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1、生化分离技术与血液制品第1页，本讲稿共156页1、生化分离技术的特点1）、通常处理的发酵液或酶反应液中产品的浓度很低。溶液中欲提取物质的浓度越低，提取时所耗费的能量就越大，费用也就越高，产品的价格也越高。一般来说，生物物质的分离式十分困难的。2）、生物产品很多是生化活性物质，易受坏境因素如温度、PH、金属离子和微生物等的影响，甚至失活，因而也增加了分离的难度。3)、对最终产品的质量往往要求极高第2页，本讲稿共156页2、生化产品的特点1)应用面广。医药卫生、环保、动植物生长调节、食品和试剂等2)生化产品种类繁多，包括了大、中、小分子量的结构和性质复杂又各异的生物活性物质，生物活性各异。3)目的
2、产物在初始物料中的含量低。青霉素（4.2%）、庆大霉素（0.2%）、干扰素（50ug/ml）。4)产品价格与产物浓度呈反比第3页，本讲稿共156页5)初始物料成分复杂。除少量产物外，还有大量的细胞及碎片、其他代谢物（几百上千种）、培养基成分、无机盐等。6)生物活性物质的稳定性低。易变质、易失活、易变性，对温度、pH值、重金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等非常敏感。7)产品的质量要求高，尤其是药品等。成品青霉素对其强致敏原青霉噻唑蛋白必须控制RIA值（放射免疫测定）小于100（1.510-6），蛋白类药物（杂质2%）、重组胰岛素中杂蛋白小于0.01%。第4页，本讲稿共156页线粒体(双层膜)
3、是细胞进行有氧呼吸的主要场所。细胞生命活动所需能量的95%来自线粒体。叶绿体(双层膜)是绿色植物细胞进行光合作用的场所。内质网是细胞内蛋白质合成和加工，以及脂质合成的“车间”第5页，本讲稿共156页细胞器细胞质基质细胞壁 细胞质细胞核细胞膜内质网液泡高尔基体核糖体线粒体溶酶体叶绿体植物细胞结构第6页，本讲稿共156页结构：结构：双层膜双层膜外膜外膜内膜。内膜向内内膜。内膜向内折叠形成折叠形成嵴嵴基粒：基粒：位于位于嵴嵴上上基质：基质：内含大量的内含大量的氧化酶氧化酶含有少量的含有少量的DNA、RNA外膜外膜内膜内膜嵴嵴基粒基粒第7页，本讲稿共156页结构：结构：双层膜双层膜外膜外膜内膜内膜基粒
4、：基粒：由多个由多个类囊体类囊体垛叠而成。位于垛叠而成。位于内膜内膜中。中。基质：基质：内含大量的内含大量的光和作用酶光和作用酶含有少量的含有少量的DNA、RNA第8页，本讲稿共156页分布：分布：动植物细胞，动植物细胞，结构：结构：单单层层膜膜功能：功能：与细胞分泌物与细胞分泌物形成有关，形成有关，对蛋白质进行对蛋白质进行加工和转运加工和转运（“发送站发送站”），），植物细胞分裂时与植物细胞分裂时与细胞壁的形成有关。细胞壁的形成有关。第9页，本讲稿共156页分布：分布：植物细胞植物细胞结构：结构：单单层层膜膜，膜内液体叫，膜内液体叫细胞液细胞液，液泡内，液泡内有色素、糖类、蛋白质等；有色素、
5、糖类、蛋白质等；第10页，本讲稿共156页核糖体是由蛋白质和RNA组成,有附着型的、有游离型的，是生产蛋白质的机器。(氨基酸脱水缩合的反应就在核糖体核糖体上进行的)第11页，本讲稿共156页细胞破碎就是采用物理、化学、酶或机械的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中。概念第12页，本讲稿共156页细胞破碎机理图细胞破碎机理图第13页，本讲稿共156页不同细胞破碎的难易程度植物细胞真菌（如酵母菌）革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌动物细胞。第14页，本讲稿共156页分分 类类作用机理作用机理适适应应性性物物理理破破碎碎高高压压匀匀浆浆法法液体剪切作用液体剪切作用可达
6、可达较较高破碎率，可大高破碎率，可大规规模操作，不适模操作，不适合合丝丝状菌和革状菌和革兰兰氏阳性菌氏阳性菌珠磨法珠磨法固体剪切作用固体剪切作用可达可达较较高破碎率，可高破碎率，可较较大大规规模操作，大模操作，大分子目的分子目的产产物易失活，物易失活，浆浆液分离困液分离困难难超声破碎法超声破碎法液体剪切作用液体剪切作用对对酵母菌效果酵母菌效果较较差，破碎差，破碎过过程升温程升温剧剧烈，烈，不适合大不适合大规规模操作模操作渗透渗透压压法法渗透渗透压剧压剧烈改烈改变变破碎率破碎率较较低，常与其他方法低，常与其他方法结结合使用合使用反复反复冻冻融法融法反复反复冻结冻结-融化融化破碎率破碎率较较低，不
