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1、第犯卷第?期中旧种爹?辑?年?月烟草?基因的表达对外源基因在植物中表达的影响?摘要烟草?结合蛋白?可特异地作用于?增强子的激活序列?一?卜?一?，并表现为转录激活功能?为了研究?基因的表达对外源基因在植物中表达 的影响，将它置于维管束特异性启动子?下游，并与?启动子控制的报道基因串联成一种反式调控系统，构建了植物表达载体，同时，以?和?分别控制 的报道基因构建植物表达载体为阳性对照?通过农杆菌介导方法转化烟草和分子鉴定，证明报道基因存在于转化烟草基因组中，分别测定了不同转基因单株的?活性，结果表明?控制下的?的表达显著增强 了?控制下的报道基因表达，其?活性明显高于?或?单独调控报道基因的转化
2、植株，单株的最高?活性达到两个阳性对照的?倍以上?组织化学定位证实该 串联系统使?蛋白主要集中在维管束组织?这一研究结果为提高外源基因在转基因植株中的表达水平和外源基因的组织特异性表达创立了一个新模式?关键词基因表达与调控?结合蛋白?植物转化报道基因在植物基因工程研究 中，提高外源基因在植物细胞 中的转译水平十分重要，但是外源基因在转基因植物中的组织特异性表达也非常必要?因此，建立高效和组织特异性表达调控系统具有重要意义?反式作用 因子是位于不同染色体或同一染色体较远位置上的基因编码的蛋白质因子，含有一个?结合结构域，能与特定的?序列结合，也称?结合蛋 白?通过突变研究、顺式作用元件分析和对已
3、知因子的同源性分析?条途径，迄今已分离了许多种编码植物反式作用因子的基因?碱性亮氨酸拉链?，?蛋 白是真核转录因子和阻抑蛋 白中最保守的类型之一，在植物 中，?蛋 白控制种子贮藏基因表达、光形态发生和器官建立?植物?蛋 白有多种类型，根据它们的?结合专一性和氨基酸序列，植物?蛋 白可分为?个主要类型?偏爱。一?、偏爱?一?、对?一?和?一?具有相同的亲和力?属 于强专一性?一?结合蛋 白，是从烟草中分离到的反式作用 因子，由?一?一?收稿，?一?一?收修改稿?国家 自然科学基金?批准号?，?和?、国家“?”高技术计划基金?批准号?，?，?一?一?一?和 国家重点基础研究发展规划?批准号?资助项
4、目?联系人，?一?沮?中国科学?辑?第 犯 卷?个氨基酸残基组成，分子量?，有一个富含丝氨酸的?酸性激活区?区域，一个碱性区?结合区?和一个亮氨酸的拉链区?能与?启动子中?一了?含?重复序列 的?区，?一?序列结合，将?一?序列与?基因串联后，?使本应只在 叶中表达的基因同时在根部表达?利用小麦幼芽转录系统来测试?与?启动子的表达关系发现，?能将转录起始前复合物的形成提高?倍，而对转录起始频率和延伸速率没有影响?除?一?序列外，烟草?结合蛋 白?还可以作用 于烟脂碱合成酶基因的?一了序列卜?一?和章鱼碱合成酶基因的?、序列卜?一?，但对?一?序列激活效果最为显著?在酵母 中能够大幅度提高?启动
5、子的表达水平，高达数十倍?因此，研究它在转基因植物中对外源基因表达 的影响很有意义?用来自发根农杆菌的维管束特异性启动子?调控烟草?基因，以?启动子调控报道基因?，将两个表达结构 串联在一起，构建了植物表达载体，经农杆菌介导转化烟草，以期证明这种反式调控系统能够使报道基因高效和组织特异性表达?材料和方法?材料试 验 材 料有 烟草?占?品种?，菌种?人?人?。?和?质粒?和?由澳 大利亚?教授惠赠?本实验室用?和?构建了?，?由?教授惠赠?用?和?构建了?，?由澳大利亚李忠谊教授惠赠?用?和?构建了双元载体?不?，其中?购自于?介?公司?购自于?公司?限制性 内切酶、修饰酶购 自华美公司、?公
