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1、关于抗菌药物敏感性试验(药敏试验)第一页，本课件共有118页目的目的指指导临床医生床医生针对各各类临床感染患者床感染患者选择最佳抗菌最佳抗菌药物物一定区域内一定区域内积累累对公共公共卫生有关的重要耐生有关的重要耐药的微生物流行病学的微生物流行病学资料料根据根据细菌菌对药物敏感物敏感谱进行菌种行菌种鉴定定第二页，本课件共有118页药敏试验原理药敏试验原理把把含含有有定定量量抗抗菌菌药药物物的的纸纸片片贴贴在在已已接接种种测测试试细细菌的琼脂平板上菌的琼脂平板上纸纸片片中中药药物物吸吸收收琼琼脂脂水水分分溶溶解解后后通通过过弥弥散散作用形成递减的浓度梯度作用形成递减的浓度梯度纸片扩散法纸片扩散法第
2、三页，本课件共有118页纸纸片片周周围围一一定定距距离离范范围围内内试试验验菌菌生生长长受受抑抑制制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌环。从而形成无菌生长的透明圈即抑菌环。抑抑菌菌环环大大小小反反映映测测试试菌菌对对测测定定药药物物的的敏敏感感程程度度抑抑菌菌环环大大小小除除与与细细菌菌的的敏敏感感性性有有关关外外还还与与其其它诸因素相关。它诸因素相关。第四页，本课件共有118页定量测定抗菌药物活性定量测定抗菌药物活性抗抗菌菌药药物物与与肉肉汤汤或或琼琼脂脂培培养养基基混混合合稀稀释释后后种种入试验细菌，孵育过夜。入试验细菌，孵育过夜。以以能能抑抑制制细细菌菌生生长长的的最最低低浓浓度度为为最最
3、低低抑抑菌菌浓度（浓度（MICMIC）将将MICMIC与与机机体体血血清清或或体体液液中中可可获获得得药药物物浓浓度度相比较来确定恰当的临床疗效相比较来确定恰当的临床疗效稀释法稀释法 第五页，本课件共有118页MICMIC的对数与抑菌环直径关系的对数与抑菌环直径关系近似线性负相关近似线性负相关第六页，本课件共有118页CLSICLSI药物选择原则药物选择原则A A组组 常规和首选药物，其结果应常规报告常规和首选药物，其结果应常规报告B B组组 首首选选试试验验选选择择性性报报告告。包包含含一一些些临临床床上上重要的、特别针对医院感染的药物重要的、特别针对医院感染的药物C C组组 替代性和补充性
4、药物替代性和补充性药物U U组组 补补充充性性试试验验，仅仅用用于于治治疗疗泌泌尿尿道道感感染染的抗菌药物。的抗菌药物。第七页，本课件共有118页表表中中小小框框内内是是一一组类似似药物物，其其结果果解解释和和临床效力相似，不必个个床效力相似，不必个个试验。“或或”字字表表示示一一群群相相关关药物物，其其抗抗菌菌谱和和解解释结果果几几乎乎完完全全相相同同，交交叉叉耐耐药性性和和交交叉叉敏敏感感性性也也完完全全相相同同，通通常常只只选择一一种种药进行行试验。药物选择第八页，本课件共有118页 菌种代表药物苯唑西林苯唑西林葡萄球菌属葡萄球菌属所有所有-内酰胺类包括酶抑制内酰胺类包括酶抑制剂复合药和
5、碳青霉烯类剂复合药和碳青霉烯类四环素四环素除葡萄球菌和除葡萄球菌和不动杆菌以外不动杆菌以外的所有菌属的所有菌属多西环素、米诺环素、金霉多西环素、米诺环素、金霉素、地美环素、土霉素、美素、地美环素、土霉素、美他环素他环素红霉素红霉素革兰阳性球菌革兰阳性球菌罗红霉素、克拉霉素、阿齐罗红霉素、克拉霉素、阿齐霉素、地红霉素霉素、地红霉素药敏试验中常用试验药及其代表的药物药敏试验中常用试验药及其代表的药物所有菌属所有菌属所有菌属所有菌属试验药物林可霉素林可霉素克林霉素克林霉素第九页，本课件共有118页青霉素青霉素G葡萄球菌属葡萄球菌属淋病奈瑟菌淋病奈瑟菌苯氧甲基青霉素、苯氧乙苯氧甲基青霉素、苯氧乙基青霉
6、素、氨苄西林、阿基青霉素、氨苄西林、阿莫西林、巴氨莫西林、巴氨 西林、氨西林、氨环己西林、海他西林、环己西林、海他西林、羧苄西林、美洛西林、阿羧苄西林、美洛西林、阿洛西林、替卡西林、哌拉洛西林、替卡西林、哌拉西林西林头孢噻吩头孢噻吩肠杆菌科肠杆菌科 头孢匹林、头孢拉啶、头头孢匹林、头孢拉啶、头孢氨苄、头孢氨苄、头 孢克罗、头孢克罗、头孢羟氨苄孢羟氨苄氨苄西林氨苄西林所有菌属所有菌属阿莫西林、巴氨西林、氨阿莫西林、巴氨西林、氨环己西林、海他西林环己西林、海他西林第十页，本课件共有118页磺胺异恶唑磺胺异恶唑所有菌属所有菌属所有磺胺类所有磺胺类萘啶酸（敏感）萘啶酸（敏感）肠杆菌科肠杆菌科所有喹诺酮