7、适合低，不适合对对冷冷冻冻敏感目的敏感目的产产物物干燥法干燥法改改变细变细胞膜的渗透性胞膜的渗透性条件条件变变化化剧剧烈，易引起大分子物烈，易引起大分子物质质失活失活X-press法法固体剪切作用固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，破碎率高，活性保留率高，对对冷冷冻冻敏感敏感目的目的产产物不适合物不适合化化学学破破碎碎酶酶溶法溶法酶酶分解作用分解作用具有高度具有高度专专一性，条件温和，一性，条件温和，浆浆液易分液易分离，溶离，溶酶酶价格高，通用性差价格高，通用性差化学渗透法化学渗透法改改变细变细胞膜渗透性胞膜渗透性具一定具一定选择选择性，性，浆浆液易分离，但液易分离，但释释放率放率较较低，通用
8、性差低，通用性差 细胞破碎的方法第15页，本讲稿共156页高压匀浆法珠磨法超声破碎法渗透压法反复冻融法干燥法X-press法1.物理破碎第16页，本讲稿共156页 高压匀浆法（High-pressure homogenization）大规模细胞破碎的常用方法原理：细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。第17页，本讲稿共156页高压匀浆器高压匀浆器第18页，本讲稿共156页压力 (工业生产中常用工业生产中常用5555
9、70MPa70MPa的压力的压力)循环操作次数(多次循环多次循环的操作方法的操作方法)温度高压匀浆法中影响细胞破碎的因素:第19页，本讲稿共156页不宜采用高压匀浆法的微生物：不宜采用高压匀浆法的微生物：易造成堵塞的团状或丝状真菌，易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）适用于：微生物细胞和植物细胞的大规模破碎。第20页，本讲稿共156页进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相
10、剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。珠磨法（Bead mill）工作原理：第21页，本讲稿共156页卧式第22页，本讲稿共156页WSK卧式高效全能珠磨机ZM系列系列卧式密卧式密闭珠珠(砂砂)磨机磨机第23页，本讲稿共156页影响细胞破碎的因素影响细胞破碎的因素b.珠体的装量珠体的装量na.珠体的大小nc.搅拌速度nd.操作温度ne.被处理细胞的特性实验室规模，珠径0.2mm，工业规模珠径大于0.4mm8090适当540珠磨法的破碎率一般控制在80以下第24页，本讲稿共156页n
11、其原理可能与空穴现象引起的冲击波和剪切作用有关。超声破碎法（Ultrasonication）n超生波破碎细胞时的频率一般为1520kHz，功率为100250W，可分为槽式和探头直接插入介质式两种型式。第25页，本讲稿共156页第26页，本讲稿共156页影响超生波破碎的因素n声强、n频率、n破碎时间、n介质的离子强度、npHn菌体的浓度和种类。n一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。超声破碎时细胞浓度一般在20左右。第27页，本讲稿共156页超声波应用超声波应用超声波破碎法在超声波破碎法在实验室和小规模生产实验室和小规模生产中应用较广。操中应用较广。操作时常应把悬浮
12、液预先冷却到作时常应把悬浮液预先冷却到05，并且还应在夹，并且还应在夹套中连续通入冷却剂进行套中连续通入冷却剂进行冷却冷却。n另外，超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。可以通过添加自由基清洗剂如胱氨酸或谷胱甘肽，或用氢气预吹细胞悬浮液来缓和。第28页，本讲稿共156页将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。渗透压冲击法仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。第29页，本讲稿共156
13、页将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。反复冻融法缺点：适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。第30页，本讲稿共156页使细胞膜结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。（6）干燥法气流干燥真空干燥喷雾干燥冷冻干燥气流干燥主要适用于酵母菌，一般在2530的气流中吹干；真空干燥多用于细菌；冷冻干燥适用于较不稳定的物质。第31页，本讲稿共156