6、司和宝生物工程有限公司?植物表达载体构建所用重组质粒?由刀?巧?双酶切质粒?获得?基因的编码区的片段，插人到?的?双酶切位点而形成?尸?厂?酶切质粒?，获得含有?一?一?的表达结构，插人到?图?的?位点，获得植物表达载体?图?重组质粒?由刀?尸?双酶切质粒?获得?基因的编码区的片段和手?，再由刀?双酶切质粒?，去除?，保留?启动子，用?连接酶将两者结合而成?双酶切质粒?，获得含有?一?一?的表达结构，插入到?的?位点，形成植物表达载体?图?重组质粒?由?厂?三酶切质 粒?获 得 含 有?一?一?的表达结构，插人到?的尸、。?双酶切位点而形成?单酶切质粒?，获得含有?一?一?和?一?一?串联的反
7、式表达结构，?酶补平后，插人到?的?位点，形成具有反式调控结构的植物表达载体?图?第?期路子显等?烟草?基因的表达对外源基因在植物 中表达的影响一一牛习一挪舰卿瞬瓤酬咖翻翻昏一?即?一?一?片二三扮硼一礴绷绷黔奚一嚼硼皿卜代二扮一?塑?一?一?手?一?，一件习一?礴眺溯黔鳃胳?呻?卜?即?一?一?下?圳?一?仁丑一?卜州户?一呻翻鹦?巾?卜舰哪婀?嘟?即?一?一?或?口?一?一?黝劣子一?图?植物表达载体?结构示意图?的下?结构?下?的?结构?下?的不?结构?下?的?结构?一?示?一?启动子?一?示?启动子?一?示?启动子?卜?示新霉素磷酸转移酶基因作为植物选择标记?示?一葡萄糖醛酸酶基因?示
8、烟草?蛋白?基因?示烟脂碱合成酶基因终止子?和?分别示?左、右边界?烟草转化及再生植株的筛选将植 物 表达 载体?，?下?，?下?和?通过 电激法分别转化到农杆菌?内?利用改 良的叶盘法，通过农杆菌介导分别将它们转人烟草?用共培养基共培养、继代培养基继代和筛选培养基筛选各?次，再生培养基再生两次，把再生苗在含有卡那霉素?的生根培养基上生根，将根 系发育完全的卡那霉素抗性植株转移至温室生长?转化植株的?检测和?分析依文献?用改进的?法提取部分卡那霉素抗性植株的基因组?，将其分别溶解于?缓冲液，以提取的总?为模板，进行?基因部分片段的扩增?根据?等人?报道 的序列设计引物，以?端引物?一?碱基?一
9、?一?和?端引物?一?碱基的互补链?一?一?进行?检测?对部分转化植株进行了?分析，取?此基因组?用?酶切后 电泳分离并转移到?膜?上?预杂交和杂交均用?磷酸缓冲液，以?基因片段为探针，?一犯?探针标记按 随机引物标记试剂盒进行?杂交膜用?，?洗去背景后，一?进行放射 自显影?转基因烟草的?杂交分析采用异硫氰酸肌法提取烟草叶片总?“?溶解于适 当体积 的无?的?水 中?一般溶于?一?林?电泳和分光光度计检测?浓度?各取?林?不同植株的?进行?甲醛变性和?琼脂糖电泳分离后，经?转移至?尼龙膜?真空固定?，即可用于杂交?分别将?，?和?作为探针进行杂交，操作过程同?杂交?中国科学?辑?第?卷?卜葡
10、萄糖醛酸酶活性定且测定?一葡萄糖醛酸酶?一?，?活睦定量测定按?等人?川的方法进行，测定转基因烟草根茎叶中的?活性?取?植物材料，加?林?提取缓冲液在?中研磨成匀浆?离心后吸取?林?上清，加底物?一甲基伞形一?一?一葡萄糖醛酸?一?一?一?，?混匀，?保温?，用?一?一。?私?型荧 光分光光 度计测定?值?总蛋 白含量 按 标准?方法 测定?活 性以?一甲基伞形 酮?一?一?，?的纳摩尔数与总蛋 白含量及时间的比值?蛋 白?表示?蛋白的组织化学定位取转基因烟草幼根，用?反应液?缓 冲液，?，?，?，?铁氰化钾，?亚铁氰化钾，?一?，以及?一?浸泡材料，抽真空后，?温育?，用 固定液?无水乙醇?
