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1、蛋白质研究技术平台蛋白质研究技术平台梁洁开放实验室蛋白质相关技术l l蛋白质样品的制备l l蛋白质浓度的测定l l蛋白质免疫印迹（westernblot)l l蛋白质相互作用研究蛋白质样品制备l l单层贴壁细胞总蛋白的提取：单层贴壁细胞总蛋白的提取：(1)(1)收集细胞（收集细胞（1*101*106 6以上）以上）(2)(2)加入适量含蛋白酶抑制剂的裂解液加入适量含蛋白酶抑制剂的裂解液(3)(3)冰上裂解冰上裂解(4)4(4)4下下12000rpm12000rpm离心离心5min,5min,取上清，取上清，-20-20保存保存l l组织中总蛋白的提取组织中总蛋白的提取组织中总蛋白的提取组织中总
2、蛋白的提取(1)(1)取组织块（约取组织块（约0.1g)0.1g)剪碎剪碎,加液氮磨碎、匀浆、超声处理加液氮磨碎、匀浆、超声处理(2)4(2)4下下12000rpm12000rpm离心离心15min,15min,取上清，取上清，-20-20保存保存(3)(3)膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要超滤膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要超滤(4)(4)组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性 蛋白质样品制备试剂l lRIPARIPA裂裂裂裂解解解解配配配配方方方方：5050mMmMTris-HClTris-HClpH
3、pH7.47.4、150150mMmMNaClNaCl、11mMmMPMSFPMSF、11mMmMEDTAEDTA、1%1%TritonTritonx-100 x-100、1%1%脱脱氧氧胆酸钠、胆酸钠、0.1%SDS0.1%SDSl l蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶抑抑抑抑制制制制剂剂剂剂：11mMmMPMSF,PMSF,AprotininAprotinin1g/ml,1g/ml,LeupeptinLeupeptin5g/ml,5g/ml,pepestatinpepestatin 1g/ml,1g/ml,AEBSFAEBSF 50g/ml,50g/ml,BestatinBestatin10g/ml
4、,E-641g/ml10g/ml,E-641g/mll lPMSFPMSF 储储 存存 液液：溶溶 于于 异异 丙丙 醇醇 1.74mg/ml(10mmol/L)1.74mg/ml(10mmol/L)或或17.4mg/ml(100mmol/L),17.4mg/ml(100mmol/L),分分装装后后保保存存于于-20-20，使使用用时时稀稀释释至至1mmol/L1mmol/L，现用现加。，现用现加。产品名称产品名称 Western Western 及及及及 IPIP裂裂裂裂解液解液解液解液RIPARIPA裂解液（裂解液（裂解液（裂解液（强强强强）)RIPARIPA裂解液（中）裂解液（中）裂解液
5、（中）裂解液（中）RIPARIPA裂解液裂解液裂解液裂解液（弱）（弱）（弱）（弱）NP-40NP-40裂裂裂裂解液解液解液解液 SDSSDS裂解裂解裂解裂解液液液液产品价格产品价格138.00138.00元元168.00168.00元元168.00168.00元元168.00168.00元元168.00168.00元元168.00168.00元元有效裂解成分有效裂解成分 1%Triton1%TritonX-100X-1001%TritonX-100,1%TritonX-100,1%deoxycholate,1%deoxycholate,0.1%SDS0.1%SDS1%NP-40,0.5%1%N
6、P-40,0.5%deoxycholate,deoxycholate,0.1%SDS0.1%SDS1%NP-40,1%NP-40,0.25%0.25%deoxycholatedeoxycholate1%NP-401%NP-401%SDS1%SDS裂解强度裂解强度 温和温和 强强 中中 温和温和 温和温和 强强 对膜蛋白的裂解对膜蛋白的裂解一般一般很好很好较好较好一般一般一般一般很好很好对胞浆蛋白的裂解对胞浆蛋白的裂解很好很好很好很好很好很好很好很好很好很好很好很好对核蛋白的裂解对核蛋白的裂解较好较好很好很好较好较好较好较好较好较好很好很好胞浆磷酸化蛋白检测胞浆磷酸化蛋白检测很好很好很好很好很好
7、很好很好很好很好很好很好很好细胞核转录因子检测细胞核转录因子检测很好很好很好很好很好很好很好很好很好很好很好很好含蛋白酶抑制剂含蛋白酶抑制剂 是是 是是 是是 是是 是是 是是 含磷酸酯酶抑制剂含磷酸酯酶抑制剂是是 是是 是是 是是 是是 是是 各种细胞裂解液比较方法方法灵敏度灵敏度时间时间原理原理干扰物质干扰物质说明说明紫外吸收法紫外吸收法紫外吸收法紫外吸收法较为灵敏较为灵敏5050100100 g g，比，比色杯的最小测量色杯的最小测量体积为体积为0.1ml0.1ml快速快速5 51010分钟分钟蛋白质中的酪氨蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基酸和色氨酸残基在在280nm280nm处的光处的光吸
