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1、生化实验技术与方法第1页，本讲稿共23页实验操作实验操作1.硅胶薄板的制备硅胶薄板的制备：注意胶要均匀。1.2 g硅胶H加4.0 ml0.5%CMC溶液，研磨数分钟后，倒在预先准备好的玻璃板上，铺开，使浆液分部均匀，放在水平台上，自然晾干。第2页，本讲稿共23页2.板的处理板的处理：薄板的活化：105，0.5h 薄板的刮分：径向层析的优点是：样品展层后图谱呈弧形带状，使Rf值相近的化合物也能清楚地分开。3.点样：点样：样品为鼠李糖、木糖和葡萄糖。点样量8-10l。注意：点样点的直径小于5mm，点样要少量多次，吹风机风力不能过大。4.展层：展层：展层溶剂为：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=12：3：3
2、：2（体积比），新鲜配制。5.显色显色：显色剂：苯胺-二苯胺-磷酸试剂。第3页，本讲稿共23页20mm10mm30mm8mm第4页，本讲稿共23页第5页，本讲稿共23页苯丙氨酸解氨酶的提取纯化苯丙氨酸解氨酶的提取纯化 v实验原理实验原理v苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine：ammonia lyase，简称PAL；EC4.3.1.5）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程中起重要作用。v本次实验是以银杏叶为原料采用分步盐析、透析脱盐、离子交换等方法得到苯丙氨酸解氨酶。第6页，本讲稿共
3、23页仪器仪器高速冷冻离心机；恒温水浴；电子天平；柱层析系统试剂试剂酶提取液：0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液（含1mmol/LEDTA、20mmol/L-巯基乙醇）固体硫酸铵0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0，含0.5mmol/LEDTA，2.5%甘油，20mmol/L-巯基乙醇）；DEAE纤维素52第7页，本讲稿共23页操作步骤操作步骤酶液提取酶液提取（1）植物材料2g，剪成小段，加入5倍体积的酶提取液，于冰浴上用研钵研磨。（2）将已匀浆的酶液转入离心管，4000r冷冻离心30min。（3）取离心后的上清液（酶粗提液），量出其体积，留样 0.5ml。硫酸铵分级沉淀酶蛋白硫酸铵分级沉
4、淀酶蛋白（1）根据实际体积、温度和硫酸铵饱和度用量表，算出达到38%饱和度应加入酶粗提液中的硫酸铵量，并称硫酸铵。（240g/L)（2）将酶液倒入烧杯内，边缓慢搅拌边缓慢加入称好的固体硫酸铵，待全部加完后，再缓慢搅拌10min；然后于9000r离心15min，保留上清液于烧杯内。（3）根据硫酸铵饱和度用量表，算出从38%到75%饱和度所需硫酸铵用量。（222g/L)（4）按上述（2）步同法处理，离心后，弃去上清液，保留沉淀。（5）将沉淀溶于2ml酶抽提液中,留样 0.5ml。透析脱盐透析脱盐酶液装入透析袋，放入低盐溶液中透析过夜,留样 0.5ml。第8页，本讲稿共23页银杏叶银杏叶2g+10m
5、l酶提取液研磨酶提取液研磨 4000rpm、30min 取取上清液上清液 加硫酸铵至饱和度加硫酸铵至饱和度38%9000rpm、15min 取取上清液上清液 加硫酸铵至饱和度加硫酸铵至饱和度75%9000rpm、15min 取取沉淀沉淀 溶于溶于2ml酶抽提液酶抽提液 透析透析第9页，本讲稿共23页纯化纯化离子交换层析-DEAE纤维素（1）称取DEAE纤维素52干粉11.5g，加20ml的0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0）浸泡4h以上（或浸泡过夜）。（2）装柱：把预处理的DEAE纤维素52装柱。装柱完成后，用23个床体积的0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0）洗脱平衡该柱。（3
6、）上样：把所得的酶洗脱液小心地注入柱床面中央，上样结束后，在床面以上小心地加入0.02mol/L磷酸盐缓冲液23cm厚液层。注意上样开始就收集流出液。（4）洗柱：约用2倍床体积的A液（0.02mol/L磷酸盐缓冲液）及B液（含1mol/LNaCl 的0.02mol/L磷酸盐缓冲液）洗柱，按洗脱管编号，取A280值高的管中洗脱液测其PAL的活力；合并主要含有PAL活力的各管洗脱液，并量出其体积（ml）。第10页，本讲稿共23页苯丙氨酸解氨酶苯丙氨酸解氨酶的活力测定的活力测定 PAL催化催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸，苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸，反式肉桂酸在反式肉桂酸在290nm处有最大吸收值。若