11、冰乙酸?固定?，采用?乙醇逐级脱色脱水，然后，按照文献?的石蜡切片技术，将幼根经浸蜡和包埋后，在石蜡切片机上切成约?林?的切片，置于载玻片上，脱蜡后在显微镜下观察，并照相?结果?植物表达载体的构建及植物转化以?图?作为本实验的阴性对照，利用?一?一?表达结构构建了植物表达载体?图?和?一?一?表达结构构建了植物表达载体?图?，作为本实验的阳性对照?利用?一?和?一?串联的反式表达结构构建了植物表达载体?图?对构建的?个植物表达载体进行酶切鉴定，鉴定结果见图?利用酶切鉴定正确的植物表达载体分别电击转化根农杆菌?，按照文献?中的方法，将它们分别进行烟草转化、筛选以及转基因植株的再生和培养，根系发育
12、完全的抗性苗为转化植株?转化植株的?检测提取烟草再生植株的基因组?进行?扩增，以?和?为引物，检测?序列是否存在 于再生植株 中?结果表明?在转化?下?，?和?质粒成功 的转化植株提取的基因组?中，均可以扩增出?的特异带，大小与阳性质粒扩增带一致，而转化?和未转化烟草基因组?均未能扩增 出此条特异带?图?分别为不同植物表达载体转化植株的部分?结果?转化烟草植株的?分析选 取转 化烟草做?分析验证?结果，以?双酶切质粒?获得?长的?基因编码区片段作探针，以?一，?标记后杂交?选择?含量较高的?不?转化烟草?株，?手?和?不?转化烟草各?株，对基因组?和?消化的基因组?进行杂交，结果表明?无论是基
13、因组?还是?消化的基因组?，均能与?基因探针杂交?图?前者为?条杂交带，后者至少有?条杂交带，说明转基因烟草 中报道基因是寡拷贝的?第?期路子显等?烟草?基因的表达对外源基因在植物中表达 的影响?株 中的杂交信号是烟草 内源 的?基因表达 的结果?因此，反式调控系统提高了报道基因在转基因植物 中的转录水平?定?分析报道基因在转基因烟草中的表达利用转基因烟草无菌苗，参照?等人川的方法，取根系发育完全的烟草根、茎和一?旧日誉口芝一。日导碧照的匀口?、一?层 日?、?一?仙日?芝一。日?擎收?。?，门工已助日?芝一。日身裂明?口口图?不同转基因烟草的单株根、茎和叶的?活性?代?分别示根、茎、叶中?活
14、性?示?下?转基因的植株?示?转基因的植株?示?外?转基因的植株?示?转基因的植株?示野生型植株第?期路子显等?烟草?基因的表达对外源基因在植物 中表达 的影响人?用豌豆 沪?，?的核基质结合区?，?序列置于?控制的?一葡萄糖醛酸酶基因两侧，发现?可以使转基因烟草中报道基因的表达水平提高?倍，说明即使是?这样调控能力强 的组成型启动子，利用基因工程手段仍能增强其调控能力?等人?将马铃薯蛋 白酶抑制剂?基因?，尹?启动子和?一葡糖醛 酸酶基因?编码区的融合基因引人水稻，结果表 明，虽 然转基因水稻植株中?一?融合基因的表达水平相当低，但显示了系统损伤反应?将水稻肌动蛋白?基因?，?的第一内含子插
15、人州?一?结构的?非翻译区，经修饰的结构在转基因水稻植株中高水平表达?组织化学分析显示，这一高水平损伤诱导 的表达与叶片和根系的维管束组织联合在一起?瞬时表达试验表明，?一?内含子一?结构在其他几个单子叶植物的转化细胞和组织 中也活跃表达?因此，损伤诱导 的?启动子和水稻?内含子?联合起来可以在转基因单子 叶植物中用作外源基因的有效调 节基因?进一步说明通过基因工程 手段，能够修饰和改进表达强度较弱 的损伤诱导型启动子或组织特异性启动子，实现外源基因的高效表达?迄今为止，利用特异?结合蛋 白提高外源基因在受体植物 中的表达水平不但报道较少，而且一般用于提高外源基因的瞬时表达?等人?“将玉米?蛋