7、类敏感所有喹诺酮类敏感头孢噻吩头孢噻吩/头孢唑头孢唑啉（敏感）啉（敏感）肠杆菌科肠杆菌科所有头孢菌素敏感所有头孢菌素敏感万古霉素万古霉素革兰阳性杆菌革兰阳性杆菌替考拉宁替考拉宁氨苄西林氨苄西林肠球菌属肠球菌属青霉素青霉素第十一页，本课件共有118页B B组药物组药物细菌菌对A A组同同类药物耐物耐药，可，可选择性性报告告报告指征告指征特定的特定的标本来源本来源多种多种细菌感染菌感染多部位感染多部位感染对A A组药过敏、耐受或无效敏、耐受或无效以流行病学以流行病学调查为目的向感染控制部目的向感染控制部门报告告第十二页，本课件共有118页C C组药物组药物某某些些医医院院潜潜在在局局部部或或广广泛
8、泛流流行行的的耐耐药菌菌株株对数数种种手手选药物物（特特别是是同同类的的如如-内内酰胺胺类或或氨基糖氨基糖甙类）耐）耐药治治疗对基本基本药物物过敏的患者敏的患者治治疗少少见菌的感染菌的感染流行病学流行病学调查为目的向感染控制部目的向感染控制部门报告告第十三页，本课件共有118页试验方法试验方法纸片扩散法纸片扩散法改良改良Kirby-BauerKirby-Bauer法法(K-B(K-B法法)第十四页，本课件共有118页培养基培养基培养基培养基 非苛氧菌用非苛氧菌用非苛氧菌用非苛氧菌用Mueller-HintonMueller-Hinton（M-HM-H）琼琼脂脂脂脂药物物纸片片 直径直径6mm6
9、mm纸纸片，每片吸水量片，每片吸水量片，每片吸水量片，每片吸水量约约20202020l l菌菌液液比比浊管管 0.50.5号号麦麦氏氏（McFarlandMcFarlandMcFarlandMcFarland）标准准比比浊管管，菌菌液液浓度度为1.51.510108 8/ml/ml质质控菌株控菌株控菌株控菌株 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 ATCC ATCC ATCC ATCC 25923259232592325923大大大大肠肠埃希菌埃希菌埃希菌埃希菌 ATCC ATCC ATCC ATCC 25922259222592225922铜绿铜绿假假假假单单胞菌胞菌胞菌
10、胞菌 ATCC ATCC ATCC ATCC 27853278532785327853试验材料第十五页，本课件共有118页操作方法操作方法第十六页，本课件共有118页菌液制备菌液制备 挑取已纯化的挑取已纯化的挑取已纯化的挑取已纯化的4 4 4 4 5 5 5 5个菌落制备菌悬液个菌落制备菌悬液个菌落制备菌悬液个菌落制备菌悬液 挑挑选琼脂平板上脂平板上3535个形个形态特征一致的特征一致的菌落，用接种菌落，用接种环接触每个菌落接触每个菌落顶部部 转移至移至45mL 45mL 适宜的液体培养基中（如适宜的液体培养基中（如胰胰酶消化大豆消化大豆胨肉肉汤）生长法生长法 第十七页，本课件共有118页置置
11、3535孵育孵育2-6 h 2-6 h 用用无无菌菌生生理理盐水水或或肉肉汤校校正正，使使其其浊度度至至0.50.5号麦氏管号麦氏管第十八页，本课件共有118页从孵育从孵育16-24h 16-24h 的非的非选择性性琼脂培养基脂培养基上用接种上用接种环挑取挑取单个新个新鲜菌落，菌落，悬浮浮于生理于生理盐水或肉水或肉汤中震中震荡混匀混匀与与标准比准比浊管比管比浊，以有黑字的白，以有黑字的白纸为背背景景调整其整其浊度相当于度相当于0.50.5号麦氏管。号麦氏管。直接调制菌悬液法直接调制菌悬液法生长法的简便替代法生长法的简便替代法生长法的简便替代法生长法的简便替代法第十九页，本课件共有118页第二十
12、页，本课件共有118页用无菌棉拭子蘸取菌液用无菌棉拭子蘸取菌液在管壁上方旋在管壁上方旋转挤压几次去掉几次去掉过多水分多水分用拭子涂布整个用拭子涂布整个M-H培养基表面，反复几培养基表面，反复几次，每次将平板旋次，每次将平板旋转60最后沿平皿周最后沿平皿周边绕两圈以保两圈以保证涂布均匀涂布均匀平板接种平板接种第二十一页，本课件共有118页制制备好的菌液必好的菌液必须在在15min内使用内使用贴纸片片前前可可将将培培养养皿皿盖盖半半开开3-5min以以使使表表面面过多水分被吸收但不超多水分被吸收但不超过15min第二十二页，本课件共有118页将接种好的平板敞开盖子倒置在室温下干燥将接种好的平板敞开