14、页此法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔挤出，由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而破碎。（7）X-press法该法主要用于实验室，具有使用范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点。不适用于对冷冻敏感的物质。第32页，本讲稿共156页酶溶法化学试剂破碎法外加酶法自溶法表面活性物质EDTA螯合剂有机溶剂变性剂2.化学破碎（Chemical permeation）第33页，本讲稿共156页（1）酶溶法（Enzymatic Lysis）外加酶法常用的溶酶G+溶菌酶、适量抑制剂G-溶菌酶、EDTA放线菌溶菌酶酵母菌
15、-葡聚糖酶霉菌 几丁质酶、植物 纤维素酶、半纤维素酶细胞壁溶解酶是几种酶的复合物第34页，本讲稿共156页选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在。在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。酶溶法的优点：酶溶法的缺点：第35页，本讲稿共156页u缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。（2）自溶法（Autolysis）u诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。微生物细胞的自溶常采用加热法和干燥法。u影响自溶过程的主
16、要因素有温度、时间、pH值、缓冲液浓度和细胞代谢途径等。第36页，本讲稿共156页某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。（2）化学试剂破碎法（Chemical permeation）该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。用碱处理细胞，可以溶解除去细胞壁以外的大部分组分。酸处理可以使蛋白质水解成游离的氨基酸。第37页，本讲稿共156页如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。其他的表面
17、活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠、吐温等也可使细胞破碎。表面活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。第38页，本讲稿共156页处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。EDTA螯合剂第39页，本讲稿共156页能溶解细胞壁中的磷脂层，使细胞破坏。有机溶剂变性剂盐酸胍（Guanidinehydrochloride）和脲（Urea）是常用的变性剂。常用的有机溶剂
18、：丁酯、丁醇、甲苯、二甲苯、氯仿及高级醇等。变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。第40页，本讲稿共156页l通用性差；l时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%l有些化学试剂有毒。化学法的优点：缺点：l对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；l细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。第41页，本讲稿共156页细胞破碎效果的检查 破碎率定义:被破碎的细胞的数量占原始细胞数量的百分数，即其中N0：原细胞数，N：破碎后残存的正常细胞。N0和N的可通过直接测定法
19、、目的产物测定法和测定导电率得到。第42页，本讲稿共156页1.直接测定法直接测定法显微镜计数相对快速简单，采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。方法：样本适当稀释后，通过平板计数技术或在血球计数板上用显微镜观察来实现染色细胞的技术。平板计数法计数时间长；只有活细胞才被计数，误差大；细胞聚集时，不利计数。第43页，本讲稿共156页2.目标产物测定法目标产物测定法Rm：理论最大值，R：实验测得值。将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得的标准数值比较，计算其破碎率。第44页，本讲稿共156页3.测定导电率测定导电
