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1、作者单位:1 辽宁医学院基础学院生理学教研室，辽宁 锦州 121001;2 军事医学科学院毒物药物研究所作者简介:李伟红(1969 )女，辽宁人，副教授，硕士，主要从事生殖内分泌、神经内分泌生理研究。【实验研究】芹菜素对雌性大鼠下丘脑 腺垂体 卵巢轴调控作用摘要:目的研究芹菜素(apigenin，Api)对雌性大鼠腺垂体、卵巢颗粒细胞分泌促卵泡激素(follicle stimulatinghormone，FSH)、黄体生成素(luteinzing hormone，LH)、雌二醇(estradiol，E2)及孕酮(progesterone，P)的影响。方法应用细胞培养技术，放射免疫测定法及下丘脑
2、 腺垂体 卵巢三级培养细胞顺序灌注法。采用下列顺序灌注法，Api 浓度分别为104mol/L、105mol/L、106mol/L，(1)H-AP-O;(2)H-AP(Api)-O;(3)H-AP-O(Api)，分别测定腺垂体和卵巢颗粒细胞培养液中 FSH、LH、H2及 P 的含量。结果实验组(3、5、7 组)分别与对照组(1 组)比较差异有统计学意义(P 0.01)，Api(104mol/L 106mol/L)以浓度依赖方式使培养的雌性动情前期大鼠卵巢颗粒细胞 E2及 P 的含量也呈减少，且随着浓度的增加，E2及 P 的含量也呈减少趋势;Api 组(104mol/L 106mol/L)动情前期
3、雌性大鼠腺垂体细胞 LH、FSH 的分泌量与对照组比较差异无统计学意义(P 0.05)。结论Api 在卵巢水平上发挥作用，抑制雌性动情前期大鼠卵巢颗粒细胞 E2及 P 的分泌。对雌性动情前期大鼠腺垂体分泌 FSH 和 LH 无作用。关键词:芹菜素;雌性大鼠;细胞培养;放射免疫测定法;细胞顺序灌注法中图分类号:R 339.2文献标志码:A文章编号:1001-0580(2011)07-0885-03Regulatory effect of epigenin on hypothalamus-adenohypophysis-ovarian in ratsLI Wei-hong，ZHOU Feng，ZH
4、UANGXiao-mei，et al Department of Physiology，School of Basic Medicine，Liaoning Medical College(Jinzhou 121001，China)Abstract:ObjectiveTo study the effect of apigenin(Api)on adenohypophysis，follicle stimulating hormone(FSH)，luteinzing hormone(LH)，estradiol(E2)，and progesterone(P)MethodsCell culture，ra
5、dioimmunoassay，and hypothala-mus(H)-adenohypophysis(AP)-ovarian(O)tertiary culture cell sequence perfusion were adopted The sequence of perfu-sion was H-AP-O and the concentrations were 104mol/L，105mol/L，and 106mol/L The contents of FSH，LH，E2andP in adenohypophysis and ovarian granulosa cell medium
6、were measured ResultsIn ovarian granulosa cells of proestrusrats treated with Api(104mol/L 106mol/L)，E2and P secretion decreased in concentration-dependence manner com-pared to those of the control group with statistically significant differences(P 0.01)and the contents of E2and P decreasedwith the
7、increase of Api conentration There were no significant differences in LH and FSH secretion of adenohypophysiscells between the proestrus rats in Api treatment groups and the control group(P 0.05)ConclusionApi inhibits E2andP secretion of ovarlan granular cells but does not affect FSH and LH secretio
