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1、细胞内液泡系和线粒体的活体染色实验三实验三一、实验目的一、实验目的1.了解活体染色的定义及原理；了解活体染色的定义及原理；2.熟悉液泡系和线粒体活体染色的方法熟悉液泡系和线粒体活体染色的方法和步骤。和步骤。二、定义及原理二、定义及原理所所谓谓活活体体染染色色，是是指指利利用用某某些些无无毒毒或或毒毒性性较较小小的的染染色色剂剂显显示示出出细细胞胞内内某某些些天天然然构构造造存存在在的的真真实实性性，而而不不影影响响细细胞胞的的生生命命活活动动，不不产产生生任任何何物物理理化化学学变变化化以以致致引引起起细细胞胞的的死死亡亡的的染染色色方方法法。即即在在染染色色和和观观察察过过程程中中，细胞或组
2、织始终保持其生命状态。细胞或组织始终保持其生命状态。活活染染法法弥弥补补了了活活观观察察法法不不能能显显示示细细胞胞精精细细结结构构的的不不足足，也也避避免免了了固固定定染染色色法法对对细细胞胞结结构构的的破破环环和和造造成成人人为为假假象象的的弊弊病病。遗遗憾憾的的是是，适适宜宜活活体体染染色色的的染染料料较较少少，能能显示出的结构和种类也不多。显示出的结构和种类也不多。活体染色分为体内活染和体外活染两种。前活体染色分为体内活染和体外活染两种。前者是将染料注射于生物体内，染色后再取材者是将染料注射于生物体内，染色后再取材观察。后者是取材后，对离体的活细胞进行观察。后者是取材后，对离体的活细胞
3、进行染色。为保持离体细胞的正常存活，染色时染色。为保持离体细胞的正常存活，染色时需供给细胞以正常的温度，渗透压，需供给细胞以正常的温度，渗透压，PHPH等。等。在在中中性性或或微微碱碱性性环环境境中中，植植物物的的活活细细胞胞能能大大量量吸吸收收中中性性红红并并向向液液泡泡中中排排泌泌，由由于于液液泡泡在在一一般般情情况况下下呈呈酸酸性性反反应应，因因此此，进进入入液液泡泡的的中中性性红红便便解解离离出出大大量量阳阳离离子子而而呈呈现现樱樱桃桃红红色色，在在这这种种情情况况下下，原原生生质质和和细细胞胞壁壁一一般般不不着着色色；死死细细胞胞由由于于原原生生质质变变性性凝凝固固，细细胞胞液液不不
4、能能维维持持在在液液泡泡内内，因因此此，用用中中性性红红染染色色后后，不不产产生生液液泡泡着着色色现现象象，相相反反，中中性性红红的的阳阳离离子子，却却与与带带有有一一定定负负电电荷荷的的原原生生质质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。原原理理：中中性性红红是是一一种种弱弱碱碱性性 pH 指指示示剂剂，变变色色范范围围 pH6.48.0之之间间（由由红红变变黄黄）。其其胶胶粒粒表表面面带带阳阳离离子子，被被染染部部分分具具阴阴离离子子，它它们们彼彼此此之之间间就就发发生了电吸附作用（静电吸附）。生了电吸附作用（静电吸附）。在在动动物物细细胞胞内内，凡凡是是
5、由由膜膜所所包包围围的的小小泡泡和和液液泡泡除除线线粒粒体体外外都都属属于于液液泡泡，包包括括高高尔尔基基器器、溶溶酶酶体体、微微体体、消消化化泡泡、自自噬噬小小体体、残残体体、胞胞饮饮液液泡泡和和吞吞噬噬泡泡，都都是是由由一一层层单单位位膜膜包包围围而而成成。这这些些细细胞胞器器几几乎乎每个细胞都有。每个细胞都有。软软骨骨细细胞胞内内含含有有较较多多的的粗粗面面内内质质网网和和发发达达的的高高尔尔基基复复合合体体，能能合合成成与与分分泌泌软软骨骨粘粘蛋蛋白白及及胶胶原原纤纤维维等，因而液泡系发达。等，因而液泡系发达。中中性性红红是是液液泡泡系系特特殊殊的的活活体体染染色色剂剂，只只将将液液泡