20、率细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。导电率随着破碎率的增加而呈线性增加。导电率的大小取决于微生物的种类、处理的条件、细胞的浓度、温度和悬浮液中原电介质的含量等，因此，正式测定前，应预先用其它方法测定标准曲线。第45页，本讲稿共156页选择破碎方法时，需要考虑下列因素选择破碎方法时，需要考虑下列因素：选择破碎方法的依据1.处理量的大小2.细胞壁的强度和结构3.目标产物对破碎条件的敏感性4.破碎后固液分离的难易程度适宜的操作条件应从高的产物释放率、低的能耗和便于后步提取这三方面权衡。第46页，本讲稿共156页盐析法盐析法是指在药物溶液中加入大量的无机盐，使某些高分子物质的溶
21、解度降低沉淀析出，而与其他成分分离的方法。盐析法主要用于蛋白质的分离纯化。常作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。第47页，本讲稿共156页蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。第48页，本讲稿共156页同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶
22、解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而使之从其他蛋白中分离出来。简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。第49页，本讲稿共156页等电点沉淀法等电点沉淀法是利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。第50页，本讲稿共156页原理在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，
23、最易形成沉淀物。等电点时的许多物理性质如黏度、膨胀性、渗透压等都变小，从而有利于悬浮液的过滤。第51页，本讲稿共156页酪蛋白等电点沉淀法快速鉴别奶粉和乳清粉前言：前言：奶粉和乳清粉在外观上很相近,水溶液性状亦相似,直接很难区分。第52页，本讲稿共156页乳清粉不含酪蛋白,只含乳清蛋白,而常规的全脂奶粉、脱脂奶粉以及其他调制奶粉等均含有酪蛋白。实验中,以酸调节待测样品水溶液pH值至4.6附近，奶粉溶液有白色絮状凝块从溶液中沉淀出来,乳清粉溶液,则无此沉淀反应,利用这个现象立即就可以将奶粉和乳清粉区别开来。第53页，本讲稿共156页四、萃取分离萃取：指液-液萃取，利用物质在两个互不相溶的液相之间
24、分配特性不同类进行分离的过程。一般流程：萃取剂和含有目标成分的料液混合接触分离不相溶的两相并回收溶剂萃余液脱除溶剂萃取液：离开萃取器的萃取剂萃余液：经萃取剂相接触后离开的料液第54页，本讲稿共156页单级萃取溶剂萃取技术多级萃取萃取技术双水相萃取技术超临界流体萃取第55页，本讲稿共156页（一）溶剂萃取溶剂萃取技术是利用目的物在两种互不相容的溶液中的溶解度不同，使其从一种溶液中转移到另一种溶液中，以达到浓缩和提纯的目的。在溶液萃取中，被提取的溶液称为料液，其中所含的被提取的物质称为溶质，用来进行萃取的溶剂称为萃取剂。第56页，本讲稿共156页I2水溶液水溶液原因原因:I2在在CCl4中的溶解度
25、大于在水中的溶解度，中的溶解度大于在水中的溶解度，I2在在相间的转移是相间的转移是物理物理过程。而更多的情况下，被萃取对过程。而更多的情况下，被萃取对象要与试剂（萃取剂）发生象要与试剂（萃取剂）发生化学化学作用。作用。CCl4I2/CCl4 H2O实例实例:第57页，本讲稿共156页萃取过程的分离效果主要表现为被分离物质的萃取率，萃取率为萃取剂中被萃取成分与原溶液中该成分的溶质的量之比。萃取率越高表明萃取分离的效果越好。萃取分离的影响因素主要有：萃取剂、分配系数、在萃取过程中两相之间的接触情况。在一定情况，被萃取物的分离效果主要取决于萃取剂的选择和萃取次数。选择合适的溶剂是溶剂萃取分离的关键。