13、盖子倒置在室温下干燥3-5min 使平板上的水分被使平板上的水分被琼脂完全吸收。脂完全吸收。用用镊子取子取纸片一片一张贴在在琼脂平板表面，脂平板表面，轻压使其与使其与琼脂完全接触。脂完全接触。纸片中心片中心间距距 24mm,纸片中心距平皿片中心距平皿边缘 15mm。直径。直径90mm的平板最好的平板最好贴6张。加贴纸片加贴纸片第二十三页，本课件共有118页15min内将平板倒置放温箱孵育。内将平板倒置放温箱孵育。纸片片一一旦旦贴下下就就不不可可再再挪挪动位位置置，因因纸片片中的中的药物已物已扩散到散到琼脂中。脂中。需要需要时应在适当的地方在适当的地方贴新新纸片片注意第二十四页，本课件共有118
14、页 必必须用用35孵孵箱箱（苛苛氧氧菌菌药敏敏平平板板应置置于于5%CO2 环境）境）箱箱内内平平板板最最好好单独独摆放放，不不超超过两两个个叠叠在在一一起起，否否则中中间的的平平板板因因达达不不到到孵孵箱箱温温度度而而产生生预扩散的作用。散的作用。孵育孵育 第二十五页，本课件共有118页平平板板孵孵育育规定定时间（一一般般为18-24h）后后读取取结果果，葡葡萄萄球球菌菌和和肠球球菌菌必必须孵孵育育24h以以检测苯苯唑西林和万古霉素的耐西林和万古霉素的耐药性。性。第二十六页，本课件共有118页孵育孵育16-18h 后后检查每一每一块平板平板如如果果划划线满意意，接接种种物物准准确确无无误，抑
15、抑菌菌圈圈应为正正圆形，菌落形，菌落应融合生融合生长出出现明明显单个菌落表示接种量太少个菌落表示接种量太少重复重复试验第二十七页，本课件共有118页可用直尺或游可用直尺或游标卡尺，卡尺，读取最接近的整毫米数取最接近的整毫米数测量量时应将将尺尺子子置置于于倒倒置置的的平平板板上上，置置平平板板在在黑黑色色无无反反射射光光背背景景上上方方几几厘厘米米处并并用用反反射光照明。射光照明。含含血血的的药敏敏琼脂脂 应移移去去平平板板盖盖后后用用反反射射光光照明平板，于表面上方照明平板，于表面上方测量抑菌量抑菌环。抑菌环直径测量抑菌环直径测量第二十八页，本课件共有118页测量量抑抑菌菌环直直径径时 抑抑菌
16、菌环边缘以以见不不到到细菌菌明明显生生长为限限，测量量的的是是完完全全抑抑制制的的区区域域直直径（包括径（包括纸片直径）片直径）按按抑抑菌菌环直直径径判判断断细菌菌的的敏敏感感性性，应依依据据CLSI的的解解释标准准，报告告细菌菌对测试药物物敏敏感感、中介、耐中介、耐药。第二十九页，本课件共有118页在清楚抑菌在清楚抑菌环内有独立的菌落生内有独立的菌落生长提示提示接接种种的的菌菌落落不不纯，需需要要重重新新分分离离、鉴定定和和药敏敏试验抗菌抗菌药物物选择出的高出的高频突突变耐耐药株株结果判断结果判断第三十页，本课件共有118页变形形杆杆菌菌属属的的菌菌株株可可扩散散到到某某些些抗抗菌菌药物物的
17、的抑抑菌菌环内内，故故在在明明显抑抑菌菌环内内有有薄薄膜膜状状爬爬行行生生长可以忽略。可以忽略。链球菌球菌应检测其生其生长抑制圈而非溶血抑制圈。抑制圈而非溶血抑制圈。第三十一页，本课件共有118页对于于甲甲氧氧苄啶和和磺磺胺胺，拮拮抗抗物物使使细菌菌轻微微生生长故抑菌圈直径故抑菌圈直径应忽略忽略细微生微生长的菌落。的菌落。来来自自血血琼脂脂菌菌落落可可能能带有有足足够的的甲甲氧氧苄啶或或磺磺胺胺拮拮抗抗物物，在在SXT抑抑菌菌圈圈内内细菌菌可可沿沿敏敏感感菌菌株周株周围产生模糊生生模糊生长。第三十二页，本课件共有118页检测苯苯唑西西林林和和万万古古霉霉素素对葡葡萄萄球球菌菌和和肠球球菌菌的的
18、抑抑菌菌环需需要要用用透透射射光光（平平板板对着着光光源源），抑抑菌菌环的的边缘用放大用放大镜才可才可发现小菌落可以忽略。小菌落可以忽略。在在纸片片周周围的的抑抑菌菌环内内有有任任何何可可辨辨的的菌菌落落或或生生长薄膜（包括薄膜（包括针尖尖样菌落）提示耐菌落）提示耐药。第三十三页，本课件共有118页报告方式报告方式敏感敏感 菌菌株株能能被被使使用用推推荐荐剂量量在在感感染染部部位位达达到到的抗菌的抗菌药物物浓度所抑制度所抑制常规报告常规报告第三十四页，本课件共有118页中介中介被被测菌菌株株对该药物物的的MIC接接近近于于血血液液、组织中中通通常常可可达达到到的的浓度度而而治治疗反反应率率可可
19、能能低低于于敏敏感感株株。意意味味着着可可通通过提提高高剂量量或或在在药物物被被生理生理浓集的部位集的部位发挥临床效力。床效力。第三十五页，本课件共有118页被被测菌菌不不能能被被该抗抗菌菌药物物的的常常用用剂量量在在组织或血液内达到的或血液内达到的浓度所抑制度所抑制其其MICMIC落落在在某某些些范范围内内提提示示该菌菌可可能能存存在在特特定定的的耐耐药机机制制（如如-内内酰胺胺酶）而而且且治治疗研研究表明其究表明其临床床疗效不可靠。效不可靠。耐药耐药 第三十六页，本课件共有118页当当药物物对菌菌株株的的MICMIC高高于于或或抑抑菌菌圈圈直直径径低低于于敏敏感折感折点点时报告告为非敏感。