16、 白和高粱?相关蛋白的基因置于?启动子控制下，与玉米?一?启动子控制的报道基因共转化来 自马铃薯?叶片的原生质体，实验证明?两个?结合蛋白均能相 同程度激活玉米?一?启动子，提高报道基因的瞬时表达?本研究通过根农杆菌介导，用不 同的植物表达载体转化烟草?检测显示，在?，?下?和?不?转化的烟草中，均能扩增 出?基因片段的特异带?分析表明，在上述植物表达载体转化的植株 中，基因组?和?消化的基因组?均能与?基因片段探针杂交?而用仅含选择标记基因的植物表达载体?转化的植株和野生型烟草基因组?进行?及?分析结果均为 阴性，说明?基因已稳定整合到转基因烟草 中?通过?分析证明，在?探针杂交信号强度一致
17、的条件下，用?基因片段作为探针杂交时，含有反式调控系统的转基因植株的杂交信号强 于阳性对照?对转基因植株 中?的?杂交结果表明，含有反式调控系统的转基因植株 中?的?表达量 明显高于对照植株?上述结果说明，?表达量 的上升，造成了反式调控系统转基因植株中报告基因表达量 的提高?说明?控制的?基因的表达产物?蛋白能与?启动子 的?一?序列结合，从而激活 了下游报告基因的大量转录?转基因植株 的根、茎和叶的?活性测定结果与?杂交结果是一致的，无论单株?活性还是平均?活性，含有反式调控系统的转基因烟草的?活性均为最高，而含有?及?控制下 的?转基因烟草?活性均低于前者，说明在蛋白质的翻译水平上，大量
18、?被翻译成蛋 白质?对转基因植株组织化学定位分析表明，在?控制?的转基因烟草的根 中，?染色主要集 中在木质部导管周围的韧皮部 中，不仅蓝色较浅，而且在韧皮部以外的薄壁 细胞及表皮细胞中蓝色极浅，几乎不能看见?在含有?控制?的转基因烟草根中，?染色?中国科学?辑?第?卷分布均匀，蓝色较深?而含有反式调控系统的转基因烟草根 中，韧皮部细胞 中?染色最深，其周围薄壁细胞和外围表皮细胞染色也很深?这说明?控制 的?基因的表达激活了?启动子，实现了其下游报道基因在微管束优势表达?在植物生长发育过程中，不但许多 吸汁性害虫，如稻褐 飞虱、桃蚜和棉蚜等都在韧皮部取食，对农作物造成危害，而且它们还能传播病原
19、微生物，大量的植物病毒，如呼肠弧病毒和双生病毒等均在韧皮部相关的组织 中复制，阻止了植物有机物的正 常运输，给植物生长发育带来不 良影 响?本研究不但证明了反式调控系统 中?基因的表达显著提高下游?启动子控制的报道基因表达，而且证明外源蛋白主要集中在转基因植物的维管束组织，尤其韧皮部细胞 中?若将调控?基因的启动子换成其他组织特异性启动子、发育 阶段特异性启动子或诱导性启动子，将会赋于下游?启动子控制 的报道基因不同的表达模式?若将报道基因替换为抗病虫基因或其他目的基因，此系统也将行之有效，使这类基因高效和组织特异性表达?这说明我们已经成功地建立了一个优良的基因表达与调控系统，该系统不但在基因
20、表达与调控理论研究 中具有重要意义，而且在植物基因工程研究 中具有一定的应用前景?参考文献?，?一?，?，?一?，?，?，?，?，?一?，?，?，?，?，?，?一?，?，?，?，?，?一?，?，?，?，?，?，?一?李旭刚，路子显，冯德江，等?一个新的用 于植物转化的双元质粒载体的构建及应用，自然科学进展，?，川?高越峰，朱祯，肖桂芳，等?大豆?型胰蛋 白酶抑制剂基因的分离及其在抗虫植物基因工程 中的应用?植物学报，?，?科?，?，?，?，?，?，?，?一?一?一?，?，?，?，?一?，?，?李正理?石蜡制片技术?北京?科学出版社，?李旭刚，路子显，陈蕾，等?核基质结合区在转基因烟草中对外源基因表达的影响?植物学报，?，?礴。?，?，?，?，?，?，?，?一?，?，?，?一?一?，?，?，?，?，?一?一?，?，?一?勺一?气?，?巧?声?今?龟?二泪?内、?亡?，?司?