8、收吸收各种嘌吟和嘧啶；各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸各种核苷酸用于层析柱流出用于层析柱流出液的检测；不消液的检测；不消耗样品，测定后耗样品，测定后样品仍能回收利样品仍能回收利用用FolinFolin酚试剂酚试剂酚试剂酚试剂法（法（法（法（LowryLowry法）法）法）法）灵敏度高灵敏度高5 5 g g慢速慢速40406060分钟分钟双缩脲反应；磷双缩脲反应；磷钼酸磷钨酸试钼酸磷钨酸试剂被剂被TyrTyr和和PhePhe还还原原硫酸铵；硫酸铵；TrisTris缓冲缓冲液；甘氨酸；各液；甘氨酸；各种硫醇种硫醇耗费时间长；操耗费时间长；操作要严格计时；作要严格计时；颜色深浅随不同颜色深浅随不同蛋白质变
9、化蛋白质变化;标标准曲线不是严格准曲线不是严格的直线形式，且的直线形式，且专一性差专一性差考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法(Bradford(Bradford法法法法)灵敏度更高灵敏度更高1 15 5 g,g,最小最小测量体积测量体积0.1ml0.1ml快速快速5 51515分钟分钟考马斯亮蓝染考马斯亮蓝染料与蛋白质结料与蛋白质结合时，其合时，其l lmaxmax由由465nm465nm变为变为595nm595nm强碱性缓冲液；强碱性缓冲液；TritonX-100;TritonX-100;SDSSDS较好的方法；较好的方法；干扰物质少；干扰物质少；颜色稳定；颜色稳定；颜色深浅随
10、不颜色深浅随不同蛋白质变化同蛋白质变化;标准曲线有标准曲线有轻微的非线性轻微的非线性BCABCA法法法法灵敏度非常高灵敏度非常高2020200200 g,g,微量微量BCABCA为为 0.50.51010 g g较快速较快速,40,40分钟分钟内内在碱性环境下蛋在碱性环境下蛋白质与白质与Cu2+Cu2+络络合并将合并将Cu2+Cu2+还还原成原成Cu1+Cu1+螯合剂；略高浓螯合剂；略高浓度的还原剂度的还原剂抗干扰能力强，抗干扰能力强，蛋白不可逆的变蛋白不可逆的变性性蛋白质测定方法比较蛋白质浓度测定l lBradfordBradford法测定蛋白质浓度法测定蛋白质浓度法测定蛋白质浓度法测定蛋白
11、质浓度l l试剂试剂试剂试剂 G250 G250考马斯亮蓝溶液：考马斯亮蓝溶液：考马斯亮蓝溶液：考马斯亮蓝溶液：0.15 mol/L NaCl0.15 mol/L NaCl：1mg/ml 1mg/ml 牛血清白蛋白（牛血清白蛋白（牛血清白蛋白（牛血清白蛋白（BSABSA）l l标准曲线标准曲线标准曲线标准曲线 0g0g2.5g2.5g5.0g5.0g10.010.020.0g20.0g40.0g40.0g1mg/ml1mg/mlBSABSA2.5l2.5l5.0l5.0l10.0l10.0l20.0l20.0l40.0l40.0l0.15mol/L0.15mol/LNaClNaCl100l10
12、0l97.5l97.5l95.0l95.0l95.0l95.0l80.0l80.0l60.0l60.0lG250G250考马考马斯亮蓝溶液斯亮蓝溶液 1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1mlR2=0.999Bradford蛋白浓度测定试剂盒蛋白浓度测定试剂盒l l1.1.完全溶解蛋白标准品，取完全溶解蛋白标准品，取1010 l l稀释至稀释至稀释至稀释至100100 l l，使终浓，使终浓度为度为0.5mg/ml0.5mg/ml。可以用。可以用0.9%NaCl0.9%NaCl或或PBSPBS稀释标准品。稀释标准品。l l2.2.将将标准品标准品标准品标准品按按0
13、,1,2,4,8,12,16,200,1,2,4,8,12,16,20微升分别加到微升分别加到9696孔板孔板中，加标准品稀释液中，加标准品稀释液补足到补足到补足到补足到2020微升微升微升微升。l l3.3.加适当体积样品到加适当体积样品到9696孔板的样品孔中，加标准品稀释孔板的样品孔中，加标准品稀释液到液到2020微升。微升。l l4.4.各孔加入各孔加入200200微升微升G250G250染色液，室温放置染色液，室温放置3-53-5分钟。分钟。l l5.5.用酶标仪测定用酶标仪测定A595A595，或，或560-610nm560-610nm之间的其它波长的之间的其它波长的吸光度。吸光度
14、。l l6.6.根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。蛋白质核酸测定仪蛋白质核酸测定仪蛋白质免疫印迹(WB)原理proteinhttp:/id/protein/western-blot/蛋白质免疫印迹（WB)过程Figure1.SDS-PAGE蛋白质免疫印迹（WB)过程Figure2.WesternBlotSDS-PAGE所需仪器蛋白质电泳仪SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE)的有效分离范围丙烯酰胺浓度（丙烯酰胺浓度（%)%)线性分离范围（线性分离范围（kDa)kDa)151510-4310-43121212-6012-60101020-8020-807.