20、非敏感。非敏感并不意味着菌株携非敏感并不意味着菌株携带某种耐某种耐药机制。机制。由由于于耐耐药菌菌株株缺缺失失或或稀稀少少因因而而仅确确立立了了敏敏感感性性解解释标准。准。对于于“不不敏敏感感”菌菌株株，鉴定定和和药敏敏结果果需需再再次确次确认。不敏感（不敏感（NSNS）M100-S20定定义第三十七页，本课件共有118页解解释性性报告告 某某些些菌菌种种或或菌菌群群对抗抗菌菌药物物的的选择和和报告告有有特特殊要求殊要求大大肠埃埃希希菌菌和和克克雷雷伯伯菌菌属属中中产ESBLsESBLs菌菌株株应报告告对所有青霉素所有青霉素类、头孢菌素菌素类及氨曲南耐及氨曲南耐药。第三十八页，本课件共有118
21、页对沙沙门菌属和志菌属和志贺菌属的分离株菌属的分离株只只有有氨氨苄西西林林、一一种种喹诺酮类药物物和和磺磺胺胺异异恶唑/甲氧甲氧甲氧甲氧苄啶苄啶可用于常可用于常可用于常可用于常规试验规试验和和和和报报告告告告第第一一、二二代代头孢菌菌素素和和氨氨基基糖糖甙类药物物体体外外可可能有活性但能有活性但临床无效故不床无效故不应报告敏感告敏感第三十九页，本课件共有118页沙沙门菌菌属属的的肠道道外外分分离离株株应测试并并报告告氯霉素和一种三代霉素和一种三代头孢菌素的敏感性菌素的敏感性肠球球菌菌对头孢菌菌素素类、氨氨基基糖糖甙类、磺磺胺胺甲甲恶唑/甲甲氧氧苄啶和和克克林林霉霉素素在在体体外外可可能能有有活
22、活性但性但临床耐床耐药，不能，不能报告敏感。告敏感。第四十页，本课件共有118页MRS应报告告耐耐受受所所有有-内内酰胺胺类药物物（包包括其复合括其复合药）从从威威胁生生命命的的感感染染（脑膜膜炎炎、菌菌血血症症、会会厌炎炎和和面面部部蜂蜂窝组织炎炎）患患者者的的血血和和脑脊脊液液中中分分离离的的流流感感嗜嗜血血杆杆菌菌常常规应报告告氨氨苄西西林林、一种三代一种三代头孢菌素和菌素和氯霉素的霉素的药敏敏结果果。第四十一页，本课件共有118页“警警 告告”下列抗生素下列抗生素下列抗生素下列抗生素/微生物组合，在体外可出现活性微生物组合，在体外可出现活性微生物组合，在体外可出现活性微生物组合，在体外
23、可出现活性但在临床上无效但在临床上无效但在临床上无效但在临床上无效 ，不应报告敏感，不应报告敏感，不应报告敏感，不应报告敏感细菌细菌不作为敏感报告的抗微生物药不作为敏感报告的抗微生物药产产产产ESBLESBLESBLESBL肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌大肠埃希菌和奇异变形杆菌大肠埃希菌和奇异变形杆菌大肠埃希菌和奇异变形杆菌青霉素类、头孢菌素类青霉素类、头孢菌素类青霉素类、头孢菌素类青霉素类、头孢菌素类 和氨曲南和氨曲南和氨曲南和氨曲南沙门菌属、志贺菌属沙门菌属、志贺菌属沙门菌属、志贺菌属
24、沙门菌属、志贺菌属、代头孢菌素、头霉素和氨基糖代头孢菌素、头霉素和氨基糖代头孢菌素、头霉素和氨基糖代头孢菌素、头霉素和氨基糖苷类苷类苷类苷类苯唑西林耐药葡萄球菌属苯唑西林耐药葡萄球菌属苯唑西林耐药葡萄球菌属苯唑西林耐药葡萄球菌属所有青霉素类，头孢菌素类、所有青霉素类，头孢菌素类、所有青霉素类，头孢菌素类、所有青霉素类，头孢菌素类、-内内内内酰胺酰胺酰胺酰胺/-/-/-/-内酰胺抑制剂、碳青霉烯内酰胺抑制剂、碳青霉烯内酰胺抑制剂、碳青霉烯内酰胺抑制剂、碳青霉烯类类类类肠球菌属肠球菌属肠球菌属肠球菌属氨基糖苷类氨基糖苷类氨基糖苷类氨基糖苷类(除外高浓度除外高浓度除外高浓度除外高浓度)、头孢菌素、头
25、孢菌素、头孢菌素、头孢菌素类、克林霉素和甲氧苄啶类、克林霉素和甲氧苄啶类、克林霉素和甲氧苄啶类、克林霉素和甲氧苄啶/磺胺甲噁磺胺甲噁磺胺甲噁磺胺甲噁唑唑唑唑第四十二页，本课件共有118页苛养菌药敏试验苛养菌药敏试验第四十三页，本课件共有118页培养基培养基为HTM（嗜血杆菌（嗜血杆菌试验培养基）培养基）常常规试验并不推荐用并不推荐用M-H巧克力巧克力琼脂脂过高高的的接接种种浓度度对某某些些-内内酰胺胺类抗抗生生素素可可造造成假耐成假耐药的的结果果相当于相当于0.5号麦氏管含菌号麦氏管含菌14108CFU/mL嗜血杆菌嗜血杆菌第四十四页，本课件共有118页HTMHTM氯化血化血红素母液素母液氯