8、n of adenohypophysis in proestrus female ratsKey words:apigenin;female rat;cell culture;radioimmunoassay;cell sequence perfusion国外研究已证实芹菜素(apigenin，Api)是一种植物雌激素1，参与内分泌和生殖功能的调节，但研究仅限于卵巢组织的离体实验，雄性2研究较少。本实验采用细胞培养和顺序灌注流方法，模拟体内基础调节方式，于体外培养下丘脑 腺垂体 卵巢轴三级组织细胞培养液中加入不同剂量的Api，观察 Api 对动情前期雌性大鼠腺垂体、卵巢颗粒细胞分泌促卵泡激素(
9、follicle stimulating hormone，FSH)、黄本生成素(luteinzing hormone，LH)、雌二醇(estradiol，E2)及孕酮(progesterone，P)的影响，以探讨 Api 对下丘脑 腺垂体 卵巢轴的调控作用及作用部位。1材料与方法1.1实验动物与主要试剂成年雌性 Sprague-Dawley(SD)大鼠 20 只，体重 180 220 g，由辽宁医学院实验动物中心提供，动物许可证号:医动字第 SCXY(辽)2003 2007 号;改良Eagle 培养基(Dulbeccos modified eagle medium，DMEM)(德国GIBICO
10、 公司)，胎牛血清(fatal bovine seru，FBS)(天津生物技术公司)，1250 胰蛋白酶(美国 Amresco 公司)，芹菜素(api-genin)(美国 Sigma 公司)，聚酰亚胺(polyimide，PI)(美国 Sig-ma 公司)，核糖核酸酶(rnase)(德国 Gibco 公司)，L-多聚赖氨酸(美国 Sigma 公司)，E2、P、FSH、LH 放免疫试剂盒(美国3VSigma 公司)。1.2下丘脑、腺垂体及卵巢颗粒细胞体外培养方法1.2.1取材取 SD 雌性成年大鼠，180 220 g，隔离饲养 1周，自由食水，自然光照周期，实验当日晨查性周期，选动情前期大鼠 2
11、8 只，随机分为 7 组，每组 4 只。清醒状态下断头，经无菌手术取出下丘脑组织，立即用含 100 IU/mL 青霉素的Hanks 液中冲洗血污后放入冰 DMEM 培养液中，同时从垂体窝中取出垂体，用眼科镊子分离出腺垂体，同样洗去血污后放入冰 DMEM 培养液中。剖开腹腔取卵巢。去膜后同样处理。1.2.2细胞培养将下丘脑、腺垂体在 DMEM 培养液中(含10%FBS)剪成碎块 0.5 1.0 mm，静置 5 min 后吸去 DMEM培养液，放入 0.25%的胰蛋白酶(约为组织的 30 50 倍)，摇匀后置于 37 的 CO2孵箱中消化并不时摇动。25 min 后加入约 2 倍量的 DMEM 培
12、养液(含 15%FBS)终止消化。静置5 min(37 孵箱)后吸出上面的悬浮液并放入孵箱内保存。将未消化的碎块加入新的胰蛋白酶再进行消化(同上)，将两次的上清液收集在一起，用 200 目的钢网过滤，将滤液离心(1000 r/min，10 min)后弃上清，加入 2 倍量的 DMEM 培养液漂洗细胞团 2 次，离心后弃上清加入少量的 DMEM 培养液，用细口滴管反复轻轻吹打细胞团，使其悬浮并分散3。在解剖显微镜下用不锈钢针划破卵巢中所需卵泡，卵巢被冲洗 3 次后(DMEM 培养液)，将冲洗液混在一起离心(500 r/min，5min)后，弃上清，用 DMEM 培养液稀释沉积管底的细胞4。0.1
13、 mL 0.4%台盼蓝加 0.9 mL 细胞悬液进行计数，检测细胞588中国公共卫生 2011 年 7 月第 27 卷第 7 期Chin J Public Health Jul 2011 Vol27 No7的存活率。用 DMEM 培养液(10%FBS+100 IU/mL 青霉素+100 g/mL 链霉素+40 g/mL 庆大霉素)调整细胞浓度制成 2.5 105/mL 细胞悬液，接种于无菌的每孔含 0.1 mg/mL 多聚赖氨酸的 6 孔培养板内，每孔 5 mL;同时接种于 24 孔及 40 孔培养板内，每孔分别为 1 mL 及 0.2 mL，并于 24 孔培养板中卵巢细胞孔内放入一无菌盖玻片
14、，放入 CO2孵箱内(Api 用二甲基亚砜 DMSO 5 L 配成母液)。1.2.3顺序灌流按下列顺序分为 7 组，(1)为对照组。孵育 24 h 后每天在倒置显微镜下观察各孔培养细胞形态，见培养细胞生长良好，卵巢颗粒细胞及腺垂体细胞贴壁生长，下丘脑细胞悬浮生长，然后按下述顺序加入处理因素，顺序灌流培养程序如下:(1)HAPO(2)HAP(Api 104mol/L)O(3)HAPO(Api 104mol/L)(4)HAP(Api 105mol/L)O(5)HAPO(Api 105mol/L)(6)HAP(Api 106mol/L)O(7)HAPO(Api 106mol/L)以下各组均按时间分为