15、57.536-9436-94配胶所需材料试剂试剂试剂试剂1010分离胶分离胶分离胶分离胶（10ml10ml）4 4浓缩浓缩浓缩浓缩胶（胶（胶（胶（5ml5ml）超超纯纯水水4ml4ml3.6 ml3.6 ml3030Acr/BicAcr/Bic（2929：1 1）3.33ml3.33ml0.66ml0.66ml1.5 mol/L 1.5 mol/L TrisHClTrisHCl（pH8.8pH8.8）2.5ml2.5ml0.5 mol/L 0.5 mol/L TrisHClTrisHCl（pH6.8pH6.8）0.63ml0.63ml1010SDSSDS100 100 l l50 50 l l
16、10%AP10%AP（过过硫酸胺）硫酸胺）100 100 l l50 50 l lTEMEDTEMED5 5 l l5 5 l l蛋白质转印槽半干转印槽浸渍转印槽半干法转移槽使用说明膜滤纸胶滤纸正极负极Westernblot所需材料l l还原型还原型还原型还原型5SDS5SDS上样缓冲液上样缓冲液上样缓冲液上样缓冲液 l l55电泳液缓冲液电泳液缓冲液电泳液缓冲液电泳液缓冲液l l浸渍式转移缓冲液或半干式转移缓冲液浸渍式转移缓冲液或半干式转移缓冲液浸渍式转移缓冲液或半干式转移缓冲液浸渍式转移缓冲液或半干式转移缓冲液l lTBSTTBST或或PBSTPBST缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液l l封闭液（
17、抗体稀释液）封闭液（抗体稀释液）封闭液（抗体稀释液）封闭液（抗体稀释液）l l洗脱抗体缓冲液洗脱抗体缓冲液洗脱抗体缓冲液洗脱抗体缓冲液l l化学发光试剂（化学发光试剂（化学发光试剂（化学发光试剂（ECLECL）l l显影液和定影液显影液和定影液显影液和定影液显影液和定影液l l抗体抗体l lMarkWesternblot操作流程l l配胶：配胶：配胶：配胶：根据蛋白质分子量配制相应浓度的根据蛋白质分子量配制相应浓度的SDS-PAGESDS-PAGEl l电泳：电泳：电泳：电泳：以以5 5100g100g蛋白量上样，电泳至溴酚兰跑到底部。蛋白量上样，电泳至溴酚兰跑到底部。l l转印：转印：转印：
18、转印：剪下适当大小的剪下适当大小的PVDFPVDF膜，把胶铺在负极滤纸上，上膜，把胶铺在负极滤纸上，上面小心覆盖泡好的面小心覆盖泡好的PVDFPVDF膜，夹好后倒入电转缓冲液，加入膜，夹好后倒入电转缓冲液，加入冰格，冰格，100V100V转移转移1 1小时。小时。l l封闭：封闭：封闭：封闭：膜加封闭液（膜加封闭液（5 5脱脂牛奶脱脂牛奶inTBS-TinTBS-T）,室温室温1h.1h.l l抗体孵育：抗体孵育：抗体孵育：抗体孵育：加一抗（加一抗（1 1：10001000）4 4孵育过夜，孵育过夜，TBSTTBST洗三次，洗三次，3x10min3x10min；加二抗（；加二抗（1 1：200
19、0020000）室温室温1h1h，TBS-TTBS-T洗三次，洗三次，3x10min3x10min；l l显影：显影：显影：显影：膜上加同体积膜上加同体积ECLAECLA，B B液（液（100l/cm100l/cm2 2),),依照荧光强依照荧光强度而定曝光时间，显影度而定曝光时间，显影1 1、5 5、15min,15min,定影定影10min.10min.l l保存：保存：保存：保存：X-X-胶片干后，将分子量和加样顺序标记上，把日期，胶片干后，将分子量和加样顺序标记上，把日期，抗体名称，孵育时间写上。把膜保存在抗体名称，孵育时间写上。把膜保存在2020以备以后使用。以备以后使用。l l纹理
20、和脱尾现象：样品溶解不佳，加样前离心纹理和脱尾现象：样品溶解不佳，加样前离心纹理和脱尾现象：样品溶解不佳，加样前离心纹理和脱尾现象：样品溶解不佳，加样前离心l l蛋白带过宽：邻近泳道的蛋白加样量过多蛋白带过宽：邻近泳道的蛋白加样量过多蛋白带过宽：邻近泳道的蛋白加样量过多蛋白带过宽：邻近泳道的蛋白加样量过多l l指示剂成微笑符号：凝胶不均匀冷却指示剂成微笑符号：凝胶不均匀冷却指示剂成微笑符号：凝胶不均匀冷却指示剂成微笑符号：凝胶不均匀冷却l l指示剂成哭泣符号：凝胶和玻璃板组成指示剂成哭泣符号：凝胶和玻璃板组成指示剂成哭泣符号：凝胶和玻璃板组成指示剂成哭泣符号：凝胶和玻璃板组成“三明三明三明三明
21、治治治治”底部有气泡底部有气泡底部有气泡底部有气泡l l凝胶时间不对：凝胶太慢可能是凝胶时间不对：凝胶太慢可能是凝胶时间不对：凝胶太慢可能是凝胶时间不对：凝胶太慢可能是TEMEDTEMED、APSAPS剂量不足或失效；凝胶太快：剂量不足或失效；凝胶太快：剂量不足或失效；凝胶太快：剂量不足或失效；凝胶太快：TEMEDTEMED、APSAPS用用用用量过多，胶太硬易裂量过多，胶太硬易裂量过多，胶太硬易裂量过多，胶太硬易裂SDS-PAGE常见问题Westernblot常见问题1、技术问题（1）电泳（2）转膜2、抗体问题（特异性、浓度）3、蛋白质丰度4、荧光淬灭（蛋白量过大）1、背景过深2、抗体特异性