7、处有最大吸收值。若酶的加入量适当，酶的加入量适当，A290升高的速率可在几升高的速率可在几小时内保持不变，因此通过测定小时内保持不变，因此通过测定A290升高升高的速率以测定的速率以测定PAL活力。规定活力。规定1h内内A290增加增加0.01为为PAL的一个活力单位。的一个活力单位。第11页，本讲稿共23页v取试管取试管2支，按表中所述（支，按表中所述（0号为调零管，号为调零管，1号为测定管。注号为测定管。注意按表格从上到下的顺序加入试剂）。（单位：意按表格从上到下的顺序加入试剂）。（单位：ml）试剂类型调零管（0号）待测管（1号）pH8.7的0.1mol/L硼酸缓冲液320.1mol/L
8、L-苯丙氨酸溶液0 1样品（酶）溶液0.1 0.1将各管混匀，放入将各管混匀，放入40恒温水浴保温恒温水浴保温1h（准确计时），到时各加（准确计时），到时各加0.2 ml 2 mol/LHCl终止反应。终止反应。紫外分光光度于波长紫外分光光度于波长290nm处测定处测定1号管的号管的A290。第12页，本讲稿共23页蛋白质测定（考马斯亮蓝染色法）蛋白质测定（考马斯亮蓝染色法）取酶液取酶液0.1ml，用蒸馏水稀释至，用蒸馏水稀释至5ml取试管取试管8支，按下表加入各溶液：支，按下表加入各溶液：将上述各试管混匀，静置将上述各试管混匀，静置2min，测定各管的，测定各管的A595。试管编号01234
9、567标准蛋白质溶液（ml）50ug/ml 00.20.40.60.81.0/稀释酶液（ml）/1.01.0蒸馏水（ml）2.01.81.61.41.21.01.01.0考马斯亮蓝（ml）2.02.02.02.02.02.02.02.0第13页，本讲稿共23页PAL总活力、比活力、蛋白质含量的计算总活力、比活力、蛋白质含量的计算步步骤骤体体积积（ml）蛋白蛋白质质含量含量（mg）总总活力活力（m）比活力比活力（m/mg protein）粗提粗提硫酸硫酸铵铵沉淀沉淀透析透析离子交离子交换层换层析析第14页，本讲稿共23页SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）测定蛋白质分子量
10、测定蛋白质分子量 v原理：原理：vSDS PAGE是最常用的定性分析蛋白质是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。和测定蛋白质分子量。v 电泳迁移率与颗粒的电荷、形状、大小电泳迁移率与颗粒的电荷、形状、大小（分子量）有关，如电荷、形状都一样，（分子量）有关，如电荷、形状都一样，则电泳迁移率只与分子量有关。则电泳迁移率只与分子量有关。第15页，本讲稿共23页SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE是在是在是在是在PAGPAGPAGPAG系统中引进系统中引进系统中引进系统中引进SDSSDSSDSSD
11、S（十二烷基磺酸钠）。十二烷基磺酸钠）。十二烷基磺酸钠）。十二烷基磺酸钠）。SDSSDSSDSSDS的作用：的作用：的作用：的作用：1.1.1.1.能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂（巯基乙醇）能使二硫键断裂，二级和三级结构，强还原剂（巯基乙醇）能使二硫键断裂，二级和三级结构，强还原剂（巯基乙醇）能使二硫键断裂，二级和三级结构，强还原剂（巯基乙醇）能使二硫键断裂，使蛋白质完全变性。使蛋白质完全变性。使蛋白质完全变性。使蛋白质完全变性。2.2.2.2.能与
12、变性的蛋白质按比例结合，形成能与变性的蛋白质按比例结合，形成能与变性的蛋白质按比例结合，形成能与变性的蛋白质按比例结合，形成SDS-SDS-SDS-SDS-蛋白质复合物。蛋白质复合物。蛋白质复合物。蛋白质复合物。SDS-SDS-SDS-SDS-蛋白质复合物的特点：蛋白质复合物的特点：蛋白质复合物的特点：蛋白质复合物的特点：1.1.1.1.由于结合大量的由于结合大量的由于结合大量的由于结合大量的SDSSDSSDSSDS，使蛋白质使蛋白质使蛋白质使蛋白质丧失了原有的电荷状态，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间丧失了原有的电荷状态，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间丧失了原有的电荷状态，从而降低或消