15、 1，2，3，4，5 d。1.2.4样本采集于 6 孔培养板内各取卵巢及腺垂体培养液 2 mL，并将腺垂体培养液 2 mL 加入到卵巢培养液中，将下丘脑培养液 2 mL 加入到腺垂体培养液中。同时以新鲜的DMEM 培养液补充各孔，共收取培养液 5 次。全部培养液放入小瓶内，存放于 40 冰箱 0.1 Mpa 气压下，冷冻干燥后按药盒说明连续 5 天分别测定样本中的 LH、FSH、P、E2的含量。1.3统计分析数据以珋x s 表示，数据的统计学分析采用 t检验，以 P 0.05 为差异有统计学意义。应用 SPSS 10.0 软件处理完成。2结果2.1Api 对动情前期雌性大鼠 E2及 P 分泌的
16、影响(表 1，2)在卵巢颗粒细胞培养液中加入 Api(104mol/L 106mol/L)时，3、5、7 组分别与对照组(1 组)比较，差异均有统计学意义(P 0.01)。而在腺垂体培养液中加入 Api(104mol/L 106mol/L)时，2、4、6 组分别与对照组(1 组)比较，差异无统计学意义(P 0.05)。结果表明 Api(104mol/L 106mol/L)使原代培养的雌性动情前期大鼠卵巢颗粒细胞 E2及 P 的分泌量明显减少，呈剂量依赖性，实验结果表明 Api(104mol/L 106mol/L)使原代培养的雌性动情前期大鼠卵巢细表 1Api 对动情前期雌性大鼠 E2分泌的影响
17、(珔x s，Pg/mL)组别时间(d)1234514500 3166933 4165433 2255576 3244666 20823886 1475830 251a4826 3854983 2254233 30531066 153b1400 229b1566 305b1523 325b1380 322b44800 2005883 2564750 3974983 3014260 31051250 059b2366 251b1967 202b2003 347b1806 121b63903 1816250 1504950 3974983 3334220 07271816 149b2833 252b
18、3367 301b3233 251b2750 217b注:与对照组比较，a P 0.05，b P 0.01。胞 E2及 P 的分泌量明显减少，呈剂量依赖性，提示 Api 随着浓度的增加抑制卵巢颗粒细胞分泌 E2及 P 的作用增强。表 2Api 对动情前期雌性大鼠分泌 P 的影响(珔x s，Pg/mL)组别时间(d)1234513180 2404780 1703540 2873300 1502740 12422973 2014136 207a3320 1313100 1772636 08531540 159b2646 165b1786 140b1533 186b1416 202b43226 28
19、04390 2123330 1253040 1152523 10751920 1862953 2642596 187b2373 270b2276 112b62926 1814110 1963303 0833230 2872533 06171840 165b2793 150b2803 184b2660 158b2433 130b注:与对照组比较，a P 0.05，b P 0.01。2.2Api 对动情前期雌性大鼠 LH 及 FSH 分泌的影响在腺垂体培养液中加入 Api(104mol/L 106mol/L)时，3、5、7 组分别与对照组(1 组)比较，差异无统计学意义(P 0.05)。结果表明
20、Api(104mol/L 106mol/L)对原代培养的动情前期雌性大鼠腺垂体细胞 LH、FSH 的分泌量与对照组比较无明显减少。提示 Api 对动情前期雌性大鼠腺垂体细胞 LH、FSH的分泌无作用。3讨论哺乳类动物的卵巢周期称为动情周期，动情周期分为动情期、间情期 1、2 及动情前期。动情前期相当于卵巢排卵前这段时间，一般持续 10 12 h5，动情前期下丘脑、腺垂体及卵巢的功能活动比其他各期更积极6。体外培养细胞的激素含量也高于其他各期，更有利于实验结果的准确性及可比性。为了研究 Api 的作用及作用部位，实验采用下丘脑 腺垂体 卵巢轴三级组织细胞体外培养，并进行顺序灌流，模拟体内基础调节
21、方式。实验表明，在腺垂体培养细胞中加入Api，并进行顺序灌流，检测卵巢培养液中的 E2及 P 含量无明显变化，说明 Api 在腺垂体水平不发挥作用。至于第2 组第2d 出现 E2及 P 减少，可能是由于第 1 d 灌流后将部分 Api 加入到卵巢细胞中，引起 E2及 P 含量减少所致;在卵巢中加入Api 并进行顺序灌流，检测卵巢培养液中的 E2及 P 含量明显减少，且在 106mol/L 104mol/L 浓度范围内呈剂量依赖性，但无时间依赖性。提示 Api 在卵巢水平上发挥作用，抑制卵巢分泌 E2及 P，而对腺垂体组织分泌 LH 及 FSH 无明显抑制作用。通过本实验可证明抑制 E2及 P