22、3、洗膜时间Westernblot常见问题Westernblot常见问题1、加样量2、ECL试剂3、曝光时间Westernblot常见问题1、蛋白质降解2、蛋白质分子量内参Westernblot常见问题4#：加样量过多Westernblot常见问题免疫组化和WesternBlot可以用同一种抗体吗？解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象
23、型表位由于受蛋白空间结和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果抗体识别的是蛋白上构限制，煮后变性会消失。如果抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是连续的几个氨基酸，也就是线性表位线性表位，那么这种抗体，那么这种抗体可同时用于免疫组化和可同时用于免疫组化和WesternWestern，而如果抗体识别，而如果抗体识别构象构象形表位形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。有注明此种抗体识别的氨基酸区间。l l在做WesternBlot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？l l解答：PVDF
24、膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。Westernblot常见问题l l不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？l l解答：可以考虑：转移缓冲液中加入解答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%20%甲醇（是甲醇（是指终浓度）指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考优化的转移缓冲液，可以参考蛋白质蛋白质技术手册技术手册)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和可增加蛋白质和PVDFPVDF膜的结合能力，甲醇可以防膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对
25、高分子量蛋白质可延长转移时止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS0.1%SDS，也是为了增，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NCNC膜（膜（0.20.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至如低至6 6。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压电流；增加转移时间。转移电压电流；增加转移时间。Westernblot常见问题l l蛋白分子量大小分别为21kd、28kd，用的是湿转，请问多大电流，多长时
26、间比较合适？l l解答：分子量比较小，最好是用干转，湿转效率太高，易转过了。干转的话，用2.5A/cm2，30min就应该够了。湿转，按照bio-rad的说明，用100mA，也得要半个多小时吧。Westernblot常见问题l l怎样才能把胶跑的非常漂亮，泳道和怎样才能把胶跑的非常漂亮，泳道和bandband都能很都能很直直?l l影响跑胶跑的质量，有以下几个因素：影响跑胶跑的质量，有以下几个因素：1 1、电压，、电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v80v，分离胶，分离胶100v100v就能跑得很好。就能跑得很好。2 2、胶的均匀度，胶越均匀，条带、胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀，越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释下层的分离胶。轻地加上去，避免稀释下层的分离胶。Westernblot常见问题Westernblot结果如何分析目的蛋白110kd