26、化化 血血 红 素素 50mg50mg溶溶于于100ml 100ml 0.01mmol/L0.01mmol/L的的NaOHNaOH，加，加热搅拌至完全溶解。拌至完全溶解。NADNAD母液母液NAD50mgNAD50mg溶解于溶解于10ml10ml蒸蒸馏水，水，过滤除菌。除菌。第四十五页，本课件共有118页HTMHTM30ml30ml氯化化血血红素素母母液液加加至至1L1L含含5g5g酵酵母母粉粉的的M-HM-H琼脂中脂中高高压灭菌菌冷却后用无菌手冷却后用无菌手续加入加入3ml3ml的的NADNAD母液母液第四十六页，本课件共有118页淋病奈瑟菌淋病奈瑟菌培养基培养基 GCGC琼脂脂+1%+1%
27、的特定生的特定生长添加添加剂不推荐用高不推荐用高营养的巧克力养的巧克力琼脂作脂作药敏敏若若1010g g青青霉霉素素纸片片抑抑菌菌圈圈19mm 19mm，表表示示产生生-内内酰胺胺酶。-内内酰胺胺酶试验更更为迅迅速速，为确确认质粒粒介介导耐耐药性的好方法。性的好方法。第四十七页，本课件共有118页培养基培养基 含含5%5%脱脱纤维羊血的羊血的M-HM-H琼脂脂肺肺炎炎链球球菌菌用用苯苯唑西西林林测定定对青青霉霉素素的的敏敏感感性性，抑抑菌菌环直直径径19mm19mm应测其其MICMIC而而不不是是直直接接报告告对青霉素中介或耐青霉素中介或耐药肺炎链球菌和其他链球菌肺炎链球菌和其他链球菌第四十八
28、页，本课件共有118页肺肺链以外的以外的链球菌不推荐用苯球菌不推荐用苯唑西林西林试验对于于草草链，青青霉霉素素（或或苯苯唑西西林林）纸片片扩散散试验是是不不可可靠靠的的，无无菌菌部部位位分分离离的的草草链应测其其青青霉素的霉素的MICMIC。第四十九页，本课件共有118页适用于适用于肠杆菌科杆菌科细菌等快速生菌等快速生长的致病菌的致病菌无无论哪哪种种接接种种方方式式，只只要要质控控菌菌种种的的抑抑菌菌环在在预期范期范围内，均可按同一解内，均可按同一解释标准准报告告药敏敏结果果为WHOWHO推荐推荐药敏方法敏方法专性性厌氧氧菌菌及及酵酵母母样菌菌等等某某些些特特殊殊菌菌种种药敏敏试验不能用不能用
29、纸片法特点纸片法特点第五十页，本课件共有118页技技术简单，试剂量量低低，不不需需要要特特殊殊设备，可可自自由由选择抗抗菌菌药物物，可可重重复复，易易于于由由人判断，故必人判断，故必须标准化。准化。纸片法片法药敏敏试验必必须标准化准化第五十一页，本课件共有118页影响因素第五十二页，本课件共有118页M-H M-H 培养基培养基批批间重复性重复性较好好含有磺胺、甲氧含有磺胺、甲氧苄啶和四和四环素的抑制物很少素的抑制物很少绝大多数非苛养菌生大多数非苛养菌生长良好良好已已积累大量的数据和累大量的数据和经验第五十三页，本课件共有118页按商用脱水培养基按商用脱水培养基说明制明制备高高压灭菌后水浴冷却
30、至菌后水浴冷却至45-50水水平平台台面面上上倾注注平平皿皿，厚厚度度均均匀匀一一致致约4mm4mm，150mm平平 皿皿 倒倒 60-70mL，100mm平皿倒平皿倒 25-30mL培养基配制培养基配制第五十四页，本课件共有118页冷冷却却至至室室温温，若若当当天天不不使使用用应贮存存于于 2-8冰箱冰箱制制备后后7天内使用完天内使用完毕每每批批平平板板均均应进行行抽抽样进行行无无菌菌试验，30-35孵育孵育24h或更或更长时间。第五十五页，本课件共有118页检查每每批批 M-H琼脂脂的的pH，胶胶化化后后室室温温下下为7.2-7.4过低低、过高高会会使使某某些些药物物失失去去效效力力（如如
31、氨氨基基糖糖甙类和和大大环内内酯类）或或活活性性可可能能增增强（如如青青霉霉素素类）。pH第五十六页，本课件共有118页若若使使用用前前琼脂脂表表面面过分分潮潮湿湿，应放放35孵孵箱箱或或在在室室温温下下敞敞开开盖盖子子倒倒置置，直直至至多多余余水分蒸水分蒸发。琼脂表面脂表面应保持湿保持湿润在在接接种种后后琼脂脂表表面面或或平平板板的的盖盖子子表表面面不不应有可有可见的潮湿水珠的潮湿水珠湿度湿度第五十七页，本课件共有118页过量量胸胸腺腺嘧啶核核苷苷或或胸胸腺腺嘧啶可可逆逆转磺磺胺胺类和和甲甲氧氧苄啶的的抑抑菌菌效效应而而使使抑抑菌菌环变小小、模模糊糊甚甚至至消消失失而而导致致假假耐耐药的的报