26、第58页，本讲稿共156页溶剂选择应遵循的原则：1、与水溶液不相溶，对目标成分有高的分配系数，溶剂本身低粘度，与水有较大的密度差；2、消毒过程中热稳定性好；3、对生物活性成分、细胞无毒性，对人员无毒性、低成本，能大批量供应，不易燃。第59页，本讲稿共156页按工业上的萃取操作，可分为单级萃取和多级萃取1、单级萃取是萃取操作的基本方式。使料液与萃取剂在混合过程中密切接触，让被萃组分通过相际界面进入萃取剂中，直到组分在两相间的分配基本达到平衡。然后静置沉降，分离成为两层液体，即由萃取剂转变成的萃取液和由料液转变成的萃余液。单级萃取达到相平衡时，被萃组分B的相平衡比，称为分配系数K，即：K=yB/x
27、B式中yB和xB分别为B组分在萃取液中和萃余液中的浓度。第60页，本讲稿共156页2、多级萃取将多个单级萃取单元串接起来可连续操作。主要有错流和逆流两种形式。多级逆流萃取萃取效率最高，在工业上广泛的应用。第61页，本讲稿共156页（二）、双水相萃取 1896年年Beijerinck发现发现：（明胶琼脂）或（明胶琼脂）或 （明胶可溶性淀粉）（明胶可溶性淀粉）混浊不透明溶液混浊不透明溶液 两个有界面的液相两个有界面的液相 两相的主成分都是水两相的主成分都是水 上相上相 富含明胶富含明胶 下相下相 富含琼脂富含琼脂 （或淀粉）（或淀粉）第62页，本讲稿共156页双水相萃取：将两种不同水溶性的聚合物/
28、盐或者聚合物/聚合物系统混合，当各自的浓度达到一定值时，溶液体系会分为互不相容的两个水相，又称为水溶液两相分配技术。该技术应用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白，改善了胞内酶的提取效果。双水相体系：能产生双水相现象的溶液体系。第63页，本讲稿共156页可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）,聚丙二醇/聚乙二醇，甲基纤维素/葡聚糖。双水相萃取中采用的双聚合物系统是PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。另外，聚合物与无机盐的混合溶液也可以形成双水相，例如，PEG/磷酸钾（KPi）、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含
29、PEG,下相富含无机盐。第64页，本讲稿共156页 等体积的等体积的2.2%葡聚糖与葡聚糖与0.72%的甲基纤维素的水溶液的甲基纤维素的水溶液形成的形成的双水相体系双水相体系 上相：上相：0.39%葡聚糖葡聚糖 0.65%甲基纤维素甲基纤维素 98.96%水水 下相下相：1.58%葡聚糖葡聚糖 0.15%甲甲基纤维素基纤维素 98.27%水水第65页，本讲稿共156页 双水相萃取的应用双水相萃取的应用 酶、核酸、生长激素、病酶、核酸、生长激素、病毒等生物物质分离纯化毒等生物物质分离纯化萃取流程（右图）萃取流程（右图）聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）-磷酸盐体磷酸盐体系萃取酶系萃取酶目标酶进入富目标
30、酶进入富PEG上相上相;富富PEG上相中加盐后形成新双上相中加盐后形成新双水相，目标酶进入上相。水相，目标酶进入上相。富富PEG上相中加盐后形成新双上相中加盐后形成新双水相，目标酶进入下相。水相，目标酶进入下相。破碎的细胞破碎的细胞 PEG/磷酸盐磷酸盐 下相：下相：上相产物：目标蛋白质上相产物：目标蛋白质 细胞碎片、杂蛋细胞碎片、杂蛋 盐盐 白、核酸、多糖白、核酸、多糖 形成形成PEG/磷酸盐体系磷酸盐体系 下相：核酸、下相：核酸、上相产物：目标酶上相产物：目标酶 杂蛋白、多糖杂蛋白、多糖 盐盐 形成形成PEG/磷酸盐体系磷酸盐体系 下相：目标酶下相：目标酶 上相：上相：PEG，蛋白质，蛋白
31、质第66页，本讲稿共156页双水相体系的特点：双水相体系的特点：水水含含量量达达7090，组组成成双双水水相相的的高高聚聚物物及及某某些些无无机机盐盐不不会导致生物物质失活或变性，有时有会导致生物物质失活或变性，有时有保护保护作用。作用。可可直直接接从从含含有有菌菌体体的的发发酵酵液液和和培培养养液液中中提提取取所所需需蛋蛋白白质质，还能不经破碎还能不经破碎直接提取直接提取细胞内酶。细胞内酶。易于进行工业放大，处理量可以较大。易于进行工业放大，处理量可以较大。萃萃取取后后，含含有有聚聚合合物物的的目目标标产产物物可可以以采采用用常常用用的的分分离离手手段段（超滤、电泳、色层分离等）将（超滤、电