6、泡系系染染成成红红色色，在在细细胞胞处处于于生生活活状状态态时时，细细胞胞质质及及核核不被染色，中性红染色可能与液泡中的蛋白有关。不被染色，中性红染色可能与液泡中的蛋白有关。健那绿健那绿(Janus green B)(Janus green B)染液，原来也曾译为詹纳染液，原来也曾译为詹纳斯绿斯绿B B，是专一性染线粒体的活细胞染料，线粒体，是专一性染线粒体的活细胞染料，线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状即有色状态态)呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态成为无色状态.。因此可以使活细胞中的
7、线粒体呈。因此可以使活细胞中的线粒体呈现蓝绿色，而细胞质接近无色。线粒体能在健那绿现蓝绿色，而细胞质接近无色。线粒体能在健那绿染液中维持活性数小时，通过染色，可以在高倍显染液中维持活性数小时，通过染色，可以在高倍显微镜下观察到生活状态的线粒体的形态和分布。微镜下观察到生活状态的线粒体的形态和分布。关于活染的机制，关于活染的机制，三、操作程序三、操作程序用用解解剖剖针针破破坏坏蛙蛙的的脊脊髓髓，然然后后把把腹腹部部皮皮肤肤剪剪开开，使使露露出出胸胸骨骨的的剑剑突突部部分分，剪剪取取一一小小块块剑剑突突软软骨骨边边缘缘最最薄薄的的部部分分，放放入入载载片片中中央央的的中中性性红红染染液液中中，染染
8、色色1030分分钟钟，盖盖上上盖盖玻玻片片。用用高高倍倍镜镜观观察察，可可见见软软骨骨细细胞胞为为椭椭圆圆形形、细细胞胞核核及及核核仁仁清清楚楚易易见见，在在细细胞胞核核的的上上方方有有许许多多被染成玫瑰红大小膜泡，此区即液泡系。被染成玫瑰红大小膜泡，此区即液泡系。取取蛙蛙肝肝脏脏边边缘缘米米粒粒大大小小的的一一块块组组织织，放放入入生生理理盐盐水水中中洗洗涤涤去去除除血血液液，用用吸吸水水纸纸吸吸去去多多余余水水分分，将将肝肝组组织织置置于于滴滴有有健健那那绿绿-B的的载载玻玻片片上上，用用镊镊子子撕撕拉拉肝肝组组织织，然然后后将将整整快快的的肝肝组组织织移移出出，加加盖盖玻玻片片观观察察破
9、破碎碎的的肝肝细细胞胞。染染色色10min左左右右可可见见玻玻片片上上有有形形状状规规则则的的椭椭圆圆形形血血细细胞胞，形形状状不不规规则则的的近近于于方方圆圆形形的的肝肝细细胞胞及及远远远远小小于于细细胞胞的的作作不不规规则则运动的线粒体。运动的线粒体。用用镊镊子子撕撕取取玉玉树树叶叶叶叶片片下下表表皮皮，健健那那绿绿-B染染色色10分分钟钟，可可在在细细胞胞质质中看到随细胞质环流而运动的被染成兰色的线粒体中看到随细胞质环流而运动的被染成兰色的线粒体;撕撕取取莴莴笋笋叶叶下下表表皮皮，置置于于中中性性红红中中染染色色10分分钟钟，可可见见许许多多大大小小不不同同的液泡。的液泡。作业作业 绘绘制制中中性性红红活活染染的的液液泡泡系系图图和和健健那绿那绿-B活染的线粒体图活染的线粒体图,并作简要分析。并作简要分析。