceptible，S）；耐药（resistant，R）；还是中介（intermediate，I）。第9页，本讲稿共17页第10页，本讲稿共17页表表1金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验评价结果金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验评价结果抗菌药物抗菌药物纸片含药量纸片含药量 抑菌圈直径抑菌圈直径(mm)(mm)相应
5、相应MICMIC值值(g/ml)(g/ml)耐药耐药中介中介敏感敏感耐药耐药敏感敏感青霉素青霉素10U10U28282929-内酰胺酶内酰胺酶0.120.12苯唑西林苯唑西林1g1g1010111112121313 4 422万古霉素万古霉素30g30g1515 44庆大霉素庆大霉素10g10g1212131314141515 8 844红霉素红霉素15g15g1313141422222323 8 80.50.5克林霉素克林霉素2g2g1414151520202121 4 40.50.5磺胺药磺胺药1.25/23.75g1.25/23.75g10101111151516168/152 8/15
6、2 2/382/38第11页，本讲稿共17页三、肉汤稀释法三、肉汤稀释法 n原理：n以水解酪蛋白（MH）液体培养基将抗生素做不同浓度的稀释，然后种入待检细菌，定量测定抗菌药物对被测菌的最低抑菌浓度（MIC）或最低杀菌浓度（MBC）。第12页，本讲稿共17页n方法：n试管编号：取26只试管排成两排（测试菌排，质控菌排）每排13支编号。另取3支试管，分别标记上“肉汤对照”、“测试菌生长对照”和“质控菌生长对照”等对照。n抗菌药物稀释：用MH肉汤倍比稀释抗菌药物至13管，稀释后使每管含抗菌药物稀释液2ml。n肉汤对照、测试菌生长对照、质控菌生长对照管：分别加入MH肉汤2ml。第13页，本讲稿共17页
7、n方法：n菌液制备：生理盐水校正测试菌和质控菌至0.5麦氏比浊标准，再用MH肉汤稀释到107CFU/ml；n加菌液：用微量加样器取0.1ml稀释菌液由低到高加于各排试管中，其最终的接种量为5105 CFU/ml。测试菌排、测试菌生长对照管加测试菌液；质控菌排、质控菌生长对照管加质控菌液。n孵育：35C 24h观察结果。第14页，本讲稿共17页n结果：n测试菌（或质控菌）不出现肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对测试菌（质控菌）的MIC。第15页，本讲稿共17页第16页，本讲稿共17页n注意事项：n培养基、接种细菌的菌量、抗菌药物纸片的质量、孵育温度和观察时间、操作是否规范等均能影响本试验的结果。n为保证结果的可靠性，需同时采用相应标准菌株同时进行药敏试验作为质量控制的方式。第17页，本讲稿共17页