32、告告，应使使用用胸腺胸腺嘧啶核苷含量尽可能低的核苷含量尽可能低的M-H琼脂。脂。评价价新新的的M-H琼脂脂可可用用甲甲氧氧苄啶/SMZ纸片片对粪肠球球菌菌ATCC29212或或粪肠球球菌菌ATCC33186进行行试验胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶影响胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶影响第五十八页，本课件共有118页不合格培养基不合格培养基没有抑菌圈没有抑菌圈抑菌圈内有菌生抑菌圈内有菌生长抑菌抑菌环直径直径20mm20mm合格培养基合格培养基培养基上出培养基上出现边缘清楚的抑菌清楚的抑菌环直径直径为20mm20mm或更大或更大第五十九页，本课件共有118页主要指主要指镁和和钙影影响响氨氨基基糖糖甙类、多多粘粘菌菌
33、素素和和四四环素素对假假单胞菌的胞菌的试验结果果含量含量过高高抑菌圈抑菌圈变小小含量含量过低低抑菌圈抑菌圈变大甚至不可接受大甚至不可接受锌离子主要影响离子主要影响细菌菌对碳青霉碳青霉烯的敏感性的敏感性二价阳离子含量的影响二价阳离子含量的影响第六十页，本课件共有118页培养条件培养条件非苛氧菌解非苛氧菌解释标准的基准的基础是在空气中孵育。是在空气中孵育。某某些些药物物（氨氨基基糖糖甙类、大大环内内酯类和和四四环素素）受受CO2 影影响响抑抑菌菌环直直径径会会有有较大大改改变，非非苛氧菌不能在苛氧菌不能在CO2 浓度度较高的高的环境中孵育。境中孵育。苛氧菌苛氧菌应在在CO2 环境孵育中境孵育中第六
34、十一页，本课件共有118页纸片的贮存纸片的贮存装装有有纸片片的的容容器器应置置于于非非无无霜霜冰冰箱箱中中，8冷藏或冷藏或-14冷冷冻至使用前至使用前某某些些不不稳定定药物物（如如亚胺胺培培南南、头孢克克洛洛、克克拉拉维酸酸复复合合药等等）也也应冷冷冻保保存存直直至至使使用当天，以尽量保持其用当天，以尽量保持其稳定性。定性。第六十二页，本课件共有118页装装有有纸片片的的密密封封容容器器应于于使使用用前前1-2h移移出出冰冰箱箱，平平衡衡至至室室温温后后才才能能打打开开以以防防热空空气气接接触触冷冷纸片片时产生冷凝水。生冷凝水。装装有有纸片片的的塑塑胶胶管管从从密密封封包包装装中中取取出出后后
35、应置置于于密密封封的干燥容器中的干燥容器中-内内酰胺胺类药物物纸片片应密密封封包包装装并并冷冷冻，少少量量正在使用的正在使用的纸片可冷藏至少一周片可冷藏至少一周第六十三页，本课件共有118页使使用用纸片片分分配配器器应上上紧盖盖子子并并配配备足足量量干干燥燥剂，分分配配器器打打开开前前应平平衡衡至至室室温温；指指示示剂变色色时应更更换干燥干燥剂以防以防过于潮湿。于潮湿。装有装有纸片的分配器不用片的分配器不用时应冷藏冷藏过期期纸片不得使用，片不得使用，应废弃弃。第六十四页，本课件共有118页接种物的浊度接种物的浊度使使用用BaSO4浊度度标准准管管或或其其光光学学等等同同物物（如如乳胶乳胶颗粒粒
36、悬液）液）相当于相当于0.5号麦氏号麦氏标准管准管(配制方法配制方法见后）后）第六十五页，本课件共有118页使使用用前前将将浊度度标准准管管取取出出置置于于旋旋转混混匀匀器器上上剧烈振烈振动，目，目测其外其外观浊度度应均匀一致均匀一致出出现大大颗粒粒浊度管度管应更更换每月每月应更更换硫酸硫酸钡浊度管或核度管或核实其其浊度度第六十六页，本课件共有118页0.048mol/L的的BaCL2 0.5mL（1.175%w/v BaCl2 H2O）加加入入到到99.5mL 0.18mol/L的的H2SO4（1%v/v），并并不不断断搅动以以维持持混混悬状状态。0.5号麦氏标准管配制第六十七页，本课件共有
37、118页按按每每管管4-6mL分分装装于于带螺螺帽帽的的试管管，其其口口径径应与稀与稀释菌所用一致。菌所用一致。密封并密封并贮存于室温黑暗存于室温黑暗处可可使使用用分分光光光光度度计核核实浊度度标准准管管的的浊度度，光光径径1cm，625nm吸吸光光度度值0.08-0.10者者即即为0.5号麦氏号麦氏标准管。准管。第六十八页，本课件共有118页注意事项注意事项对每每种种可可能能致致病病的的细菌菌进行行药敏敏试验时，使使用用的的单个菌落个菌落应选自原始自原始琼脂平板脂平板多多种种不不同同型型细菌菌的的混混合合物物不不能能在在同同一一药敏敏试验平皿上平皿上进行行试验直直接接用用临床床标本本药敏敏试