22、的作用不是通过FSH 及 LH 而引起的。因此可以推测 Api 抑制 E2及 P 的作用机制以 Api 与雌激素受体结合7，直接或间接抑制芳香化酶或孕激素合成的关键酶的可能性较大。有关 Api 对生殖轴的作用及作用机制有待进一步研究。参考文献1 Hiremath SP，Badami S，Hunasagatta SK，et al Antifertility and hor-monal properites of flavones of Striga orobanchioidesJ Eur JPharmacol，2000，391(1 2):193 1972 于利，姜恩魁 芹菜素对大鼠睾丸间质细胞的
23、作用J 辽宁医学院学报，2007，28(5):7 173 Sugimoto H，Suzuki M，Takeuchi T，et al Effect of cell density ongrowth hormone release from cyclic AMP levels in and peptide-amidation activity of primary cultured rat anterior pituitary cellsJThe Journal of Endocrinology，1991，131(2):237 2444 程志平，顾世光，袁其晓，等 生殖医学实验技术M 北京:人民卫
24、生出版社，1993:77688中国公共卫生 2011 年 7 月第 27 卷第 7 期Chin J Public Health Jul 2011 Vol 27 No75 郝光荣，薛智谋，邵军石，等 实验动物学M 上海:第二军医大学出版社，1999:1176 Russell SH，Small CS，Stanley SA，et al The in vitro role of tumornecrosis factor-and interleukin-6 in the hypothalamic-pituitairy go-nadal axis J Neuroendocrinology，2001，13:
25、296 3017 Wang TT，SathyarnoorthyN，PhangJM Moleculareffectsofgenistein on estrogen receptor mediated path ways J Carcinogene-sis，1996，17:271 275收稿日期:2011-03-28(郭长胜编辑宋艳萍校对)*基金项目:国家自然科学基金(30972432)作者单位:第三军医大学劳动卫生学教研室，重庆 400038作者简介:王源(1973 )，男，四川南溪县人，实验师，博士，主要从事电磁辐射生物效应及防护研究。【实验研究】电磁辐射累积暴露对 Th1/Th2 细胞因子平
26、衡影响*摘要:目的探讨电磁辐射对 Th1/Th2 细胞因子平衡的影响。方法以平均功率密度 5 mW/cm2的微波辐照昆明小鼠，30 min/d，连续 30 d，采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、ELISA 法检测微波辐照后干扰素(INF-)、白细胞介素-4(IL-4)表达量的变化，分析微波辐照对 Th1/Th2 平衡的影响。结果5 mW/cm2微波累积辐照导致 INF-基因及蛋白表达水平增高，小鼠血清中 INF-含量在微波累积辐照第 8 d 为(430.29 41.95)pg/mL，达到峰值，增幅为 27.84%(P 0.05);微波累积辐照使 IL-4 的表达有降低的趋势，但与正常组
27、比较，差异无统计学意义(P 0.05)。结论平均功率密度为 5 mW/cm2的微波累积辐照导致昆明种小鼠 Th1/Th2 平衡向 Th1 方向偏移。关键词:电磁辐射;干扰素(INF-);白细胞介素-4(IL-4);Th1/Th2 平衡中图分类号:R 994.2文献标志码:A文章编号:1001-0580(2011)07-0887-02Effects of accumulative electromagnetic irradiation on Th1/Th2 cytokine balanceWANG Yuan，ZHANG Guang-bin，CHU Fang，et al Department of
28、 Occupational Health，the Third Military Medical University(Chongqing 400038，China)Abstract:ObjectiveTo observe the influence of electromagnetic irradiation on Th1/Th2 cytokine balance MethodsThe mice were continuously exposed to 5 mW/cm2electromagnetic wave 30 min/day for 30 days The expression leve