32、泳、色层分离等）将聚合物除掉聚合物除掉。第67页，本讲稿共156页（三）（三）超临界流体萃取超临界流体萃取 (S Supercrtical upercrtical F Fluid luid E Extraction,xtraction,SFESFE)1、超临界流体萃取的原理及特性超临界流体萃取的原理及特性超临界流体超临界流体(supercrtical fluid)：物物质质处处于于其其临临界界温温度度Tc和和临临界界压压力力pc以以上上时时，即即使使继继续续加加压压也也不不液液化化，只只是是密密度度增增加加，它它具具有有类类似似液液体体的的性性质质，还还保保留留气气体体的性质。的性质。相图相图
33、第68页，本讲稿共156页超临界流体萃取：就是利用SCF的特性，通过改变临界压力或临界温度来提取和分离各种化合物。许多物质都具有SCF的特性，但不是所有具有SCF特性的流体都可以用来做超临界流体萃取第69页，本讲稿共156页作为萃取溶剂的超临界流体应具备的条件：1、具有化学稳定性，对设备没有腐蚀性；2、临界温度不能太高或太低，最好在室温附近或操作温度附近；3、操作温度应低于被萃取溶质的分解温度或变形温度；4、临界压力不能太高，以便节约压缩动力费；5、有较好的选择性，容易得到高纯度制品；第70页，本讲稿共156页6、有较高的溶解度，以减少溶剂用量；7、萃取溶剂容易获取，价格便宜；8、萃取溶剂必须
34、对人体没有任何毒性。CO2是用于生物活性成分临界流体萃取分离的理想溶剂第71页，本讲稿共156页为什么说CO2是超临界流体萃取生物活性的理想溶剂？CO2是安全、无毒、廉价的液体，超临界CO2具有类似气体的扩散系数、液体的溶解力，表面张力为零，能迅速渗透进固体物质之中，提取其精华，具有高效、不易氧化、纯天然、无化学污染等特点。第72页，本讲稿共156页超临界流体萃取可分为三种典型流程；1、等温法萃取过程中温度不变。液体在萃取罐中因加压而成为SCF，溶解目标成分，在分离罐中因减压而变成普通气体，释放溶解成分，实现目标成分的萃取分离。2、等压法萃取过程中压力不变。流体在萃取罐中因降温而成为SCF，溶
35、解目标成分，在分离罐中因升温而变成普通气体，释放溶解成分，实现目标成分的萃取分离。第73页，本讲稿共156页3、吸附法萃取过程中温度、压力均保持不变，SCF萃取出的目标成分在分离罐中被吸附剂吸附，SCF返回萃取罐重复利用。等温法和等压法流程主要用于萃取的溶质是需要精制的目标成分；而吸附法流程则适用于萃取的溶质是需要除去的有害成分，目标成分包含在萃余液中。第74页，本讲稿共156页SFE的的优点优点:萃取剂常温常压下为气体，萃取后方便与萃取组分分离。萃取剂常温常压下为气体，萃取后方便与萃取组分分离。较低的温度和不太高的压力下操作，适合天然产物的分离。较低的温度和不太高的压力下操作，适合天然产物的
36、分离。超临界流体溶解能力可通过调节温度、压力、夹带剂（如醇超临界流体溶解能力可通过调节温度、压力、夹带剂（如醇 类）在很大范围内变化；还可类）在很大范围内变化；还可用压力梯度和温度梯度。用压力梯度和温度梯度。SFE的的缺点：缺点：萃取率较低，选择性不够高。萃取率较低，选择性不够高。第75页，本讲稿共156页 大量饮食咖啡因对人体有害大量饮食咖啡因对人体有害以往工业上除咖啡豆中咖啡因采用以往工业上除咖啡豆中咖啡因采用二氯乙烷二氯乙烷萃取。萃取。缺点：缺点：（1）残留二氯乙烷影响咖啡品质；）残留二氯乙烷影响咖啡品质；（2）二氯乙烷将部分有用香味物质（芳香化合物）带走。）二氯乙烷将部分有用香味物质（
37、芳香化合物）带走。SFE除除咖咖啡啡因因：浸浸泡泡过过的的咖咖啡啡豆豆直直接接置置于于萃萃取取容容器器中中，连连续续（循循环环）用用超超临临界界CO2萃萃取取（T7090；p1620MPa）10小小时时，气气体体中中的的咖咖啡啡因因用用水水吸吸收收除除去去，蒸蒸馏馏可可回回收收咖咖啡啡因因。经经SFE处处理理后后的的咖咖啡啡豆豆中中咖咖啡啡因因含含量量从从0.7-3%降降低到低到0.02%。实例实例1：从咖啡豆中除去咖啡因从咖啡豆中除去咖啡因第76页，本讲稿共156页五、过滤与离心（一）过滤过滤是指利用多孔过滤介质阻留固体颗粒而让液体通过，使固液两相悬浮液得以分离的过程，是目前工业生产中用于分
38、离细胞和不溶性物质的主要方法。虑浆：过滤操作所处理的悬浮液过滤介质：所用的多孔物质（丝网、滤布、硅藻土）滤液：通过介质孔道的液体滤饼（滤渣）：被截留的物质第77页，本讲稿共156页过滤的方式有滤饼过滤和深层过滤滤饼过滤容易再生，可以反复多次使用：但是深层过滤不容易再生，过滤介质都是一次性的。第78页，本讲稿共156页（二）、离心 离心分离是另一种固液分离的重要方法。固体颗粒在连续流动的悬浮液中受到重力、浮力和惯性离心力的多重作用。不同密度、大小及形状的颗粒，其重力沉降加速度、惯性离心加速度均不相同，从而在液相中沉降或移动的距离不同。这种利用惯性离心力实现不通颗粒分离的操作称为离心分离第79页，