38、验须经分分纯菌菌种种药敏敏试验复核复核第六十九页，本课件共有118页接种物接种物浓度避免度避免过浓或或过稀稀禁禁止止用用未未稀稀释的的过夜夜肉肉汤或或其其他他非非标准准接接种种物物进行平板划行平板划线必必须应用用标准准化化操操作作方方法法并并测量量抑抑菌菌环直直径径，绝对不不允允许只只凭凭环的的有有无无而而不不考考虑环的的大小判断大小判断结果。果。第七十页，本课件共有118页试验方法试验方法稀释法稀释法第七十一页，本课件共有118页琼脂稀脂稀释法法重复性好重复性好同同时测定多种定多种细菌菌可可观察被察被检菌落生菌落生长情况、情况、发现污染菌染菌可可应用机械化手段、提高效率用机械化手段、提高效率
39、第七十二页，本课件共有118页微量肉微量肉汤稀稀释法法一一块板可以同板可以同时测定多种抗菌定多种抗菌药物物操作操作规范、范、简便、便、结果可信果可信药物不一定适合物不一定适合实际工作需要工作需要第七十三页，本课件共有118页试验方法试验方法E test第七十四页，本课件共有118页是是一一种种抗抗菌菌药物物浓度度梯梯度度法法直直接接测量量MICMIC的的药敏敏试验结合合了了稀稀释法法和和扩散散法法原原理理、特特点点并并克克服服两两者者缺点缺点结果准确、重复性好、操作果准确、重复性好、操作简便便第七十五页，本课件共有118页原原 理理E E试条条为5mm*50mm5mm*50mm的的长条条，一一
40、面面固固定定有有预先先制制备的的稀稀释度度呈呈指指数数级连续增增长的的抗抗菌菌药物物；另一面有另一面有读数和判数和判别刻度。刻度。抗菌抗菌药物梯度可覆盖物梯度可覆盖2020个等倍稀个等倍稀释度度试条条贴在在涂涂有有细菌菌的的琼脂脂平平板板上上孵孵育育后后其其周周围可可见椭圆形形抑抑菌菌环，边缘与与试条条交交点点的的刻度称刻度称为抑制抑制浓度（度（ICIC）。）。第七十六页，本课件共有118页方方 法法培养基和菌种培养基和菌种 同同纸片法片法贴试条条 确保已接种确保已接种细菌的平板干燥菌的平板干燥用用镊子子将将试条条刻刻度度面面朝朝上上放放入入使使之之与与琼脂脂紧密接触密接触药物最高物最高浓度度
41、处应靠平板靠平板边缘轻压以以驱赶其下方气泡赶其下方气泡孵育孵育 时间和和环境要求参考境要求参考说明明书第七十七页，本课件共有118页结果解释结果解释无抑菌无抑菌环，ICIC最大最大浓度；度；抑抑菌菌环延延伸伸至至试条条下下方方、与与试条条无无交交点点，ICIC最小最小浓度度应排排除除薄薄雾状状和和散散在在菌菌落落，读取取完完全全抑抑制制处数数值。ICIC与与CLSICLSI的的MICMIC高度相关、直接高度相关、直接对应。第七十八页，本课件共有118页联合药敏试验联合药敏试验第七十九页，本课件共有118页为确确定定两两种种药物物之之间是是否否存存在在拮拮抗抗或或协同同作用，需用作用，需用联合敏
42、感合敏感试验进行行测定，定，以便以便临床床选择有效的抗生素有效的抗生素方法方法纸片法片法平板平板纸条交条交错法法梯度梯度纸条条试验法法第八十页，本课件共有118页纸片法纸片法与与单片片纸片片扩散法相散法相类似似即即将将两两种种含含药纸片片贴于于已已接接种种被被检菌菌株株的的平平板上，相距板上，相距23 mm23 mm。置于置于35C35C培养培养1824 1824 小小时根根据据呈呈现的的抑抑菌菌图形形报告告“协同同”、“无无关关”或或“拮抗拮抗 作用。作用。第八十一页，本课件共有118页协同作用协同作用第八十二页，本课件共有118页相加作用第八十三页，本课件共有118页拮抗作用第八十四页，本
43、课件共有118页无关作用第八十五页，本课件共有118页CLSI 2010更新内容简介更新内容简介第八十六页，本课件共有118页表1A“建议分组”肠杆菌科细菌头孢噻吩CLSI M100-S20.2010CLSI M100-S20.2010 Group U Group U CLSI M100-S19.2009 CLSI M100-S19.2009 Group A Group A第八十七页，本课件共有118页为什么头孢噻吩被移动位置为什么头孢噻吩被移动位置在美国，注射在美国，注射头孢噻吩已吩已经无效无效口口服服头孢噻吩吩主主要要用用于于肠杆杆菌菌科科细菌菌尿尿路路感感染染的的治治疗；仅尿尿路路感感染
44、染分分离离株株报告告头孢噻吩吩结果。果。头孢噻吩吩敏敏感感性性测试可可以以代代表表其其他他口口服服头孢菌菌素素类头孢羟氨氨苄,头孢泊泊肟,头孢氨氨苄,氯碳碳头孢第八十八页，本课件共有118页肠杆菌科肠杆菌科折点已修正折点已修正(MIC (MIC g/ml)g/ml)药物 CLSI M100-S19 2009 CLSI M100-S20 2010 S I R S I R头孢唑啉=32=4头孢噻肟=64=4头孢唑肟=64=4头孢曲松=64=4头孢他啶=32=16氨曲南=32=16CLSI M100-S20.Table 2A.第八十九页，本课件共有118页肠杆菌科细菌肠杆菌科细菌折点未修正，有待评估
