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1、实验五实验五 线粒体和液泡系的超活染色与观察线粒体和液泡系的超活染色与观察实实 验验 目目 的的一、观察动、植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布。二、学习一些细胞器的超活染色技术。实实 验验 原原 理理活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞舶死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特
2、殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学，特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿 B（
3、Janus green B）和中性红（neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。实实 验验 用用 品品一、器材显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀、载玻片、凹面载玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。二、试剂1Ringer 溶液氯化钠0.85g(变温动物用 0.65g)氯化钾0.25g氯化钙0.03g蒸馏水100ml2.10、13 000 中性红溶液称取 0.5g 中性红溶于 50 ml Ringer 液，稍加热(3040C)使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。临用前，取已配制的 1中性红
4、溶液 l ml，加入 29 ml Ringer 溶液混匀，装入棕色瓶备用。31、1/5000 詹纳斯绿 B 溶液称取 50mg 詹纳斯绿 B 溶于 5ml Ringer 溶液中，稍加微热(3040)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为 1原液。取1原液 l ml 加入 49ml Ringer 溶液，即成 1/5000 工作液装入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。三、材料1.小白鼠肝细胞。2.人口腔上皮细胞。3.洋葱鳞茎内表皮细胞。4.蟾蜍胸骨剑突软骨细胞。5.小麦或黄豆幼根根尖。实实 验验 方方 法法一、线粒体的超活染色与观察线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随不同物种、不同
5、组织器官和不同的生理状态而发生变化。詹纳斯绿 B 是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；而线粒体面围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。(一)人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察1.取清洁载玻片放在 37恒温水浴锅的金属板上，滴 2 滴 1/5 000 詹纳斯绿 B 染液。2.实验者用牙签宽头在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色 1015min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液)，盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，
6、置显微镜下观察。3.在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即是线粒体。(二)小白鼠肝细胞线粒体的超活染色观察1.用颈椎脱臼法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝边缘较薄的肝组织一小块，放入表面皿内。用吸管吸取 Ringer 液，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。2.在干净的凹面载玻片的凹穴中，滴加5 000 詹纳绿 B 溶液，再将肝组织块移人染液，注意不可将组织块完全淹没，要使组织块上面部分半露在染液外，这样细胞内的线粒体酶系可充分得到氧化，易被染色。当组织块边缘被染成蓝绿色即成(一般需染
7、 2030min)。3.吸去染液，滴加 Ringer 溶液，用眼科剪将组织块着色部分剪碎，使细胞或细胞群散出。然后，用吸管吸取分离出的细胞悬液，滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片进行观察。4.在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜或油镜下观察，可见具有 12 个核的肝细胞质中，有许多被染成蓝绿色的线粒体，注意其形态和分布状况。(三)洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的超活染色观察1.用吸管吸取 1/5000 詹纳斯绿 B 染液，滴一滴于干净的载玻片上，然后，撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，染色1015min。2.用吸管吸去染液，加一滴Ringer 液注意使内表皮组织展平，盖上盖玻片进行观察。3.在高倍镜下
8、，可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据，细胞核被挤至一侧贴细胞壁处。仔细观察细胞质中线粒体的形态和分布。二、液泡系的超活染色与观察中性红为弱碱性染料，对液泡系（即高尔基体）的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。（一）蟾蜍胸骨剑突软骨细胞的液泡系中性红染色观察软骨细胞能分泌软骨粘蛋白和胶原纤维等，因而粗面内质网和高尔基体都发达中性红超活染色后，可明显地显示出液泡系。1.将蟾蜍处死后，剪取胸骨剑突最薄的部分一小块，放入载波片上的13 000 中性红染液滴中，5 染色10min。2.用吸管吸去染液，滴加Ringer 液，盖上盖玻片进行
9、观察。3.在高倍镜下，可见软骨细胞为椭圆形，细胞核及核仁清楚易见，在细胞核的上方胞质，有许多被染成玫瑰红色大小不一的泡状体，这一特定区域叫“高尔基区”，即液泡系”。（二）小麦根尖细胞液泡系的中性红染色观察1.实验前，把小麦种子或黄豆培养在培养皿内潮湿的滤纸上，使其发芽，胚根伸长到 l cm 以上。2.用双面刀片把出生的小麦或黄豆幼苗根尖(约 l2cm 长)小心切一纵切面，放入载玻片上的的 l/3000 中性红染液滴中，染色510min3.吸去染液，滴一滴 Ringer 液，盖上盖玻片，并用镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察。4.在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在
10、很多大小不等的染成致玫红色的圆形小泡，这是出生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。从以上观察的结果，想想植物细胞液泡系的形态演进情况。作作业业一、绘口腔上皮细胞示线粒体形态与分布。二、绘蟾蜍胸骨剑突软骨细胞示液泡系形态与分布。思思 考考 题题1.用一种活体染色剂对细胞进行超活染色，为什么不能同时观察到线粒体、液泡系等多种细胞器?2.小麦或黄豆根尖经中性红超活染色，为什么看到生长点的细胞中液泡多，而且染色深，延长区细胞中液泡数量变少，染色浅?3.高等动物和高等植物细胞中的液泡系(高尔基体)分布上有何不同?