13、除了各种蛋白质分子之间丧失了原有的电荷状态，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。天然的电荷差异。天然的电荷差异。天然的电荷差异。2.2.2.2.复合物都是椭圆棒状，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间复合物都是椭圆棒状，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间复合物都是椭圆棒状，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间复合物都是椭圆棒状，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的形状差异。天然的形状差异。天然的形状差异。天然的形状差异。因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
14、因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。第16页，本讲稿共23页测定各条带的相对迁移率，根测定各条带的相对迁移率，根据已知蛋白质分子量和它们的据已知蛋白质分子量和它们的相对迁移率，以相对迁移率为相对迁移率，以相对迁移率为横坐标，横坐标，lgMr为纵坐标作标准为纵坐标作标准曲线。根据未知蛋白质的相对曲线。根据未知蛋白质的相对迁移率从标准曲线上查出它们迁移率从标准曲线上查出它们的的lgMr，再换算成蛋白质分子，再换算成蛋白质分子量量第17页，本讲稿共23页 在一定范围内，蛋白质的迁移率和分在一定范围内，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：子量的对数呈线性关系，符合下式：
15、logMW=K-bXlogMW=K-bX，式中：式中：MWMW为分子量，为分子量，X X为迁移为迁移率，率，k k、b b均为常数。均为常数。若将已知分子量的标准蛋白质的迁移若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量得分子量。第18页，本讲稿共23页操作如同操作如同PAGE。样品：蛋白质要完全变性。样品：蛋白质要完全变性。蛋白质蛋白质+SDS+巯基乙醇巯基乙醇 100 2-5 100
16、 2-5分钟分钟标准蛋白市场有售，被测蛋白质的分子量应在标准蛋白标准蛋白市场有售，被测蛋白质的分子量应在标准蛋白分子量以内。分子量以内。染色：染色：考马氏亮蓝、银染色考马氏亮蓝、银染色该法测定蛋白质分子量的局限性：该法测定蛋白质分子量的局限性：1.1.蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，测定时只是它们的亚基或单条肽链的蛋白酶）组成的，测定时只是它们的亚基或单条肽链的MWMW。2.2.电荷异常的蛋白质（如组蛋白，带大量正电荷）电荷异常的蛋白质（如组蛋白，带大量正电荷）3.3.结构异常，不于分子量呈线性关系（如胶原
17、蛋白）结构异常，不于分子量呈线性关系（如胶原蛋白）4.4.带有较大辅基的蛋白质（如糖蛋白）带有较大辅基的蛋白质（如糖蛋白）第19页，本讲稿共23页实验实验操作操作编号溶液名称12%分离胶4%浓缩胶130%Acr 0.8%Bis2.0ml0.2ml2pH 8.8 Tris-HCI1.25ml-3pH 6.8Tris-HCI-0.375ml410%SDS50ul15ul5TEMED5ul5ul610%AP50ul15ul7H2O1.65mlo.9ml总体积约5 mL约1.5 mL 胶的制备胶的制备第20页，本讲稿共23页标标准蛋白准蛋白质质分子量分子量兔磷酸化兔磷酸化酶酶B97 400牛血清白蛋白
18、牛血清白蛋白66 200兔肌兔肌动动蛋白蛋白43 000牛碳酸牛碳酸酐酐酶酶31 000胰蛋白胰蛋白酶酶抑制抑制剂剂20 100鸡鸡蛋清溶菌蛋清溶菌酶酶14 400第21页，本讲稿共23页样品的处理：按样品的处理：按0.5mg蛋白质蛋白质/1mL溶液的比例向标准蛋白质或待溶液的比例向标准蛋白质或待测样品中加入样品溶解液（小试管），充分溶解后，置沸水浴测样品中加入样品溶解液（小试管），充分溶解后，置沸水浴3min，取出冷至室温。，取出冷至室温。加样量：加样量：20l，标准蛋白（，标准蛋白（M）全加。）全加。电泳：点样端负极，恒压：开始电泳：点样端负极，恒压：开始80V，待样品进入分离胶后，待样品
19、进入分离胶后120V。电极缓冲液：电极缓冲液：pH 8.3 Tris Gly染色：脱色考马斯亮兰染色：脱色考马斯亮兰R-250，1h或过夜。或过夜。脱色：先用蒸馏水冲洗凝胶，再用脱色液（冰醋酸：蒸馏水：甲脱色：先用蒸馏水冲洗凝胶，再用脱色液（冰醋酸：蒸馏水：甲醇醇=75：875：50）脱色）脱色1h。第22页，本讲稿共23页测定各条带的相对迁移率，将已知分子测定各条带的相对迁移率，将已知分子量的标准蛋白质的相对迁移率对分子量量的标准蛋白质的相对迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，根据对数作图，可获得一条标准曲线，根据未知蛋白质的电泳相对迁移率即可在标未知蛋白质的电泳相对迁移率即可在标准曲线上求得分子量准曲线上求得分子量。第23页，本讲稿共23页