39、本讲稿共156页离心分离可分为以下几种形式：1、离心沉降 利用固液两相的相对密度差，在离心机的无孔转鼓或管子中进行悬浮液的分离操作。离心设备有：瓶式离心机、三足离心机、碟式离心机等。2、离心过滤 这种方法兼有离心和过滤的双重作用，在有孔转鼓中同时设置过滤介质，通过离心产生过滤动力，完成过滤过程。3、超离心 指应用较大的惯性离心力将混合物相中的各个组分进行分离、浓缩和提纯。第80页，本讲稿共156页 超离心就是利用球形颗粒在悬浮液相中分布的差役，分离不同相对密度液体的操作。按照处理要求和规模又分为 制备型超离心和分析型超离心。其中制备型离心又有以下三种方法：（1）差速离心：一般用于分离沉降系数相
40、差较大的颗粒，如细胞匀浆液中细胞器的分离。第81页，本讲稿共156页（2）速率密度梯度离心：仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒，与颗粒密度无关，如RNA-DNA 混合物等，但大小相同，密度不同的颗粒不能用此方法。（3）等密度梯度离心 当不同颗粒存在密度差时，在离心力场作用下，颗粒向外或向内移动到与它们密度正好相等的位置上并形成区带。第82页，本讲稿共156页六、色谱分离 色谱法是一种分离、分析方法。它利用被分离的诸物质在互不相溶互不相溶的两相中分配系数的微小差异进行分离。当两相作相对移动相对移动时，使被测物质在两相之间进行反复反复多次分配多次分配，使原来微小的差异累加产生了很大的效果，形成差速迁
41、移差速迁移，使各组分在柱内移动的同时逐渐分离，以达到分离、分析及测定一些物理化学常数的目的。第83页，本讲稿共156页色谱法的特点色谱法的特点1分离效率高：分离效率高：可在很短的时间内分离多达二、三百个组 分的复杂物质，柱效能可达106的理论板。2检测能力强：检测能力强：可以检测出10-1110-15克级的痕量组分，能 满足环境检测、农药残留等大量日常检测 分析的需要。3样品用量少：样品用量少：样品用量一般为微升级，少的可达纳克级。4适用范围广：适用范围广：几乎所有与化学有关的领域都有其用武之 地。第84页，本讲稿共156页根据操作方式和目的的不同，色谱法可分为分析型色谱和制备型色谱。分析型色
42、谱的目的是分析样品的组成信息制备型色谱的目的是制备、纯化产品在色谱分离中，其中一相的介质是不动的，称为固定相另一相介质携带含目标成分的原料，呈流体状流经固定相，称为流动相。第85页，本讲稿共156页色谱分离过程：加试样 展开 分部收集目前，工业上常用到的色谱分离技术包括：凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、反相和疏水作用色谱法以及亲和色谱法。1、凝胶过滤色谱 凝胶过滤又叫分子筛色谱，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤色谱柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了第86页，本讲稿共156页基本原理基本原理大分子物质在凝胶颗粒间隙中运动
43、小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质结果使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。第87页，本讲稿共156页分离过程分离过程第88页，本讲稿共156页凝胶色谱介质凝胶色谱介质理想的凝胶过滤介质具有高物理强度及化学稳定性，能够耐受高温高压和强酸强碱，具有高化学惰性，内孔径分布范围窄，珠粒颗粒大小均一度高。凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。目前，常用的有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶
44、、聚丙烯酰胺凝胶等。第89页，本讲稿共156页凝胶色谱分离具有工艺简单、操作方便、分离回收率高、实验重复性好等特点，适用于水溶性高分子物质的分离。尤其是不会改变样品生物活性，特别适合蛋白质、核酸、激素、多糖等的分离纯化。2、离子交换色谱离子交换色谱是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行这是目前各种色谱中应用最为广泛的技术。第90页，本讲稿共156页基本原理基本原理带电物质因电荷力作用而在固定相与流动相之间分