29、lsof interferon-gamma(INF-)and interleukin-4(IL-4)were detected with reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)The excursion of Th1/Th2 cytokine balance induced byelectromagnetic irradiation was analysed ResultsThe INF-expression level was inc
30、reased by 5 mW/cm2electromagneticirradiation At the 8th day of the electromagnetic irradiation，the INF-level in murine serum was increased by 27.84%compared with that of the sham group(P 0.05)The IL-4 expression level showed a decrease tendency after the electro-magnetic irradiation but the decrease
31、 was not significant compared with that of the sham(P 0.05)ConclusionThe5 mW/cm2electromagnetic irradiation can lead the deflection of Th1/Th2 cytokine balance to Th1Key words:electromagnetic irradiation;INF-;IL-4;Th1/Th2 balance电磁辐射对人体的影响是多方面的，其对免疫系统的影响是其重要效应之一。相关的流行病学调查发现，长期电磁辐射暴露导致多发性硬化(multiple
32、sclerosis，MS)、糖尿病、先兆流产及习惯性流产等疾病的发病率明显增高1。在这些疾病发生、发展过程中，免疫功能异常，免疫平衡紊乱是重要病因及病理学特征2 4。因此，明确电磁辐射暴露下机体免疫平衡变化特征，对阐明电磁辐射生物效应机制具有重要意义。本实验以平均功率密度为 5 mW/cm2的微波辐照昆明小鼠 30 min/d，连续 30 d，采用逆转录聚合酶链式反应(re-verse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)、酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测微波辐照后，干扰素
33、(interferon-gamma，INF-)、白细胞介素 4(interleukin-4，IL-4)表达量的变化，分析电磁辐射累积辐照对Th1/Th2 平衡的影响。1材料与方法1.1试剂与仪器微波源(第三军医大学劳动卫生教研室)，INF-、IL-4 ELISA 检测试剂盒(武汉博士德公司);IFN-、IL-4、-actin RT-PCR 引物(上海生工公司)。Tripure(瑞士Roche 公司);逆转录试剂盒(中国宝生物公司);Hot-start Taq酶(日本 TaKaRa 公司)。MJ PTC-100PCR 仪(美国 MJ 公司);酶标仪(奥地利 TECAN SUNRISE 公司);D
34、u-640 紫外分光光度计(美国 Beckman 公司);电泳仪、DOC Gel 2000 凝胶成像系统(美国 Bio-Rad 公司)。1.2实验动物及分组4 6 周龄昆明种小鼠(第三军医大学实验动物中心)，30 只，雌性，许可证号:SYXK(渝)2007 0002。随机分为对照组，电磁辐射 2、8、15、23、30 d 组，每组 5只。动物辐照在反射系数近似为零的微波辐照暗室内进行，动物置于可透射微波有机玻璃盒内，匀速旋转平台上接受辐照。辐照平均功率密度为 5 mW/cm2，辐照时间为 30 min/d，辐照环境温度(20 2)，湿度 50%70%。对照组小鼠，在不开波源情况下，置于同样辐照
35、环境中相应时间。于各时间点，摘眼球取血后，断颈处死，剥取脾脏组织，液氮中保存备用，分离各小鼠血清标本，70 冰柜中保存备用。1.3RT-PCR按 Tripure 试剂盒方法提取脾脏组织标本总RNA，紫外分光光度计检测 RNA 的质量和含量，RNA 电泳检测其完整性。逆转录生成 cDNA;IFN-引物上游 5-CATGAA AAT CCT GCA GAG CC-3;下游 5-GGA CAA TCT CTTCCC CAC CC-3;IL-4 上游 5-TCT TTC TCG AAT GTA CCAGG-3;下游 5-CAT GGT GGC TCA GTA CTA CG-3;-actin上游 5-GTG GGC CGC TCT AGG CAC CAA-3;下游5-CTC788中国公共卫生 2011 年 7 月第 27 卷第 7 期Chin J Public Health Jul 2011 Vol27 No7