45、折点未修正，有待评估(MIC (MIC g/ml)g/ml)药物CLSI M100-S20 2010 S I R头孢呋辛（非口服）=32头孢吡肟=32头孢替坦=64头孢西丁=32CLSI M100-S20.Table 2A.第九十页，本课件共有118页肠杆菌科折点修正肠杆菌科折点修正 (纸片法纸片法 mm)mm)药物 CLSI M100-S19 2009 CLSI M100-S20 2010 S I R S I R头孢唑啉=1815-17=2315-22=26 23-25=2015-19=25 22-24=2114-20=23 20-22=1815-17=21 18-20=2216-21=21
46、 18-20=17第九十一页，本课件共有118页为什么头孢唑啉没有纸片法折点？为什么头孢唑啉没有纸片法折点？所研究地区范所研究地区范围内内头孢唑啉啉MICMIC折点无可靠折点无可靠结果果需要需要进一步深入研究一步深入研究纸片片药物物浓度有待修正度有待修正第九十二页，本课件共有118页为什么为什么CLSICLSI降低肠杆菌科细菌头孢菌素和降低肠杆菌科细菌头孢菌素和氨曲南的折点？氨曲南的折点？先前的折点是先前的折点是2020多年前制定的多年前制定的加加强了了对以以往往的的和和新新-内内酰胺胺酶耐耐药机机制制的的认识，以及加上，以及加上ESBLsESBLs的加入的加入确定折点有了新方法确定折点有了新
47、方法 药代代动力学和力学和药效效动力学（力学（PK/PD)PK/PD)第九十三页，本课件共有118页 折点无需再评估折点无需再评估 在美国，大多在美国，大多在美国，大多在美国，大多药药物都物都物都物都买买不到或者没有批准使用不到或者没有批准使用不到或者没有批准使用不到或者没有批准使用对于于E.coliE.coliE.coliE.coli，Klebsiella Klebsiella Klebsiella Klebsiella spp.spp.spp.spp.和和和和Proteus Proteus mirabilismirabilis，检测他他们中中的的任任何何一一个个，都都必必须继续完完成成ES
48、BLsESBLsESBLsESBLs筛选和确和确证实验 如如如如果果果果ESBLsESBLsESBLsESBLs阳阳阳阳性性性性，要要要要把把把把cephalosporinscephalosporinscephalosporinscephalosporins、penicillinspenicillinspenicillinspenicillins、aztreonamaztreonamaztreonamaztreonam敏敏敏敏感感感感的的的的结结果改果改果改果改为为耐耐耐耐药药头孢孟多头孢孟多头孢孟多头孢孟多头孢尼西头孢尼西头孢尼西头孢尼西头孢哌酮头孢哌酮头孢哌酮头孢哌酮 拉氧头孢拉氧头孢拉氧
49、头孢拉氧头孢第九十四页，本课件共有118页肠杆菌科修正后的碳氢酶烯类折点肠杆菌科修正后的碳氢酶烯类折点（MIC ug/mlMIC ug/ml）药物 CLSI M100-S19 2009 CLSI M100-S20 2010 S I R S I R多利培南-=4厄他培南=8=1亚胺培南=16=4美罗培南=16=4第九十五页，本课件共有118页ESBLsESBLs检测（检测（1 1）最初的方法来源于：最初的方法来源于：某些分离株在敏感范某些分离株在敏感范围内提高了内提高了MICMIC值值得到关于病人的得到关于病人的得到关于病人的得到关于病人的产产ESBLsESBLs的分离菌株的数据的分离菌株的数据
50、结果有限果有限 对对大大大大肠肠埃埃埃埃希希希希氏氏氏氏菌菌菌菌，克克克克雷雷雷雷伯伯伯伯均均均均属属属属，奇奇奇奇异异异异变变形形形形杆杆杆杆菌菌菌菌进进行行行行ESBLsESBLsESBLsESBLs的的的的筛选筛选和确和确和确和确证实验证实验第九十六页，本课件共有118页ESBLsESBLs检测（检测（2 2）ESBLsESBLs表型表型表型表型检测检测不是最理想的不是最理想的不是最理想的不是最理想的在在在在做做做做确确确确证证实实验验时时，多多多多重重重重耐耐耐耐药药机机机机制制制制的的的的出出出出现现会会会会掩掩掩掩盖盖盖盖ESBLsESBLsESBLsESBLs 例如例如例如例如