45、配得以相互分离。蛋白质是两性电解质。当 pH pI时，蛋白质带净负电荷。由于各种蛋白质等生物大分子的等电点不同，可以通过改变溶液的pH和离子强度来影响它们与离子交换树脂的吸附作用，从而将它们相互分离开来。第91页，本讲稿共156页 生物活性物质都有亲和作用，如酶与底物、激素与受体、核酸的互补链间，多糖与蛋白质复合体。亲和层析是利用生物大分子的特异亲和力而设计的层析技术。可逆结合的特异性物质称为配基，与配基结合的层析介质称为载体。亲和层析能从粗提液中，通过一次简便处理，便可得到高纯度的活性物质，既可分离一些生物材料中含量极微的物质，又能分离一些性质十分相似的物质。3、亲和色谱分离第92页，本讲稿
46、共156页七、七、干干 燥燥 干燥干燥：是从湿的固体生物药物中，除去水分或溶剂而获得相对或绝对干燥制品的工艺过程。工业上从生物培养液或提取反应液中去除大部分的水分，主要有两个方法：机械法和加热法第93页，本讲稿共156页1、干燥的过程 湿物料的干燥过程分为两个阶段：第一阶段：湿物料表面受热，温度升高，表面的水分蒸发；第二个阶段：热量向物料内部传递，内部的水分向表面扩散。干燥速率：在干燥过程中，单位时间内单位面积上汽化的水分量。第94页，本讲稿共156页干燥的过程也是加热的过程。按照加热方式的不同，干燥分为接触、对流、和辐射等几种主要类型。2、喷雾干燥 将液体通过喷射装置喷成雾滴后，在一定流速的
47、热气流中，迅速蒸发干燥的方法。喷雾干燥的特点：干燥时间短、干燥温度低、产品质量好，易溶解。第95页，本讲稿共156页3、冷冻干燥 冷冻干燥就是把含有大量水分物质，预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使水蒸汽直接升华出来，而物质本身剩留在冻结时的冰架中，因此它干燥后体积不变，疏松多孔在升华时要吸收热量。引起产品本身温度的下降而减慢升华速度，为了增加升华速度，缩短干燥时间，必须要对产品进行适当加热。整个干燥是在较低的温度下进行的。第96页，本讲稿共156页制品的冷冻干燥过程包括冻结、升华和再干燥3个阶段。冻结先将欲冻干物料用适宜冷却设备冷却至2左右，然后置于冷至约一40(1333Pa)冻干箱
48、内。关闭干燥箱，迅速通入制冷剂，使物料冷冻，以克服溶液的过冷现象，使制品完全冻结，即可进行升华。升华制品的升华是在高度真空下进行的，在压力降低过程中，必须保持箱内物品的冰冻状态，以防溢出容器。待箱内压力降至一定程度后，再打开罗茨真空泵(或真空扩散泵)，压力降到133Pa，一60。C以下时，冰即开始升华，升华的水蒸气在冷凝器内结成冰晶。为保证冰的升华，应开启加热系统，将搁板加热，不断供给冰升华所需的热量。第97页，本讲稿共156页再干燥在升华阶段内，冰大量升华，此时制品的温度不宜超过最低共熔点，以防产品中产生僵块或产品外观上的缺损，在此阶段内搁板温度通常控制在10之间。制品的再干燥阶段所除去的水
49、分为结合水分，此时固体表面的水蒸气压呈不同程度的降低，干燥速度明显下降。在保证产品质量的前提下，在此阶段内应适当提高搁板温度，以利于水分的蒸发，一般是将搁板加热至3035C，实际操作应按制品的冻干曲线(事先经多次实验绘制的温度、时间、真空度曲线)进行，直至制品温度与搁板温度重合达到干燥为止。第98页，本讲稿共156页第二节血液制品第99页，本讲稿共156页什么是血液？什么是血液？简称血。人或高等动物体内循环系统中的液体组织，暗赤简称血。人或高等动物体内循环系统中的液体组织，暗赤或鲜红色，有腥气，对维持生命起重要作用。或鲜红色，有腥气，对维持生命起重要作用。血血 浆浆血细胞血细胞白细胞白细胞红细
50、胞红细胞血小板血小板（45%）（55%）水：水：91-92%固体成分：固体成分：8-9%各种蛋白质、各种蛋白质、无机盐、脂类、无机盐、脂类、内分泌激素、内分泌激素、维生素等维生素等血液血液第100页，本讲稿共156页血液的功能血液的功能红细胞：携带红细胞：携带O2和和CO2。白细胞：防御功能（杀灭病原体，排斥外来异物）。白细胞：防御功能（杀灭病原体，排斥外来异物）。血小板：血液凝固功能（止血作用）。血小板：血液凝固功能（止血作用）。血血 浆：运送营养物质和代谢物，参加调节体温和维持酸浆：运送营养物质和代谢物，参加调节体温和维持酸碱平衡。碱平衡。第101页，本讲稿共156页人体内的血液量大约是体